연골 재생을 촉진하기 위한 층별 야누스 베이스 나노매트릭스의 제작 및 특성 분석
2022년 7월 6일
이 프로토콜은 야누스 염기 나노 튜브 (JBNts), 마트린 -3 및 형질 전환 성장 인자 베타 -1 (TGF-β1)을 순차적으로 추가하여 층별 야누스 염기 나노 매트릭스 (JBNm) 스캐 폴드의 조립을 설명합니다. JBNm은 제작되고 특성화되었습니다. 또한 우수한 생리활성을 나타내어 부착, 증식 및 분화와 같은 세포 기능을 촉진했습니다.
이 프로토콜은 분자 수준에서 JBNm을 층별로 조립하고 특성화하는 방법을 보여줍니다. JBNm은 TGF-B1을 캡슐화하고 주변 조직에서의 방출을 방지하여 국소 연골 생성을 촉진합니다. JBNm의 형성은 표준화되어 향후 응용 프로그램을 위해 다양한 JBN을 형성 할 수 있습니다.
층별 고유한 구조는 성장 인자 캡슐화를 허용하여 꾸준한 국소화 방출을 생성하여 비대를 피하고 성장을 유지합니다. JBNm은 불규칙한 모양의 골절이나 충치와 같은 다양한 시나리오에 사용할 수 있는 주사성으로 인해 제한된 위치 내에서 연골 조직 재생을 위한 항상성 미세 환경을 제공합니다. 시작하려면 물에 현탁 된 밀리리터 TGF-B1 당 1 밀리그램 8 마이크로 리터를 물에 현탁 된 1 밀리리터 Matrilin-3 당 32 마이크로 리터에 첨가하십시오.
이러한 단백질의 적절한 혼합을 보장하는 피펫. 밀리리터당 1 밀리그램의 80 마이크로 리터를 추가하십시오. 야누스베이스 나노 튜브 또는 JBNts를 물에 현탁하여 TGF-B1, Matrilin-3 용액에 첨가합니다.
적절한 혼합을 위해 반복적으로 피펫팅하십시오. JBNt 그룹의 경우 밀리리터당 1밀리그램의 5마이크로리터, 50마이크로리터의 물에 JBNts를 추가하여 밀리리터당 90.9마이크로그램 용액을 만듭니다. Matrilin-3 그룹의 경우 밀리리터 당 10 마이크로 그램의 40 마이크로 리터 Matrilin-3을 15 마이크로 리터의 물에 추가하여 밀리리터 당 7.3 마이크로 그램의 용액을 만듭니다.
TGF-B1 그룹의 경우 밀리리터당 10마이크로리터의 TGF-B1을 물 45마이크로리터에 10마이크로리터씩 추가하여 밀리리터당 1.8마이크로그램의 용액을 만듭니다. 야누스베이스 나노 매트릭스 또는 JBNm 그룹의 경우 밀리리터 당 10 마이크로 그램의 40 마이크로 리터, 밀리리터 당 10 마이크로 그램의 Matrilin-3 내지 10 마이크로 리터 TGF-B1을 추가하십시오. 적절한 혼합을 보장하기 위해 교반하십시오.
그런 다음 JBNts 밀리리터당 1밀리그램의 5마이크로리터를 용액에 첨가하고 반복적으로 피펫팅하여 샘플을 혼합합니다. 분광 광도계를 사용하여 각 그룹의 흡수 스펙트럼을 측정합니다. 제조업체의 지침에 따라 단백질 라벨링 키트를 사용하여 TGF-B1에 라벨을 붙입니다.
TGF-B1이라고 표시된 밀리리터당 20마이크로그램 20마이크로리터를 물 25마이크로리터에 추가하여 밀리리터당 8.9마이크로그램의 테스트 용액을 만듭니다. 별도의 라벨링 키트를 사용하여 Matrilin-3에 라벨을 붙입니다. 20 마이크로 리터의 물 25 마이크로 리터에 Matrilin-3 라벨이 붙은 밀리리터 당 80 마이크로 그램의 물을 추가하여 밀리리터 당 36 마이크로 그램의 테스트 용액을 만듭니다.
20 마이크로 리터의 밀리리터 당 80 마이크로 그램의 매트 릴린 -3을 TGF-B1로 표지 된 밀리리터 당 20 마이크로 그램의 20 마이크로 리터 및 5 마이크로 리터의 물과 혼합하여 표지 된 TGF-B1, Matrilin-3 화합물을 만듭니다. 혼합물을 여러 번 피펫팅하여 혼합하십시오. 40 마이크로 리터의 물에 밀리리터 JBNts 당 1 밀리그램의 5 마이크로 리터를 첨가하면 밀리리터 당 111 마이크로 그램의 용액이됩니다.
그런 다음 표지 된 TGF-B1, Matrilin-3 용액에 밀리리터 JBNts 당 1 밀리그램의 5 마이크로 리터를 첨가하고 반복적으로 피펫하여 화합물을 혼합합니다. 각 샘플 그룹을 검정 384 웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 플레이트를 다중 모드 마이크로플레이트 리더에 로드하고 제조업체의 프로토콜에 따라 488 및 555나노미터의 여기 파장에서 측정합니다.
생리 학적 조건 하에서, Matrilin-3의 제타 전위 스펙트럼은 등전점으로 인해 음전하를 띤다. TGF-B1을 마트릴린-3에 첨가한 후, TGF-B1 마트릴린-3 화합물의 제타 전위는 거의 중성 값으로 증가하였다. JBNm의 제타 전위는 세 그룹 중 가장 높았습니다.
UV 가시 흡수 스펙트럼은 JBNm의 층 내부 구조, 라이신 측쇄의 방향족 고리 및 JBNts가 각각 220 및 280 나노 미터에서 흡수 피크에 기여한 계층 적 층의 형성을 확인했습니다. TEM은 JBNts 및 JBNm의 형태를 특성화하는 데 사용되었습니다. 단백질과 결합한 후, JBNm의 두꺼운 다발이 스캐폴드 구조를 형성하는 것으로 관찰되었다.
형광 현미경은 층 별 구조의 존재를 확인하고 JBNm의 단면을 입증했습니다. 적색 형광 Matrilin-3을 표지 한 후 JBNt 번들을 감싸고 JBNm의 외부 층을 형성하고 녹색 형광 TGF-B1은 내부 층을 형성했습니다. 형광 공명 에너지 전달은 표지 된 TGF-B1 그룹의 경우 520 나노 미터, Matrilin-3 그룹의 경우 570 나노 미터에서 방출 피크를 표시했습니다.
HMSC의 부착 및 세포 증식에 대한 JBNm의 효과가 조사되었습니다. JBNm은 HMSC가 자체와 함께 클러스터링된 반면 JBNt에 부착된 세포는 더 적었습니다. JBNm에서 세포의 정렬과 세포의 크기는 JBNts가 세포 접착에 중요한 역할을하는 반면 단백질은 세포 접착의 친화력을 증가 시킨다는 것을 입증했습니다.
세포 배양 첫날 후, JBNm 및 TGF-B1 그룹은 다른 그룹에 비해 상당한 세포 증식을 보였다. 세포 구조 지속 기간이 3일 및 5일로 증가되었을 때, JBNm 및 TGF-B1 그룹은 훨씬 더 증가된 세포 증식을 입증하였다. JBNm을 형광 라벨링할 때 JBNts를 추가하기 전에 TGF-B1 및 Matrilin-3을 개별적으로 라벨링하고 혼합하여 레이어 구조를 적절하게 형성할 수 있도록 하는 것이 중요합니다.
스캐폴드의 추가 평가는 치료 치료에 어떻게 효과적인지에 대한 이해를 제공할 수 있습니다. 보다 구체적으로, 고처리량 증식 분석은, 시험관내에서, 그리고 나중에 생체내에서 최적의 투여량을 결정할 수 있다. 이 새로운 NanoMatriX 생성을 통해 연구원들은 나노 물질 기반 주사 가능한 스캐폴드를 활용하여 연골을 재생할 수 있습니다.
이러한 폴리 모방 접근법은 향상된 안드로제네시스 및 카운터 부위 증식을 가능하게 한다.
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개요
본 프로토콜은 층별 적층 방식(layer-by-layer)의 야누스 기저 나노 매트릭스(Janus base nano-matrix, JBNm) 스캐폴드의 조립 및 특성 분석 방법을 설명합니다. JBNm은 TGF-β1을 캡슐화하여 국소적인 연골 분화를 촉진하고 연골 조직 재생을 위한 항상성 미세환경을 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 생체 재료
- 조직 공학
- 재생 의학
배경
- 스캐폴드 조립에 Janus 기반 나노튜브(JBNts)가 활용됩니다.
- TGF-β1은 세포 기능 촉진에 매우 중요합니다.
- JBNm 구조를 통해 성장 인자의 방출을 조절할 수 있습니다.
- JBNm의 주입 가능성은 불규칙한 모양의 결손 부위에도 적용을 가능하게 합니다.
연구 목적
- 연골 조직 재생을 지원하는 스캐폴드를 제작함.
- 다양한 응용 분야를 위해 JBNm 형성을 표준화함.
- 지속적인 방출을 위해 성장 인자를 캡슐화하고 비대증을 방지함.
사용된 방법
- JBNm 형성을 위한 TGF-β1과 Matrilin-3의 순차적 첨가.
- 분자 수준에서의 스캐폴드 특성 분석.
- 세포 부착 및 증식과 관련된 생체 활성 평가.
- 실제 응용을 위한 스캐폴드의 주입 가능성 평가.
주요 결과
- JBNm은 우수한 생체 활성을 나타내어 세포 기능을 촉진하였다.
- TGF-β1의 국소적 방출을 구현하여 연골 분화를 향상시켰다.
- 스캐폴드는 조직 재생을 위한 항상성 환경을 유지하였다.
- 표준화된 형성 공정을 통해 조직 공학 분야의 다양한 응용이 가능하다.
결론
- 층별 적층법(layer-by-layer)으로 제작된 JBNm 스캐폴드는 연골 재생에 효과적입니다.
- 성장 인자의 캡슐화는 국소적 조직 수복에 유익합니다.
- 이 방법은 다양한 임상 상황에 맞춰 조정하여 적용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
층별 적층 방식의 Janus 기반 나노 매트릭스(JBNm)는 성장 인자의 정밀한 국소화와 지속적인 미세환경 제어를 가능하게 하여, 재생 의학 및 조직 공학의 핵심 과제를 해결합니다. 이 플랫폼은 초기 단계의 바이오 소재 스크리닝에서 예측 신뢰도를 높여주며, 표적 외 효과와 비대증을 최소화함으로써 중개 연구의 진전 과정에서 위험 요소를 줄여줍니다. 또한, 표준화된 조립 방식과 주입 가능성 덕분에 다양한 전임상 연골 수복 모델에 재사용 가능한 역량으로 활용될 수 있습니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 제어된 미세환경에서 성장 인자에 의해 매개되는 연골 형성 과정을 조사할 수 있습니다.
- 제한된 스캐폴드 내에서 TGF-β1의 효과를 분리함으로써 기전적 리스크 제거를 지원합니다.
- 조직 재생을 위한 바이오 소재와 단백질 간 상호작용의 기능적 검증을 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 정량적 세포 부착 및 증식 분석을 위한 표준화되고 재현 가능한 스캐폴드를 제공합니다.
- 스캐폴드 조성 및 성장 인자 캡슐화에 대한 고처리량 평가를 가능하게 합니다.
- 생체 재료 후보군의 비교 평가를 위해 일관되고 정량화 가능한 결과물을 제공합니다.
중개 및 전임상 연구
- in vitro 및 in vivo에서 국소적인 연골 재생을 지원함으로써 질환 관련 모델과의 일관성을 유지합니다.
- 불규칙한 결손 부위에 적용 가능한 주입식 및 적응형 스캐폴드 형태를 통해 중개 연구의 연속성을 유지합니다.
- 비대증 및 오프타겟 효과의 위험을 줄여, 위험 조정 기반의 발전적 의사결정을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
JBNm 플랫폼은 초기 발견부터 전임상 검증까지 통합하여 연골 재생 워크플로우에서의 가설 검증, 분석법 개발 및 중개 연구를 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 공학적으로 설계된 미세환경에서 성장 인자 효과에 대한 가설 기반 평가를 지원합니다.
- 스크리닝: 세포 접착 및 증식에 대해 재현 가능하고 정량적인 판독 값을 제공합니다.
- 분석: 지지체 특성 분석을 위한 UV-Vis, 형광 및 제타 전위 측정이 가능합니다.
- 중개 연구: in vitro 스크리닝에서 in vivo 연골 재생 모델까지의 연속성을 촉진합니다.
- 기업적 재사용: 표준화된 조립 방식을 통해 다양한 생체 재료 및 조직 공학 프로그램에 맞게 조정하여 사용할 수 있습니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 스캐폴드 매개 조직 재생 및 표적 검증에 대한 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 재현 가능한 스캐폴드 제작 및 분석을 위한 표준화되고 확장 가능한 프로토콜을 제공합니다.
- 전략적 가치: 오프타겟 성장 인자 효과를 최소화함으로써 정보에 기반한 진행/중단(go/no-go) 결정이 가능하게 합니다.
- 포트폴리오 영향: 재생 의학 파이프라인을 위한 생체 재료 후보군의 위험 조정 우선순위 선정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 생체 재료 조립, 단백질 표지 및 스캐폴드 특성 분석 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 분광 광도법, 형광 현미경 및 TEM 인프라 사용 권한이 필요합니다.
- 재현 가능한 스캐폴드 제조 및 분석을 위해 팀 간의 표준화가 요구됩니다.
- 다양한 모델 시스템에 적용 가능하지만, 특정 조직 표적에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 실질적인 제한 사항으로는 구성 성분 비율의 정밀한 제어와 표지 효율성이 포함됩니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Fabrication of the Janus Base Nano-Matrix (JBNm), Composed of Janus Base Nanotube (JBNt)/Matn1/Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1)
1:41
Observation of Specimens with Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Spectroscopy
3:12
Absorption Spectra Measurement of Fluorescent-Labeled Proteins
5:08
Results: Layer-By-Layer Assembly of Janus Base Nano-Matrix Structure Scaffold for a Cartilage Tissue Construct
8:01
Conclusion
