CUBIC 전체 신장 3차원 염색
2022년 7월 18일
본 프로토콜은 3차원(3D) 신장 영상을 위한 조직 투명화 방법 및 전체-마운트 면역형광 염색을 기술한다. 이 기술은 신장 병리학에서 거시적 관점을 제공하여 새로운 생물학적 발견으로 이어질 수 있습니다.
이 프로토콜을 사용하면 전체 신장에서 3차원 구조를 시각화할 수 있으며, 이는 거시적 관점을 제공하여 신장 연구에서 혁신적인 발견으로 이어질 수 있습니다. 전체 마운트 장기 염색은 항체 침투가 어렵기 때문에 어렵습니다. 이 프로토콜은 항체에 의한 신장의 고품질 전체 마운트 염색을 입증했습니다.
시작하려면 관류 고정 및 신장 샘플링 직후 신장을 섭씨 4도에서 16 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 담그어 침지 고정을 수행하십시오. PBS를 사용하여 각각 2 시간 동안 세 번 씻으십시오. 고정 된 신장을 14 밀리리터의 둥근 바닥 튜브에 50 % CUBIC-L의 7mm에 담그고 실온에서 부드럽게 흔들어 탈색 및 탈지방 과정을 수행하십시오.
6 시간 후, 신장을 14mm 둥근 바닥 튜브에 7 밀리리터의 CUBIC-L에 담그고 섭씨 37도에서 5 일 동안 부드럽게 흔 듭니다. CUBIC-L을 매일 새로 고칩니다. 탈색 및 탈지화가 완료되면 디스펜싱 스푼을 사용하여 샘플 취급을 하고 실온에서 2시간 동안 PBS로 신장을 세 번 세척합니다.
염색 완충액에 희석된 1차 항체에서 지방화된 신장을 면역염색하고, 섭씨 37도의 인큐베이터 쉐이커에서 7일 동안 부드럽게 흔들었다. 그런 다음 PBST라고도 하는 PBS의 0.5% 트리톤 X-100으로 신장을 실온에서 하루 동안 세척합니다. 2 차 항체 염색의 경우, 어두운 곳에서 염색 완충액에서 2 차 항체로 신장을 섭씨 37도에서 7 일 동안 부드럽게 흔들어 치료하십시오.
PBST 세척으로 염색을 실온에서 하루 동안 고정한다. 고정 후 신장을 PB의 1 % 포름 알데히드에 3 시간 동안 담그고 실온에서 6 시간 동안 PBS로 씻습니다. 14 밀리리터의 둥근 바닥 튜브에 7 밀리리터의 50 % CUBIC-R +에 신장을 담그고 하루 동안 흔들어 굴절률 일치를 수행 한 다음 7 밀리리터의 CUBIC-R +로 2 일 동안 실온에서 흔들어 치료합니다.
면역 염색 방법의 도움으로 전체 신장의 교감 신경과 동맥을 3D 신장 영상으로 시각화했습니다. 또한, 비정상적인 신장 교감 신경은 허혈 재관류 손상 후에 시각화되었다. 이 프로토콜은 또한 전체 비장에서 교감 신경을 시각화하는 것을 용이하게했습니다.
3차원 면역형광염색을 위한 데이터 정량화 과정이 여기에 표시됩니다. 또한, 덕트, 근위 세뇨관의 S1 세그먼트 및 사구체를 수집하여 전체 신장에서 성공적으로 시각화했습니다. 당뇨병성 신장 질환의 초기 단계에서 약물 투여로 인한 억제된 사구체 비대도 3D 영상으로 시각화되었습니다.
이 프로토콜은 전체 신장 내의 특정 분자를 표시 할 수 있습니다. 따라서 연구자들은 혈관 구조의 구조 변화를 분석하거나 신장 조직에서 드문 사건을 발견 할 수 있습니다.
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개요
본 프로토콜은 전체 신장의 3차원 구조 시각화를 가능하게 하여, 신장 연구의 혁신적인 발견으로 이어질 수 있는 거시적 관점을 제공합니다. 이 방법에는 이미지 품질 향상을 위한 조직 투명화 및 홀마운트 면역형광 염색 과정이 포함되어 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생물학
- 병리학
배경
- 항체 침투의 어려움으로 인해 전체 장기 염색(Whole-mount organ staining)은 매우 까다롭습니다.
- 정확한 3D 이미징을 위해서는 고품질의 염색이 필수적입니다.
- 본 프로토콜은 신장 이미징에서 발생하는 일반적인 문제들을 해결합니다.
- 거시적 관점의 분석은 새로운 생물학적 통찰력을 제공할 수 있습니다.
연구 목적
- 신장의 3D 이미징을 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발하기 위함입니다.
- 신장 구조의 시각화를 향상시키기 위함입니다.
- 신장 병리학의 혁신적인 발견을 촉진하기 위함입니다.
사용된 방법
- 4°C에서 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 16시간 동안 침전 고정합니다.
- PBS로 2시간씩 3회 세척합니다.
- 50% CUBIC-L을 사용하여 탈색 및 탈지 처리를 수행합니다.
- 탈지 과정 동안 상온에서 부드럽게 흔들어 줍니다.
주요 결과
- 신장의 고품질 전체 마운트 염색을 입증함.
- 항체 침투력을 향상시킴.
- 신장 구조의 명확한 3D 시각화를 제공함.
- 신장 병리학의 더 나은 이해를 위해 거시적 관점을 가능하게 함.
결론
- 본 프로토콜은 신장 이미징 기술을 성공적으로 향상시킵니다.
- 이는 신장 연구 분야에서 새로운 발견을 위한 길을 열어줍니다.
- 향후 연구에서는 추가적인 통찰을 얻기 위해 이 방법을 기반으로 발전시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
CUBIC을 이용한 신장 전체의 3차원 염색은 기존 병리학의 한계를 극복하여 신장 미세구조의 포괄적인 시각화를 가능하게 합니다. 이러한 기능은 혈관, 세뇨관, 사구체 및 교감신경의 고해상도 매핑을 지원하여, 신장 질환 연구의 조기 발견과 기전적 리스크 감소를 위한 중요한 통찰력을 제공합니다. 본 방법은 전임상 포트폴리오 추진 과정의 주요 변곡점에서 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 단일 세포 해상도로 신장 구조 및 세포 네트워크의 조사가 가능합니다.
- 손상 또는 중재 후의 구조적 변화를 시각화하여 생물학적 리스크 감소를 지원합니다.
- 교감신경과 사구체의 포괄적인 매핑을 통해 기능적 표적 검증을 용이하게 합니다.
- 신장 질환 표적 우선순위 선정에 대한 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
스크리닝 및 어세이 개발
- 후속 이미징 및 정량화 워크플로우를 위해 검증된 3D 생물학적 시스템을 준비합니다.
- 연구 전반에서 재현 가능하고 정량적인 결과를 얻기 위해 전기관 염색을 표준화합니다.
- 신장 조직 내 희귀 사건 및 구조적 변화의 확장 가능한 이미징을 가능하게 합니다.
- 신장 미세해부학적 구조에 미치는 화합물 효과의 신뢰성 있는 평가를 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 3D 이미징 결과물을 사구체종대와 같은 질환 관련 바이오마커와 정렬합니다.
- 중재 효과를 시각화함으로써 발견 단계부터 전임상 검증까지의 연속성을 제공합니다.
- 포괄적인 조직 분석을 바탕으로 위험 조정된 진행 결정을 가능하게 합니다.
- 중개 신장 연구 프로그램에 대해 예측 가능한 리스크 감소를 실현합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 전신 신장 3D 염색 프로토콜은 발견에서 전임상 단계로 이어지는 연속 과정에 통합되어, 신장 연구의 가설 검증, 타겟 확인 및 중개 바이오마커 정렬을 지원합니다.
- 발견 생물학: 신장 구조와 손상 반응을 매핑하여 가설 검증 및 경로 규명을 촉진합니다.
- 스크리닝: 실험 조건의 정량적 비교를 위해 분석에 즉시 활용 가능한 재현성 있는 3D 이미징 결과물을 제공합니다.
- 분석: 구조적 변화의 측정과 정량화를 가능하게 하여 견고한 통계 분석을 지원합니다.
- 중개 연구: 이미징 결과와 질환 모델 및 초기 바이오마커 식별을 연결합니다.
- 기업적 재활용: 신장 및 관련 조직 연구 전반에서 활용 가능한 전장기(whole-organ) 이미징 재사용 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 신장 타겟 검증의 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 표준화되고 확장 가능하며 재현 가능한 3D 이미징 워크플로우를 제공합니다.
- 전략적 가치: 포괄적인 조직 분석을 가능하게 하여 go/no-go 결정 및 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 신장 질환 프로그램의 위험 조정 우선순위 설정 및 추진을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 조직 투명화, 면역 염색 및 3D 이미지 분석에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 고성능 이미징 장비 및 컴퓨터 분석 도구의 사용 권한이 필요합니다.
- 재현성과 데이터 비교 가능성을 위해 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 다양한 장기 시스템이나 항체 패널에 따라 최적화 과정이 필요할 수 있습니다.
- 전체 장기 이미징의 경우 항체 침투 및 염색 시간이 실질적인 제약 요인이 됩니다.
