Name: CUBIC 전체 신장 3차원 염색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 31 s
Description: 배우세요 CUBIC 조직 투명화와 전체 장기 면역형광 염색을 이용한 신장 3차원 구조 시각화 방법입니다. 이 기술은 항체 침투를 개선하여 신장 병리학 연구에서 혁신적인 발견을 가능하게 합니다.

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이 연구의 일부는 우에다 히로키 교수(도쿄대학), 스사키 에츠오 A. 교수(준텐도 대학), 다나카 테츠히로 교수(도호쿠 대학), 후카가와 마사후미 교수, 와다 타케히코 박사, 고마바 히로타카 박사(도카이 대학)와의 협력을 통해 수행되었습니다.

모든 실험은 도쿄 대학 기관 검토위원회의 승인을 받았습니다. 모든 동물 절차는 국립 보건원 지침에 따라 수행되었습니다. 8주령의 수컷 C57BL/6NJcl 마우스를 본 연구에 사용하였다. 마우스는 상업적 출처로부터 수득하였다( 재료 표 참조).
1. 동물 준비 및 신장 고정
<ol><li>아래 단계에 따라 관류 고정을 수행하십시오.<ol><li>이소플루란(3%, 2.0L/min)을 흡입하고 메데토미딘 염산염(0.3mg/kg), 부토르파놀 타르트레이트(5mg/kg) 및 미다졸람(4mg/kg)을 복강내 투여하여 마우스를 마취시킵니다( 재료 표 참조).</li>
		<li>동물을 20mL의 PBS(pH 7.4) 및 30mL의 4% PFA로 인산염 완충액(PB)으로 관류시킨다(12).</li>
	</ol></li>
	<li>관류 고정 직후 침지 고정을 수행하고 신장 샘플링9.<ol><li>신장을 4°C에서 4% PFA에 16시간 더 담근 다음 PBS로 2시간(3회)9 동안 세척합니다(그림 1). 주의 : 포름 알데히드와 파라 포름 알데히드는 독성 자극제입니다. 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 흄 후드에서 시약을 취급하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 탈색 및 탈색
<ol><li>이전에 발표 된 보고서 4,8,9에 따라 10wt %의 Triton X-100과 10wt %의 N- 부틸 디 에탄올 아민 (재료 표 참조)으로 구성된 탈색 및 탈색을 위해 CUBIC-L을 준비하십시오.</li>
	<li>아래 단계에 따라 CUBIC-L에 의한 탈색 및 탈색을 수행하십시오.<ol><li>고정된 신장을 14mL 둥근 바닥 튜브(재료 표 참조)에 넣고 7mL의 50%(v/v) CUBIC-L(물과 CUBIC-L의 1:1 혼합물)에 담그고 실온에서 6시간 동안 부드럽게 흔듭니다(그림 2A). 그런 다음 14mL 둥근 바닥 튜브에 7mL의 CUBIC-L에 담그고 37°C에서 5일 동안 부드럽게 흔듭니다.</li>
		<li>이 과정에서 매일 CUBIC-L을 새로 고칩니다. 탈색 및 탈색 과정 후 실온에서 PBS로 신장을 2시간(3회)9 세척합니다(그림 1). 시료 취급을 위해 분주 스푼을 사용하십시오(그림 2B).</li>
	</ol></li>
</ol>3. 전체 마운트 면역 형광 염색
<ol><li>염색 완충액을 준비한다.<ol><li>PBS에 0.5%(v/v) Triton X-100, 0.5% 카제인, 0.05% 아지드화나트륨9를 혼합하여 1차 항체용 염색 완충액을 준비합니다.</li>
		<li>PBS에 0.5%(v/v) Triton X-100, 0.1% 카제인, 0.05% 아지드화나트륨9를 혼합하여 2차 항체용 염색 완충액을 준비합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>1 차 항체로 염색을 수행하십시오.<ol><li>37°C에서 염색 완충액에서 1차 항체(1:100 또는 1:200, 재료 표 참조)로 지질된 신장을 면역염색하고 7일 동안 부드럽게 흔들었다. 참고: 한 신장에 필요한 염색 완충액의 양은 500-600 μL입니다(그림 2C).</li>
		<li>신장을 PBS(PBST)의 0.5%(v/v) 트리톤 X-100으로 실온에서1일 동안 세척합니다(그림 1).</li>
	</ol></li>
	<li>2 차 항체로 염색을 수행하십시오.<ol><li>37°C에서 염색 완충액에서 2차 항체(1:100 또는 1:200, 재료 표 참조)로 신장을 면역염색하고 7일 동안 부드럽게 흔들었다. 실온에서 PBST로 신장을1일 동안 세척합니다(그림 1).</li>
		<li>고정후 9, 신장을 PB의 1% 포름알데히드(37% 포름알데히드와 PB의 혼합물 1:36)에 3시간 동안 담그고 실온에서 PBS로 6시간 동안 세척합니다(그림 1).</li>
	</ol></li>
</ol>4. 굴절률 (RI) 일치
<ol><li>큐빅-R+를 준비합니다.<ol><li>45wt%의 2,3-디메틸-1-페닐-5-피라졸론/안티피린과 30wt%의 니코틴아미드를 혼합하여 CUBIC-R을 준비합니다( 재료 표 참조).</li>
		<li>이전에 발표 된 보고서 4,8,9에 따라 CUBIC-R에 N- 부틸 디 에탄올 아민 0.5 v%를 추가하여 굴절률 (RI) 일치를 위해 CUBIC-R +를 준비합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>RI 일치를 수행합니다.<ol><li>신장을 14mL 둥근 바닥 튜브에 넣고 14mL 둥근 바닥 튜브에 50%(v/v) CUBIC-R+(물과 CUBIC-R+의 1:1 혼합물) 7mL에 담그고 실온에서 1일 동안 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 14mL 둥근 바닥 튜브에 7mL의 CUBIC-R+를 담그고 실온에서2일 동안 부드럽게 흔들어 9(그림 1). 참고: 신장은 RI 매칭이 시작될 때 50% CUBIC-R+에 떠 있지만 프로세스가 끝나면 CUBIC-R+에서 가라앉고 투명해집니다(그림 2D).</li>
	</ol></li>
</ol>5. 이미지 획득 및 재구성
<ol><li>이미지 획득 중에 RI 매칭 신장을 실리콘 오일(RI = 1.555)과 미네랄 오일(RI = 1.467)(55:45)의 혼합물에 담그십시오(RI = 1.51)5 (그림 3).</li>
	<li>맞춤형9 라이트 시트 형광 현미경으로 전체 신장의 3D 이미지를 획득합니다( 재료 표 참조). 모든 원시 이미지 데이터를 16비트 TIFF 형식으로 수집합니다. 이미징 분석 소프트웨어로 3D 렌더링 이미지를 시각화하고 캡처합니다(Imaris, 재료 표 참조).</li>
</ol>

<ol><li>Velez-Fort, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stimulus+selectivity+and+connectivity+of+layer+six+principal+cells+reveals+cortical+microcircuits+underlying+visual+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing.</a> Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Landscape+for+Tissue+Clearing+Based+on+Hydrophilic+Reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li>
<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution%3A+toward+organism-level+systems+biology+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li>
<li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+three-dimensional+analysis+%28CUBIC-kidney%29+visualizes+abnormal+renal+sympathetic+nerves+after+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury.</a> Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).</li>
<li>Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+interactions+and+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune interactions and kidney disease.</a> Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).</li>
<li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oral+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibitor+enarodustat+counteracts+alterations+in+renal+energy+metabolism+in+the+early+stages+of+diabetic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease.</a> Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+sympathetic+signaling+in+macrophages+blocks+systemic+inflammation+and+protects+against+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

본 프로토콜은 교감 신경, 수집 관, 동맥, 근위 세뇨관 및 사구체 9,10,11과 같은 다양한 구조의 전체 신장 3D 이미징을 허용했습니다. 이 염색 방법은 거시적 관찰을 제공하고 허혈 재관류 손상 9,10 후 신장 교감 신경의 변화와 당뇨병 신장 질환 11의 초기 단계에서 사구체 비대를 시각화함으로써 새로운 생물학적 발견으로 이어졌습니다.
혼탁은 조직5의 광학적 불균일성으로부터 유도된다. 다양한 조직 투명화 방법의 공통 원리는 광산란자/흡수체를 제거하고 RI 일치 시약으로 공간을 채우는 것입니다. 용매 제거 장기의 3D 이...

신장은 다양한 세포 집단으로 구성됩니다. 기존의 병리학은 신장 미세 환경에 대한 많은 정보를 제공하지만 신장 질환 진행 중 세포 간 누화를 정확하게 이해하려면 3차원(3D) 영상이 필요합니다. 과거에는 전체 장기 3D 이미징1을 위해 수많은 연속 절단 및 이미지 재구성을 수행해야 했습니다. 그러나이 방법은 너무 많은 노력이 필요하고 재현성 측면에서 문제가있었습니다.
광학 클리어링은 이 장애물 2,3을 극복하기 위한 좋은 전략입니다. 조직 불투명도는 각 기관이 물, 단백질 및 지질을 포함한 다양한 물질로 구성되어 있기 때문에 주로 광산란 및 흡수로 인한 것입니다. 따라서 조직 청소의 기본 전략은 조직의 물과 지질을 단백질4와 동일한 광학적 특성을 갖는 굴절률(RI) 일치 시약으로 대체하는 것입니다. 투명한 시편을 관찰하기 위해서는, 라이트 시트 형광 현미경이 유용하다5. 라이트 시트는 측면에서 투명한 시편을 비추고 여기 신호는 수직 위치6에 위치한 대물 렌즈를 통해 획득됩니다. 이 현미경은 단일 스윕으로 단면 정보를 얻으며, 이는 컨포칼 또는 다광자 형광 현미경과 다릅니다. 따라서 낮은 수준의 광퇴색으로 z 스택 이미지를 빠르게 획득할 수 있습니다.
투명하고 방해받지 않는 뇌/신체 영상 칵테일 및 전산 분석(CUBIC)은 광학 시트 형광 현미경 2,7,8로 전체 장기 이미징을 가능하게 하는 조직 투명화 방법 중 하나입니다. CUBIC 및 전체 장착 면역형광 염색은 마우스 신장 3D 구조 9,10,11을 시각화하기 위해 본 연구에서 최적화되었습니다. 이 전체 장착 염색 방법을 사용하여 허혈 재관류 손상 9,10 및 당뇨병 성 신장 질환 11의 초기 단계의 사구체 비대뿐만 아니라 혈관, 근위 세뇨관 및 전체 신장 9의 수집 덕트 후에 신장 교감 신경의 변화를 시각화합니다.

<table><tbody><tr><td>14mL 둥근 바닥 고선명도 PP 시험관</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td>조직 투명화, 염색, 세척</td></tr><tr><td>2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine</td><td>Tokyo Chemical</td><td>Industry D1876</td><td>CUBIC-R+</td></tr><tr><td>37%-포름알데히드 용액</td><td>Nacalai Tesque</td><td>16223-55</td><td>고정 후</td></tr><tr><td>4%-파라포름알데히드 인산염 완충 용액</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09154-85</td><td>신장 고정,</td></tr><tr><td>Alexa Flour, 555-conjugated donkey, anti-sheep, IgG 항체</td>, <td>Invitrogen</td><td>A-21436</td>, <td>2차 항체 (1:100)</td></tr><tr><td>Alexa Flour 647-conjugated donkey, anti-rabbit, IgG 항체</td>, <td>Invitrogen</td><td>A-31573</td>, <td>2차 항체 (1:200)</td></tr><tr><td>Anti-aquaporin 2 (AQP2), 항체</td>, <td>Abcam</td><td>ab199975</td>, <td>1차 항체 (1:100)</td></tr><tr><td>Anti-podocin 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0372</td><td>1차 항체 (1:100)</td></tr><tr><td>항나트륨 포도당 공동수송체 2 (SGLT2) 항체</td><td>Abcam</td><td>ab85626</td><td>1차 항체 (1:100)</td></tr><tr><td>항티로신 하이드록실라제(TH) 항체</td><td>Abcam</td><td>ab113</td><td>1차 항체 (1:100)</td></tr><tr><td>항-알파;-평활근 액틴(&알파;-SMA) 항체</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td>1차 항체 (1:200)</td></tr><tr><td>PBS의 차단제 카제인</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37528</td><td>염색 완충액</td></tr><tr><td>부토르파놀 주석산염</td><td>Meiji</td><td>005526</td><td>마취제</td></tr><tr><td>C57BL/6NJcl</td><td>Nippon Bio-Supp.Center</td><td>N/A</td><td>마우스 균주</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>이미징 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>매크로 줌 현미경</td><td>OLYMPUS</td><td>MVX10</td><td>관측 장치 맞춤형 현미경</td></tr><tr><td>Medetomidine Hydrochloride</td><td>Kyoritsu-Seiyaku</td><td>008656</td><td>마취제</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>SANDOZ</td><td>27803229</td><td>마취</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>침지 오일</td></tr><tr><td>N-부틸디에탄올아민</td><td>도쿄 화학 공업</td><td>B0725</td><td>CUBIC-L, CUBIC-R+</td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>도쿄 화학 산업</td><td>N0078</td><td>CUBIC-R +</td></tr> <tr><td>폴리에틸렌 글리콜 모노 -p- 이소 옥틸 페닐 에테르 / 트리톤 X-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12967-45</td><td>CUBIC-L, PBST</td></tr><tr><td>실리콘 오일 HIVAC-F4</td><td>Shin-Etsu 화학</td><td>50449832</td><td>침지 오일</td></tr><tr><td>Wako</td><td></td><td>195-11092</td><td>염색 완충액</td></tr></tbody></table>

cubic 전체 신장 3차원 염색

Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC

기존의 병리학은 신장 미세 구조에 대한 많은 정보를 제공했지만 3차원(3D) 정보가 부족하여 신장의 혈관, 근위 세뇨관, 수집 관, 사구체 및 교감 신경의 정확한 구조를 알기가 어려웠습니다. 광학 클리어링은 이 큰 장애물을 극복하기 위한 좋은 전략입니다. 전체 장기의 여러 세포는 조직 투명화와 3D 이미징 기술을 결합하여 단일 세포 분해능으로 분석할 수 있습니다. 그러나 전체 장기 이미징을위한 세포 표지 방법은 아직 개발되지 않았습니다. 특히, 전체 장착 장기 염색은 항체 침투의 어려움 때문에 어렵습니다. 본 프로토콜은 CUBIC (투명하고 방해받지 않는 뇌 / 신체 이미징 칵테일 및 전산 분석) 조직 투명화 방법을 사용하여 3D 이미징을위한 전체 마운트 마우스 신장 염색을 개발했습니다. 이 프로토콜은 포괄적 인 관점에서 당뇨병 성 신장 질환의 초기 단계에서 허혈 재관류 손상 및 사구체 비대 후 신장 교감 신경 탈신경을 시각화 할 수있게했습니다. 따라서이 기술은 거시적 관점을 제공함으로써 신장 연구에서 새로운 발견으로 이어질 수 있습니다.

이 염색 방법을 사용하여 전체 신장 (그림 4A, B 및 비디오 1)의 교감 신경 [항 티로신 하이드 록 실라 제 (TH) 항체] 및 동맥 [항 α 평활근 액틴 (αSMA) 항체]을 시각화했습니다9. 비정상적인 신장 교감 신경은 허혈 / 재관류 손상 (IRI) 9,10 후에 시각화되었습니다 (그림 4C). 더욱이, 전체 비장(13)에서 교감신경 시각화는 이 프로토콜을 사용하여 달성되었다(도 4D). 3D 면역형광 데이터를 정량화하는 한 가지 예가 도 5에 도시되어 있다....

본 프로토콜은 3차원(3D) 신장 영상을 위한 조직 투명화 방법 및 전체-마운트 면역형광 염색을 기술한다. 이 기술은 신장 병리학에서 거시적 관점을 제공하여 새로운 생물학적 발견으로 이어질 수 있습니다.

CUBIC 전체 신장 3차원 염색

Although conventional pathology provided numerous information about kidney microstructure, it was difficult to know the precise structure of blood ...

이 프로토콜을 사용하면 전체 신장에서 3차원 구조를 시각화할 수 있으며, 이는 거시적 관점을 제공하여 신장 연구에서 혁신적인 발견으로 이어질 수 있습니다. 전체 마운트 장기 염색은 항체 침투가 어렵기 때문에 어렵습니다. 이 프로토콜은 항체에 의한 신장의 고품질 전체 마운트 염색을 입증했습니다.시작하려면 관류 고정 및 신장 샘플링 직후 신장을 섭씨 4도에서 16 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 담그어 침지 고정을 수행하십시오. PBS를 사용하여 각각 2 시간 동안 세 번 씻으십시오. 고정 된 신장을 14 밀리리터의 둥근 바닥 튜브에 50 % CUBIC-L의 7mm에 담그고 실온에서 부드럽게 흔들어 탈색 및 탈지방 과정을 수행하십시오.6 시간 후, 신장을 14mm 둥근 바닥 튜브에 7 밀리리터의 CUBIC-L에 담그고 섭씨 37도에서 5 일 동안 부드럽게 흔 듭니다. CUBIC-L을 매일 새로 고칩니다. 탈색 및 탈지화가 완료되면 디스펜싱 스푼을 사용하여 샘플 취급을 하고 실온에서 2시간 동안 PBS로 신장을 세 번 세척합니다.염색 완충액에 희석된 1차 항체에서 지방화된 신장을 면역염색하고, 섭씨 37도의 인큐베이터 쉐이커에서 7일 동안 부드럽게 흔들었다. 그런 다음 PBST라고도 하는 PBS의 0.5% 트리톤 X-100으로 신장을 실온에서 하루 동안 세척합니다. 2 차 항체 염색의 경우, 어두운 곳에서 염색 완충액에서 2 차 항체로 신장을 섭씨 37도에서 7 일 동안 부드럽게 흔들어 치료하십시오.PBST 세척으로 염색을 실온에서 하루 동안 고정한다. 고정 후 신장을 PB의 1 % 포름 알데히드에 3 시간 동안 담그고 실온에서 6 시간 동안 PBS로 씻습니다. 14 밀리리터의 둥근 바닥 튜브에 7 밀리리터의 50 % CUBIC-R +에 신장을 담그고 하루 동안 흔들어 굴절률 일치를 수행 한 다음 7 밀리리터의 CUBIC-R +로 2 일 동안 실온에서 흔들어 치료합니다.면역 염색 방법의 도움으로 전체 신장의 교감 신경과 동맥을 3D 신장 영상으로 시각화했습니다. 또한, 비정상적인 신장 교감 신경은 허혈 재관류 손상 후에 시각화되었다. 이 프로토콜은 또한 전체 비장에서 교감 신경을 시각화하는 것을 용이하게했습니다.3차원 면역형광염색을 위한 데이터 정량화 과정이 여기에 표시됩니다. 또한, 덕트, 근위 세뇨관의 S1 세그먼트 및 사구체를 수집하여 전체 신장에서 성공적으로 시각화했습니다. 당뇨병성 신장 질환의 초기 단계에서 약물 투여로 인한 억제된 사구체 비대도 3D 영상으로 시각화되었습니다.이 프로토콜은 전체 신장 내의 특정 분자를 표시 할 수 있습니다. 따라서 연구자들은 혈관 구조의 구조 변화를 분석하거나 신장 조직에서 드문 사건을 발견 할 수 있습니다.

whole-kidney-three-dimensional-staining-with-cubic

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이 비디오는 CUBIC(clear, unstructed brain/body imaging cocktails and computational analysis)이라는 조직 제거 방법과 면역형광 염색을 사용하여 쥐 신장의 전체 마운트 염색에 대한 분석을 보여줍니다. 신장은 조직 투명화를 거쳐 신장을 탈지화, 탈색 및 굴절률 정합 용액으로 처리하여 최적의 3차원 이미징을 위해 조직을 투명하게 만듭니다. 조직은 형광 표지된 항체로 염색되어 광시트 현미경으로 조직의 교감 신경과 동맥을 드러냅니다.

신장의 3차원 이미징을 위한 전체 마운트 장기 염색 기술

신장 구조 조직 설계 기관 부족 및 투 석의 해로운 효과 위한 솔루션을 제공합니다. 여기, 우리는 마이크로 프로토콜 설명 cortico 골 수 세그먼트의 격리 murine 신장 해 부. 이 세그먼트는 신장 organoids를 형성 세포 비 계 없는 구문으로 이식.

서 주 신장 조직 세그먼트와 소설 비 계 없는 건설 기술 관

항체 라벨링, 광학 클리어링 및 고급 광 현미경의 조합은 완전한 구조 또는 장기의 3차원 분석을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 간단한 방법은 두꺼운 신장 슬라이스의 면역 라벨링, 에틸 시나메이트와 광학 클리어링, 3차원 신장 구조의 시각화 및 정량화를 가능하게 하는 공초점 이미징을 결합하는 간단한 방법입니다.

면역 표지된 신장 조직의 광학 클리어링 및 화상 진찰

X선 컴퓨터 단층 촬영을 위해 설계된 X선 특이적 염색 방법을 사용하여 현미경 조직 구조의 3D 시각화프로토콜이 제시된다.

X선 특이적 염색 방법 및 나노스코픽 컴퓨터 단층 촬영을 사용한 연조직 시료의 3D 이미징

이 작품은 장기 발달을 연구하기위한 두 가지 방법, 배양 배아 장기 및 오르가노이드의 혈관 을 허용하는 조류 배아에서 융모난성 막 (CAM)에 개선 된 이종이식 설정및 새로운 고정 z 방향을 설명합니다. 고해상도 시간 경과 공초점 이미징을 허용하는 수정 된 실험 조건을 가진 장기 배양 방법.

혈관 을 위한 신장 오르가노이드 및 Organotypic 문화의 최적화, 확장된 발달 및 향상한 현미경 검사법 화상 진찰

여기에서 자사는 100μm에서 수 밀리미터 범위의 고정 3차원 세포 배양 모델의 염색 및 세포내 분해능 이미징을 수행하기 위한 상세하고 강력하며 보완적인 프로토콜을 제공하여 형태, 세포 유형 구성 및 상호 작용을 시각화할 수 있습니다.

3차원 오가노이드 및 스페로이드 모델의 염색 및 고해상도 이미징

이 방법은 복셀 기반의 3D 프린팅 워크플로우를 보여 주며, 이는 정확한 공간 충실도 와 공간/대비 해상도로 의료 이미지에서 직접 인쇄됩니다. 이를 통해 데이터의 손실이나 변경 없이 방사선 밀도와 상관관계가 있는 형태학적으로 복잡하고 졸업된 재료를 통해 재료 분포를 정밀하고 졸업할 수 있습니다.

복셀 인쇄 해부학 : 비트 맵 인쇄를 통해 사실적이고 사전 수술 계획 모델의 설계 및 제작

여기에서는 표면 사구체가있는 뮌헨 Wistar Fromter 쥐에서 2 광자 현미경을 사용하여 사구체 역학 및 기능에 대한 장기간의 요관 폐쇄의 영향을 정량화하는 프로토콜을 제시합니다.

2광자 현미경을 사용하여 만성 일방적 요관 폐쇄가 사구체 과정에 미치는 영향을 정량화

이 연구는 CUBIC이 제거된 마우스 신장의 사구체를 표지하고 분석하기 위한 사용하기 쉽고 완전하며 간단한 방법 세트를 제시합니다. 사구체 수 및 부피와 같은 데이터는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란, 광시트 형광 현미경(LSFM) 또는 일반적인 컨포칼 현미경 및 Imaris와 같은 소프트웨어를 사용하여 쉽고 안정적으로 얻을 수 있습니다.

마우스 사구체를 표지하고 분석하기 위한 효율적이고 빠른 방법

여기에서는 미세생리학적 시스템에서 콜라겐 및 콜라겐-아가로스 매트릭스를 사용하여 3D 세포 배양을 구현하기 위한 지침을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜은 신장 근위세뇨관 및 신세포 암 스페로이드 공동 배양을 지원하여 생체 내 조건을 시뮬레이션하고 신장암 세포 상호 작용에 대한 고급 조사를 가능하게 합니다.

신장암 진행을 모델링하기 위한 건강한 신장과 종양 상피의 미세유체 공동 배양

이 논문에서는 복막 전이의 3차원 구조를 특성화하기 위해 최적화된 다중 면역형광 프로토콜에 대해 설명합니다.

Iterative Bleaching Extends Multiplexity 접근법을 사용한 종양 함유 조직의 3차원 이미징

배우세요 CUBIC 조직 투명화와 전체 장기 면역형광 염색을 이용한 신장 3차원 구조 시각화 방법입니다. 이 기술은 항체 침투를 개선하여 신장 병리학 연구에서 혁신적인 발견을 가능하게 합니다.

CUBIC 전체 신장 3차원 염색

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