Name: 삼차원 세포 배양 기질의 UV-광패터닝에 의한 다큐 세포 미세환경 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 배우세요 UV-광패터닝을 활용한 삼차원 세포 배양 기질 제작 방법으로 다큐 세포 미세환경을 생성하는 기술입니다. 이 방법은 생리학적으로 관련성 높은 다양한 세포 유형의 행동을 체계적으로 연구할 수 있는 강력한 플랫폼을 제공합니다.

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인간의 원발성 각화세포를 제공해주신 Nello Formisano 박사(MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine)에게 감사드립니다. 이 작업은 Chemelot InSciTe (프로젝트 BM3.02)의 지원을 받았습니다. 유럽 연구위원회 (보조금 851960); 중력 프로그램을위한 교육, 문화 과학부 024.003.013 "재료 주도 재생". 저자는 Alvéole에게 서신, 도움 및 문제 해결에 대해 감사하고 싶습니다.

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

요즘, 세포 거동은 종종 네이티브 세포 미세 환경의 복잡성이 부족한 평평한 배양 기질에서 연구됩니다. 스캐폴드 및 하이드로젤과 같은 3D 환경이 대안으로 사용됩니다. 이러한 세포 배양 환경이 생체 내 관련성을 개선하지만, 세포 거동에 대한 체계적인 연구와 판독 방법의 타당성 모두 여전히 도전적입니다. 대표적인 배양 기질 상에서 세포 거동을 체계적으로 조사하기 위해서는 현미경 판독을 허용하는 일관된 멀티큐 기질이 필요하다. 따라서, 이 프로토콜에서, 우리는 생리학적으로 관련된 기하학적 및 패턴화된 ECM 단백질로 다큐 세포 배양 기질을 만드는 방법을 기술한다. 시험관 내 플랫폼에서 조직 기하학 및 접촉 안내 단서와 같은 환경 신호를 결합하는 데있어 주요 과제는 주로 기술적 인 성격입니다. 접촉-유도 큐(예를 들어, 소프트 리소그래피, 딥-UV 패터닝, 및 마이크로컨택트 프린팅(35,36))를 세포 배양 재료에 적용하기 위한 종래의 방법들은 평면 기판에 대해 최적화되었다. 접촉 안내 단서와 결합 된 3D 세포 배양 재료의 필요성은 불량한 패턴 정렬, 해상도 및 유연성과 같은 몇 가지 기술적 과제를 강조했습니다. 이러한 과제를 극복하기 위해 고처리량, 마스크리스, 광 기반 패터닝 방법45,49를 사용할 수 있습니다. 여기서 광학 현미경은 마이크로미터 단위로 정밀한 패턴 정렬과 분해능을 가능하게 합니다(그림 6 참조). 또한 디지털 마스크를 사용하면 연구원이 노동 집약적 인 물리적 마스크를 제작할 필요없이 광범위한 패턴에서 세포 행동을 연구 할 수 있습니다.
UV-광패터닝 접근법은 다양한 재료(48)로부터 생성된 다양한 3D 형상(예를 들어, 실린더, 안장, 돔, 구덩이)과 조합하여 사용될 수 있다. 본 연구에 사용된 3D 세포 배양 기질은 PDMS로부터 제조된다; 그러나 다른 재료도 사용할 수 있습니다. 이는 관심있는 특징을 포함하는 최종 세포 배양 기질을 생산하기 위해 상이한 단계들을 필요로 할 수 있다. 세포는 세포 배양 물질의 표면 거칠기에 민감한 것으로 나타났기 때문에, 관찰된 세포의 반응이 3D 기하학적 구조 및 접촉 유도 단서(50,51)에 완전히 기인할 수 있도록 매끄러운 표면을 갖는 세포 배양 칩을 만드는 것이 중요하다. 광학 프로파일 로메트리, 주사 전자 현미경 또는 원자력 현미경과 같은 측정 방법을 사용하여 표면 거칠기를 측정 할 수 있습니다. 세포 배양 물질의 제조 후, 관심있는 특징의 특정 치수에 의존하는 하나 또는 다수의 초점면에 기초한 패터닝 방법을 선택할 수 있다(도 3 참조). 전형적으로, 단일 초점면은 대략 50μm의 Z 범위 내의 영역을 패턴화하는데 사용된다. 패턴 해상도는 이 엄지 손가락 규칙을 사용하여 일관되게 표시되었습니다(그림 6 참조). 그러나이 방법의 단점은 여러 초점면과 패턴의 도입으로 패터닝 시간이 증가한다는 것입니다. 여러 초점면을 사용하여 최대 16mm x 16mm x 0.17mm(X x Y x Z)의 3D 기하학적 기능이 높은 패턴 품질로 성공적으로 패터닝되었습니다.
추가적으로, 이 프로토콜과 조합하여 사용될 수 있는 기하학적 특징들의 높이(Z축)가 제한된다는 것을 언급하는 것이 중요하다. UV-photopatterning과 많은 세포 판독 모두 현미경 설정에 의존하기 때문에 목표의 작동 거리에 따라 피쳐의 최대 높이가 결정됩니다. 우리 손에는 높이가 300μm를 초과하는 형상이 여전히 UV 광패턴화 될 수 있으며 판독은 40x 목표의 공초점 현미경을 사용하여 수행되었습니다. 따라서, 세포내 및 조직 스케일에 이르는 메카노생물학적 연구는 기술된 프로토콜을 사용하여 가능하다. 
고려될 필요가 있는 또 다른 인자는 UV-광패터닝(49) 동안 또는 그 이후에 샘플이 건조될 위험이다. 이것은 볼록함이 종종 세포 배양 재료 외부에 노출되기 때문에 3D 지오메트리를 사용할 때 특히 관련이 있습니다. 그림 4에 나타난 바와 같이, 이것은 관심있는 특징의 상부에 단백질 응집체가 형성되는 고르지 않은 패턴을 초래할 수 있다. 단백질 배양 후 및 세포 배양 중 세포 배양 칩의 세척은 3D 형상의 적절한 코팅을 위해 매우 중요합니다. 따라서 항상 세포 배양 칩의 상부에 소량의 작업 용액 (PBS, PLPP, 단백질 용액, 세포 배양 배지)을 남겨 두는 것이 좋습니다.
지금까지, 몇몇 단백질 코팅 (피브로넥틴, 콜라겐 유형 I 및 IV, 젤라틴, FNC) 및 세포 유형 (인간 골수 기질 세포, 인간 근섬유아세포, 인간 내피 세포, 인간 각질세포, 및 진피 섬유아세포)이 구조화된 세포 배양 물질 상에 기술된 광패터닝 접근법과 조합하여 사용되어 왔다. 이전 연구(48)에서 보여진 바와 같이, 단백질 인큐베이션 파라미터의 최적화는 새로운 세포 유형에서의 체계적인 조사를 위한 핵심이다. 따라서 새로운 단백질 또는 세포에 대한 새로운 실험을 수행하기 전에 다양한 단백질 농도, 배양 온도 및 배양 시간을 테스트하는 것이 좋습니다. 동질적이고 패턴화된 평평한 영역에 대한 초기 부착 후의 세포 형태학을 '정상적인' 세포 배양 조건 하에서의 세포 형태학과 비교함으로써, 최적화된 실험 파라미터 세트를 얻을 수 있다. 또한 각 세포 유형은 특정 멀티큐 환경에서 인식 가능한 접착 형태를 표시하기 위해 시드 후 다른 시간이 필요할 수 있습니다( 그림 5 참조). 이를 위해, 단계 8.4에서 세척 동안 패턴화된 영역 상에 접촉 이벤트를 제시하기 위해 세포 유형당 필요한 시간을 최적화하는 것이 중요하다. 예를 들어, 우리는 라인 패턴에서 인간 각질 세포가 시딩 후 처음 30 분 이내에 길쭉한 형태를 보이는 반면, 내피 세포와 진피 섬유 아세포는 접착 형태학의 변화를 나타내기 전에 여러 시간이 필요하다는 것을 관찰했습니다. 따라서 단백질 배양(단계 7) 및 세포 시딩(단계 8)에 필요한 실험 파라미터는 선택한 단백질 및 세포 유형에 따라 달라질 수 있다. 
3D 형상에 접촉 안내 신호를 적용하기 위해 제시된 접근 방식은 복잡한 다중 큐 환경에서 셀 거동에 대한 더 깊은 이해를 창출하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에는 초점 부착 및 핵과 같은 세포 내 구성 요소에 대한 조사가 포함될 수 있으며 제안 된 방법을 사용하여 더 큰, 세포 또는 조직 규모에서 수행되는 실험도 포함될 수 있습니다. 결국, 얻은 지식은 복잡한 세포 환경이 원하는 결과를 향해 세포 행동을 유도하도록 설계된 조직 공학 응용 프로그램의 설계에 사용될 수 있다고 예상됩니다.

생체내에서, 세포는 세포외 매트릭스(ECM)로부터 기원되는 기계적, 물리적, 생화학적 성질을 가질 수 있는 매우 다양한 환경 단서를 받게 된다. 수많은 환경 단서가 증식, 분화 및 이동 1,2,3,4,5와 같은 세포 행동의 조절에 중요한 역할을하는 것으로 확인되었습니다. 가장 널리 조사된 현상 중 하나는 접촉 안내이며, 세포외 기질 6,7,8,9,10,11에 존재하는 이방성 생화학적 또는 지형적 패턴을 따른 부착-매개된 세포 정렬을 기술한다. 세포의 정렬을 지시하는 것 외에도, 접촉 안내 단서는 또한 세포 이동, 세포 내 단백질의 조직, 세포 모양 및 세포 운명12,13,14,15와 같은 다른 세포 특성에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 또한, 3D 세포 환경의 기하학적 구조는 또한 세포 거동16,17에 대한 조절 영향으로 인정 받았다. 인체에서 세포는 마이크로 스케일 콜라겐 섬유, 모세 혈관 및 사구체에서부터 중규모 폐포 및 동맥18,19에 이르기까지 다양한 곡선 기하학에 노출됩니다. 흥미롭게도, 최근의 시험관내 연구는 세포가 나노-규모에서 메 조스케일20,21,22,23에 이르기까지 그러한 물리적 단서를 감지하고 이에 반응할 수 있음을 보여주었다.
현재까지 환경 신호에 대한 세포 반응을 조사하는 대부분의 연구는 주로 단일 단서를 분리하는 실험 설정을 사용하여 수행되었습니다. 이 접근법은 환경 단서의 세포 감지 뒤에있는 기본 메커니즘을 이해하는 데 엄청난 진전을 가져 왔지만 동시에 여러 단서를 제시하는 생체 내 환경을 제대로 되풀이하지 못합니다. 이러한 격차를 해소하기 위해서는 여러 환경 단서를 독립적으로 동시에 제어 할 수있는 문화 플랫폼을 개발하는 것이 유용합니다. 이 개념은 매트릭스 강성과 리간드 밀도 26,27,28,29, 기판 강성 및 다공도 30, 기판 강성 및 3D 마이크로 틈새 볼륨 31, 표면 지형 및 접촉 유도 큐 32,33,34를 결합한 연구를 통해 최근 24,25의 견인력을 얻었습니다. 및 나노스케일 접촉-유도 단서와 메조스케일 곡률 안내 단서(23). 그러나 접촉 유도 단서와 다양한 3D 형상을 제어되고 높은 처리량의 방식으로 결합하는 것은 여전히 어려운 일입니다.
이 연구 프로토콜은 이러한 과제를 해결하고 ECM 단백질의 패턴화 된 접착 영역 (접촉 유도 신호)과 기질 곡률 (기하학적 단서)의 제어 된 조합으로 세포 배양 기질을 만드는 방법을 소개합니다. 이러한 접근법은 체계적이고 높은 처리량 방식으로 생체모방 멀티큐 환경에서 세포 반응의 해부를 허용한다. 습득 한 지식은 복잡한 환경에서 세포 행동에 대한 이해를 도울 수 있으며 세포 반응을 원하는 결과로 유도하는 특성을 가진 유익한 자료를 설계하는 데 사용할 수 있습니다.
3D 단백질 포토패터닝 세포 배양 물질 상의 ECM 단백질의 접착 영역(접촉-안내 큐)의 생성은 다양한 기술, 예를 들어 딥-자외선(deep-UV) 패터닝 또는 마이크로컨택트 프린팅(35,36)에 의해 달성될 수 있다. 딥-UV 패터닝은 고분자 물질의 마스크를 통해 투사되는 자외선을 사용하여 세포 배양 기질의 특정 위치에서 패시베이션 폴리머를 분해합니다. 이어서, 패터닝된 기질은 관심있는 리간드와 함께 인큐베이션되고, 그 결과 세포 부착을 지지하는 접착 영역이 생성되고 미리 정의된 위치(12,37,38) 상에서 배양된다. 단백질 패턴을 도입하는 또 다른 방법은 원하는 모양을 포함하는 엘라스토머 스탬프를 원하는 단백질로 코팅하고 세포 배양 기판에 압착하여 세포가 부착 할 수있는 단백질 코팅을 전달하는 마이크로 접촉 인쇄를 사용하는 것입니다35,37,39,40 . 불행히도, 두 기술 모두 마스크 준비 및 소프트 리소그래피 방법에 의존하기 때문에 실험은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 패턴 유연성 측면에서 제한적입니다. 또한 딥 UV 패터닝과 마이크로 컨택트 프린팅은 평면 재료에 가장 적합하며 3D 환경에서 리간드를 패터닝하는 데 불가능하지는 않더라도 기술적으로 어렵습니다.
이러한 종래의 방법들을 개선하기 위해, Waterkotte et al. 결합된 마스크리스 리소그래피, 화학 기상 증착, 및 열성형은 마이크로패턴화된 3D 폴리머 기판(41)을 생성한다. 그러나이 기술은 열 성형 가능한 폴리머 필름의 사용에 의존하고 낮은 단백질 패턴 분해능 (7.5 μm)을 제공하는 반면, 세포는 0.1 μm2,42만큼 작은 기하학적 단백질 패턴에 반응하는 것으로보고되었습니다. Sevcik 등은 나노- 및 마이크로미터 지형43을 함유하는 기질 상의 ECM 리간드를 나노패턴화하는 또 다른 유망한 방법을 기술하였다. 마이크로컨택트 프린팅을 사용하여, ECM 단백질을 폴리디메틸실록산(PDMS) 스탬프로부터 열반응성 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(pNIPAM) 기판으로 옮겼다. 이어서, pNIPAM 네트워크의 열반응성 특성은 이들이 2차원(2D) 단백질 패턴을 지형학적 PDMS 기질(10-100 μm 깊은 홈)으로 전달할 수 있게 하여, 지형학적 특징에 대한 부착 부위의 국소화를 제어한다. 그러나, 모든 가능한 미세 토포그래피가 패턴화될 수 있는 것은 아니며, 이는 감소된 습윤성 문제로 인해 더 깊은 지형 기판을 패터닝하는 것이 더 어려워지기 때문이다. 깊이 대 폭 종횡비가 2.4인 트렌치는 패턴을 지형 기판(43)으로 성공적으로 전달하는 데 궁극적인 한계인 것으로 보고되었다. 또한 다양한 패턴의 유연성과 생성 된 패턴의 해상도는 마이크로 접촉 인쇄의 요구 사항으로 인해 열악합니다.
이 백서에서는 위에서 언급한 병목 현상을 극복하는 방법을 설명하고 세포 배양에 사용할 수 있는 멀티큐 기판을 만드는 유연하고 높은 처리량 방법을 제공합니다( 그림 1 참조). ĸ = 1/2500에서 ĸ = 1/125 μm-1 사이의 곡률을 갖는 생리학적으로 관련된 형상(실린더, 돔, 타원 및 안장 표면)은 PDMS 칩에서 사전 설계되고 미세 제작됩니다. 그 후, 접촉 유도 단서는 1.5μm(44)만큼 작은 해상도의 포토패터닝 기술을 사용하여 다양한 디지털 패턴 설계를 사용하여 3D 형상 위에 생성됩니다. 이를 위해, PDMS 칩은 세포 및 단백질이 부착되는 것을 방지하기 위해 초기에 패시베이션된다; 이 패시베이션 층은 이어서 광개시제 4-벤조일벤질트리메틸암모늄 클로라이드(PLPP) 및 UV-광 노출(45)의 조합에 의해 제거될 수 있다. 디지털 마스크는 UV 노출의 위치, 따라서 패시베이션 층이 제거되는 영역을 지정하도록 설계되었습니다. 단백질은 후속적으로 이러한 영역에 부착되어 세포 부착을 가능하게합니다. 패터닝은 물리적 마스크가 아닌 디지털 마스크를 사용하여 수행되기 때문에 추가 포토 마스크를 설계하고 제작하는 것과 관련된 번거 로움과 비용없이 다양한 패턴을 신속하게 만들 수 있습니다. 또한, 다양한 범위의 ECM 단백질(예를 들어, 콜라겐 타입 I, 젤라틴, 및 피브로넥틴)이 기질 상에 패터닝될 수 있다. 이 프로토콜이 PDMS로 제조된 세포 배양 칩을 사용하여 수행되지만, 그 원리는 관심있는 임의의 다른 물질(46)에 적용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>안티-빈큘린 항체, 마우스 단클론 IgG1</td><td>Sigma</td><td>V9131</td><td>희석: 1/600</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민, 분획 V</td><td>Roche</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, 피루브산</td><td>Gibco 41966029</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x)</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>DMi8 에피형광 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Biosolve</td><td>0005250210BS</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Serana</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ, 버전 v1.53k</td><td>www.imageJ.nih.gov</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 형광 형광펜</td><td>Stabilo</td><td>4006381333627</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescin 표지 젤라틴</td><td>Invitrogen</td><td>G13187</td><td>농도: 0.01%</td></tr><tr><td>포름알데히드 용액</td><td>Merck</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버 슬립 24 x 60 mm, #1</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버 슬립, &oslash; = 32 mm, #1</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX PL fluotar L 20X/0.40na 현미경 대물렌즈</td><td>Leica</td><td>11506242</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Human dermal fibroblasts</td><td>Lonza</td><td>CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>Human primary keratocytes</td><td>MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illustrator, version 26.0.1</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실험실 오븐</td><td>Carbolite</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>L-Ascorbic acid, 2-phosphate, sesquimagnesium, salt hydrate,</td><td>Sigma-Aldrich</td>, <td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X 소프트웨어, 버전 3.5.7.23225</td>, <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leonardo 소프트웨어, 버전 4.16</td><td>Alv&eacute; </td><td></td><td></td>ole</tr><tr><td>Micro-manager, 버전 1.4.23</td><td>개방형 이미징</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>마운팅 매체</td></tr><tr><td>mPEG-숙시니미딜 발레레이트 MW 5,000 Da</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td>농도: 50 mg/mL</td></tr><tr><td>네거티브 유리 몰드</td><td>FEMTOprint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live Readyprobes 시약(Hoechst 33342)</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>2 drops/mL</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (&oslash;=100 mm)</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Atto 647N</td><td>Sigma</td><td>65906</td><td>희석: 1/250</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 애셔</td><td>Emitech</td><td>K1050X</td><td></td></tr><tr><td>PLPP (광개시제)</td><td>Alv&eacute; </td><td></td><td></td>ole</tr><tr><td>Poly-L-lysine, 멸균 여과</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td>농도: 0.01</td></tr><tr><td>%PRIMO</td><td>Alv&eacute; </td><td></td><td></td>올레</tr><tr><td>로다민 표지 피브로넥틴</td><td>Cytoskeletn, Inc.</td><td>FNR01</td><td>농도 : 10 & 마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa 488을 사용한 2차 항체, 염소 안티 마우스 IgG1 (H)</td> <td>분자 프로브</td><td>A21121</td><td>희석: 1/300</td></tr><tr><td>Alexa 555, 염소 안티 마우스 IgG1 (H)를 사용한 2차 항체</td> <td>분자 프로브</td><td>A21127</td><td>희석: 1/300</td></tr><tr><td>스핀 코터</td><td>Leurell Technologies Corporation</td><td>모델 WS-650MZ-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>DOW</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP8X 컨포칼 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane</td><td>ABCR</td><td>AB111444</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 없음(0.05%), 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

삼차원 세포 배양 기질의 uv-광패터닝에 의한 다큐 세포 미세환경 생성

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

세포외 매트릭스는 세포 기능의 중요한 조절자이다. 리간드 분포 및 조직 기하학과 같은 세포 미세 환경에 존재하는 환경 신호는 세포 표현형 및 행동을 관리하는 데 중요한 역할을하는 것으로 점점 더 많이 나타났습니다. 그러나, 이러한 환경 단서 및 세포에 대한 그들의 효과는 종종 개별 단서를 분리하는 시험관내 플랫폼을 사용하여 개별적으로 연구되며, 이는 다중 단서의 복잡한 생체내 상황을 크게 단순화하는 전략이다. 엔지니어링 접근법은 생체 내 미세 환경의 복잡성을 포착하면서도 시험관 내 시스템의 정밀도 및 조작성을 유지하는 실험 설정을 개발함으로써 이러한 격차를 해소하는 데 특히 유용 할 수 있습니다.
이 연구는 자외선 (UV) 기반 단백질 패터닝과 리소그래피 기반 기판 미세 제작을 결합한 접근 방식을 강조하여 다중 큐 환경에서 세포 거동에 대한 고처리량 조사를 가능하게합니다. 마스크리스 UV-광패터닝을 통해 잘 정의된 다양한 기하학적 단서를 포함하는 칩의 3차원(3D) 세포 배양 기질에 복잡하고 접착적인 단백질 분포를 만들 수 있습니다. 제안된 기술은 상이한 중합체 물질로부터 제조되고 광범위한 단백질의 접착 패턴화된 영역과 결합된 배양 기질에 사용될 수 있다. 이러한 접근법으로, 단층뿐만 아니라 단일 셀은 패턴화된 기판에 의해 제시된 기하학적 단서와 접촉 안내 단서의 조합을 받을 수 있다. 따라서 칩 물질, 단백질 패턴 및 세포 유형의 조합을 사용한 체계적인 연구는 다중 큐 환경에 대한 세포 반응에 대한 근본적인 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

설명된 프로토콜에 의해, 3D PDMS 세포 배양 기판은 UV-광패터닝되어 세포 부착에 적합한 정밀하고 높은 처리량의 접착 영역을 생성할 수 있다. 이러한 방식으로, 세포는 관련 기질 기하학적 및 접착 리간드 패턴을 동시에 받게 된다. 배향, 세포 영역 및 초점 부착의 수와 같은 세포 특성은 복잡한 생체 유사 환경에서 세포 거동을 더 잘 이해하기 위해 쉽게 모니터링하고 사용할 수 있습니다.
3D PDMS 기판 상의 패터닝 이벤트를 검증하기 위해, 프로토콜의 상이한 단계에서 물질의 원자 표면 조성은 원자 X선 광전자 분광법(XPS)48을 사용하여 측정되었다. 요약하면, XPS 측정은 패시베이션 샘플에서 증가된 탄소 신호와 함께 PEG 사슬의 존재를 보여주었고, 이는 광패터닝 후에 감소되었다. 피브로넥틴을 사용한 인큐베이션은 탄소 신호의 증가를 가져왔고, 이는 다시 세포 배양 칩의 표면에서의 성공적인 단백질 부착을 나타낸다. 다음으로, 3D 피쳐에 대한 패턴 분해능 및 정렬은 다양한 원형 패턴화된, 오목한 구덩이 상에서 특성화되었다(ĸ = 1/250 μm-1, ĸ = 1/1,000 μm-1, 및 ĸ = 1/3,750 μm-1, 도 6 참조). 최대 강도 예측으로부터, 단백질 패턴이 세 가지 3D 특징 모두에서 성공적으로 패턴화되었다고 결론 지을 수 있습니다. 그림 6A의 강도 프로파일은 패턴화된 영역과 패턴화되지 않은 영역 사이의 날카로운 전환과 함께 높은 패턴 분해능을 보여줍니다. 추가적으로, 구덩이 내의 완전한 패턴을 가로질러 일관된 단백질 강도가 얻어졌다.
ĸ = 1/250 μm-1인 오목한 구덩이는 단일 초점면 방법(1개의 패턴)을 사용하여 패터닝된 반면, ĸ = 1/1,000 μm-1 및 ĸ = 1/3,750 μm-1인 구덩이는 각각 2개와 3개의 초점면(패턴)을 사용하여 패터닝되었다. 그림 6의 최대 강도 투영에서 볼 수 있듯이 두 방법 모두 피쳐 위에 있는 패턴의 완벽한 정렬을 초래합니다. 두 개의 서로 다른 초점면과 패턴 사이에 잘못 정렬된 전환은 관찰할 수 없습니다.
설명된 프로토콜을 사용하여, 광범위한 단백질 패턴 설계가 다양한 형상에 적용될 수 있다( 도 7 및 비디오 1 참조). 이 방법의 다양성을 설명하기 위해 반실린더 (볼록하고 오목함), 안장 표면 및 구덩이는 다양한 너비의 선과 원을 사용하여 패턴화되었습니다. 광패턴화된 물질은 후속적으로 세포 배양에 사용될 수 있다(도 7, 도 8, 비디오 2, 비디오 3 및 비디오 4 참조). 오목한 세미실린더(피브로넥틴 라인, 적색, 5 μm 폭, 및 5 μm 갭) 상에서 배양된 진피 섬유아세포의 예가 도 8, 도 9, 및 비디오 4에 도시되어 있다. 실험 동안, 세포는 다중 큐 세포 배양 기질을 감지하고 부착하며 시간이 지남에 따라 생존 가능한 상태를 유지한다. 도 8의 면역형광 염색에서 알 수 있는 바와 같이, 세포는 주로 피브로넥틴 라인 상에서 초점 부착(빈큘린 클러스터)을 형성한다.
이러한 세포 배양 물질을 사용하는 또 다른 예시적인 연구는 최근 우리 그룹48에 의해 출판되었다. 본 연구에서, 인간 근섬유아세포와 내피 세포는 접촉 안내 단서와 기하학적 지형의 조합을 실시하였다. 생체 내에서, 두 유형의 세포 모두 인간 혈관 구조에서와 같은 천연 조직에서 곡률 및 접촉 유도 신호를 경험합니다. 세포를 두 가지 환경 단서가 결합된 환경에 시험관 내에서 적용함으로써, 생체내 상황을 되짚어볼 수 있고, 세포 거동에 대한 미세환경의 역할에 대한 더 깊은 이해를 제공한다. 인간 근섬유아세포는 오목한 원통형 기질(48) 상의 접촉 안내 단서(평행 피브로넥틴 라인)와 정렬하는 것으로 나타났다. 그러나 곡률이 증가하는 볼록한 구조에서는 기하학적 단서가 생화학 적 단서를 무시하여 근섬유아세포가 곡률의 정도와 기호를 모두 감지 할 수 있음을 시사합니다. 흥미롭게도, 내피 세포는 오목한 다중 큐 기질에만 부착 할 수 있었고 볼록한 PDMS 기질에는 부착 할 수 없었습니다. 오목한, 단백질-패턴화된 기질 상에서, 내피 세포는 접촉 안내 큐의 방향으로 배향된다. 이 기본적인 시험관 내 지식은 혈관 조직 공학 분야에서 생리적 관련성을 가지며 궁극적으로 스마트 조직 공학 구축물의 설계에 도움이 될 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig01.jpg"> 그림 1: 3D 세포 배양 기질에 접촉 유도 신호를 적용하는 실험 타임라인. 먼저, 양성 세포 배양 칩은 다양한 기하학적 구조를 함유하는 네거티브 PDMS 주형으로부터 생산된다. 경화되지 않은 PDMS를 주형에 붓고 65°C에서 3시간 동안 경화시킨다. 이어서, PDMS를O2-플라즈마로 처리하고, 세포 배양 기질의 표면을 부동태화시키기 위해 PLL 및 mPEG-SVA (파란색, 표지된)와 함께 인큐베이션한다. 세척 후, 기판은 광개시제 액적(PLPP, 녹색, 라벨링됨)에서 거꾸로 뒤집히고 LIMAP 접근법을 사용하여 UV-포토패터닝된다. 여기서, 사용자 정의 패턴을 갖는 디지털 마스크는 정의된 위치에서 패시베이션 층을 절단하는데 사용된다. 다음으로, 단백질 용액 (적색, 라벨링)이 인큐베이션 될 수 있고 패시베이션 층이 제거 된 위치에만 부착됩니다. 기질에 시딩된 세포는 기하학적 구조와 단백질 패턴 모두를 겪게 되며, 이는 생체 내 모방 환경에서 복잡한 세포 거동 에 대한 연구를 가능하게 한다. 약어: PDMS = 폴리디메틸실록산; mPEG-SVA = 메톡시폴리에틸렌 글리콜-숙신이미딜 발레레이트; PLPP = 4-벤조일벤질트리메틸암모늄 클로라이드; LIMAP = 단백질의 광유도 분자 흡착. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig02.jpg"> 그림 2: 3D 세포 배양 기질의 생산 및 패시베이션 동안의 상이한 단계. 네거티브 유리 몰드 (1)는 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어로 설계되었으며 펨토 초 레이저 직접 쓰기 기술을 사용하여 생산됩니다. 이 주형은 중간 양성 PDMS 칩 (2) 및 네거티브 PDMS 몰드 (3)를 생산하는데 이용되며, 이는 이어서 최종 세포 배양 칩 (4)을 생산하는데 사용된다. 약어: PDMS = 폴리디메틸실록산. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig03.jpg"> 그림 3: 두 패터닝 방법의 개략적인 그림. 왼쪽: UV-포토패터닝은 단일 초점면과 패턴을 사용하여 더 작은 피처(약 하나의 DMD)에서 수행됩니다. 결과적으로 전체 기능은 한 번에 패턴화됩니다. 오른쪽: 더 큰 피쳐가 사용되는 경우(DMD보다 큼) 패터닝이 여러 초점면과 패턴으로 나뉩니다. 약어 : DMD = 디지털 미러 장치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig04.jpg"> 도 4: 정상 및 건조된 단백질-인큐베이션된 기질의 전형적인 예. 정상 및 건조된 단백질-인큐베이션된 기질의 최대 강도 투사(XY) 및 직교 뷰(XZ). 단백질 용액으로 인큐베이션한 후 패턴화된 세포 배양 기질을 세척할 때, 샘플을 항상 젖은 상태로 유지하는 것이 중요하다. 패턴이 특징 상의 모든 이미지에서 동일하지만(ĸ=1/1,000 μm-1), 젤라틴-플루오레세인(녹색) 응집체는 샘플을 몇 초 동안 건조시키도록 방치했을 때 큰 덩어리를 형성한다. 샘플이 항상 젖은 상태로 유지되면 올바른 단백질 패턴을 관찰 할 수 있습니다. 배율 막대 = 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig05.jpg"> 그림 5: 시드 후 밝은 필드 이미지. 1차 각질세포(왼쪽) 및 진피 섬유아세포(오른쪽)를 3D 기하학적 특징(ĸ = 1/1,000 μm-1의 오목한 구덩이 및 ĸ=1 /500, 1/375, 1/250, 1/175 및 1/125 μm-1의 반실린더)에 시딩한 후 4시간 동안 시딩하였다. 왼쪽 위 삽입은 지오메트리의 패터닝에 사용되는 선 패턴을 나타냅니다. 흰색 화살표는 이미 정렬을 보여주는 확산 세포를 나타냅니다. 배율 막대 = 250μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig06.jpg"> 그림 6: 오목한 구덩이에서의 원형 패턴의 특성화. (A) LIMAP(선폭: 20μm, 간격폭: 20μm)을 사용하여 패턴화하고 젤라틴-플루오레세인(녹색)과 함께 인큐베이션한 오목한 구덩이(ĸ = 1/250 μm-1)의 최대 강도 투영(XY) 및 직교도(XZ)를 포함한다. 흰색 선을 따른 강도 프로파일은 거리에 대해 플롯되어 일관된 패턴 품질과 해상도를 보여줍니다. (B) ĸ = 1/1,000 μm-1 및 ĸ = 1/3750 μm-1의 오목한 구덩이에서 수행된 추가 패터닝은 패터닝에 사용될 수 있는 기하학적 특징의 측면에서 유연성을 보여준다. 다시 말하지만, 최대 강도 투영(XY)과 직교 뷰(XZ)가 모두 시각화됩니다. 배율 막대 = 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig07.jpg"> 그림 7: 패턴화된 구조물의 3D 현미경 데이터. 3D 렌더링 소프트웨어를 사용하여 시각화된 광패터닝 및 세포 배양 후 3D 패턴화된 세포 배양 물질의 전형적인 예. (A) 10 μm 폭 라인(로다민-피브로넥틴, 적색) 및 10 μm 폭 틈새로 패턴화된 볼록 세미실린더. 스케일 바 = 5 μm. (B) F-액틴(녹색)에 대해 염색된 진피 섬유아세포는 20 μm 넓은 라인(로다민-피브로넥틴, 적색) 및 20 μm 넓은 틈새로 패턴화된 오목한 세미실린더 상에서 배양하였다. 스케일 바 = 5 μm. (C) 20 μm 와이드 라인(로다민-피브로넥틴, 레드) 및 20 μm 와이드 갭으로 패턴화된 안장 표면. 스케일 바 = 5 μm. (D) 20 μm 폭 라인(젤라틴-플루오레세인, 녹색)과 20 μm 폭 간격의 동심원으로 패턴화된 오목한 구덩이. 인간 각질세포의 F-액틴 세포 골격은 팔로이드인을 사용하여 염색되고 적색으로 가시화된다. 배율 막대 = 200μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig08.jpg"> 도 8: 광패턴화된, 오목한 반실린더 상의 인간 진피 섬유아세포의 면역형광 염색. (A) 오목한 반실린더 상에서 24시간 동안 배양된 인간 진피 섬유아세포의 최대 강도 돌기(XY) 및 직교 절편(XZ 및 YZ)을 패턴화된(피브로넥틴 라인, 적색, 5 μm 폭, 및 5 μm 갭) 상에서 배양하였다. 세포는 F-액틴 (자홍색), 빈큘린 (녹색) 및 핵 (파란색)에 대해 염색됩니다. 스케일 바 = 100 μm. (B) 멀티큐 환경에 부착되는 셀의 줌인. 배율 막대 = 50μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig09.jpg"> 그림 9: 패턴화된 오목한 실린더 상의 인간 진피 섬유아세포의 브라이트필드 타임랩스 이미지. 오목한 반실린더 (ĸ = 1/250 μm-1)를 평행선 (5 μm 폭 및 5 μm 갭)으로 패터닝하고, 세포 시딩 전에 로다민-피브로넥틴과 함께 인큐베이션하였다. 타임랩스 이미징은 초기 세포 시딩 후 1시간 후(왼쪽, 0분) 시작되며, 세포가 여전히 둥글고 부착되지 않은 경우(화살표). 대략 24 h (중간, 1,420 분) 후에, 세포는 멀티큐 기판에 부착되고 접촉 안내 패턴에 따라 정렬 반응을 나타낸다. 정렬 반응 및 세포 생존력 모두는 전체 배양 기간 (오른쪽, 3,180 분)에 걸쳐 유지된다. 배율 막대 = 200μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig09large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 1: 3D 원통형 기판의 패턴 예제. 로다민-피브로넥틴(적색)으로 패턴화된 볼록한 실린더의 3D 표현. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%201.zip" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 2: 패턴화된 3D 원통형 기질 상에서 배양된 진피 섬유아세포의 3D 표현 (ĸ = 1/500 μm-1). 진피 섬유아세포를 볼록한 반실린더(피브로넥틴 라인, 적색, 10 μm 폭, 및 10 μm 갭) 상에서 24시간 동안 배양하였다. 세포는 F-액틴 (자홍색), 빈큘린 (녹색) 및 핵 (파란색)에 대해 염색됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%202.zip" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 3: 패턴화된 3D 피트 상에서 배양된 인간 각질세포의 3D 표현 (ĸ = 1/3,750 μm-1). 오목하고 패턴화된 구덩이(젤라틴 원, 녹색, 20μm 폭, 및 20μm 갭)에서 24시간 동안 배양된 인간 각질세포의 3D 표현. 세포는 F-액틴(적색)에 대해 염색된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%203.zip" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 4 : 패턴화되고 오목한 실린더에서 인간 진피 섬유 아세포의 브라이트 필드 타임랩스 이미징. 오목한 반실린더 (ĸ = 1/250 μm-1)를 평행선 (5 μm 폭 및 5 μm 갭)으로 패터닝하고, 세포 시딩 전에 로다민-피브로넥틴과 함께 인큐베이션하였다. 타임랩스 이미징은 초기 세포 시딩 후 1시간 후에 시작되며, 이때 세포는 멀티큐 환경에 대한 초기 부착을 보인다. 완전한 타임랩스 동안, 세포는 주로 접촉 안내 단서를 따라 방향을 잡는 반면, 세포 생존력은 유지된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%204.zip" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

전통적으로, 세포 배양은 생체 내에서 세포의 자연 환경을 잘 모방하지 못하는 평면 기질에서 수행됩니다. 여기서 우리는 생리적으로 관련된 곡선 기하학과 미세 패턴화 된 세포 외 단백질을 가진 세포 배양 기질을 생산하는 방법을 설명하여 이러한 세포 외 단서의 세포 감지에 대한 체계적인 조사를 가능하게합니다.

삼차원 세포 배양 기질의 UV-광패터닝에 의한 다큐 세포 미세환경 생성

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand ...

세포 행동에 대한 미세 환경 요인의 영향은 종종 단일 단서를 분리하는 지나치게 단순화 된 in vitro 플랫폼을 사용하여 연구됩니다. 우리의 접근 방식은 이러한 여러 단서를 결합하는 세포 배양 기질을 만듭니다. 이 접근법은 매우 다재다능하며 다양한 세포 배양 물질, 접촉 유도 패턴, 세포 판독 및 단백질을 사용하여 체계적인 연구를 가능하게합니다.이 절차는 우리 실험실의 두 PSE 후보자가 시연합니다. CAS VAN DER PUTTEN, MIRKO D'URSO 먼저, 관심있는 모든 기능을 포함하는 펨토초 레이저 직접 오른쪽 기술을 사용하여 네거티브 유리 몰드를 만듭니다. 그런 다음 페트리 접시 바닥에 음극 유리 몰드를 조심스럽게 놓고 폴리디메틸실록산 프리 폴리머를 네거티브 유리 몰드 위에 부어 완전히 덮습니다.이 페트리 접시를 진공 데시케이터에 넣고 진공 펌프를 시작합니다. 진공이 달성되면 5분 동안 기다렸다가 금형 표면과 폴리디메틸실록산 프리폴리머 사이의 계면에 존재하는 모든 기포를 제거합니다. PDMS 프리폴리머를 섭씨 65도의 오븐에서 밤새 경화시킵니다.경화 후 주걱을 사용하여 PDMS의 가장자리를 들어 올립니다. 음극 유리 몰드에서 새로 경화된 포지티브 PDMS 칩을 제거하고 포지티브 PDMS 칩이 네거티브 유리 몰드에 달라붙는 경향이 있는 경우 들어 올리면서 임프린트 가장자리에 에탄올 또는 물을 추가합니다. 그런 다음 포지티브 폴리디메틸실록산 칩을 실란화제 방울이 있는 작은 바이알 옆의 데시케이터에 넣고 칩을 밤새 진공 상태로 둡니다.PDMS 프리 폴리머를 네거티브 PDMS 몰드에 부어 5mm 두께의 여러 세포 배양 칩을 생성합니다. 다음으로 데시케이터를 사용하여 기포를 제거하고 섭씨 65도에서 3시간 동안 경화합니다. 면도날을 사용하여 칩을 최종 크기로 자르고 칩을 실온에서 보관하십시오. 핀셋을 사용한 기판 패시베이션의 경우 칩을 플라즈마 Asher의 바구니에 넣으십시오.그런 다음 산소 플라즈마를 사용하여 칩 표면의 수산기를 활성화하고 질소를 사용하여 애싱 챔버를 배출합니다. 바구니에서 칩을 꺼내 작은 폴리디메틸실록산 용기에 넣습니다. 이제 파스퇴르 피펫을 사용하여 칩 상단에 500마이크로리터의 Poly-L-라이신을 추가하여 표면을 용액에 완전히 담그고 실온에서 30분 동안 배양합니다.이어서, 피펫으로 세포 배양 칩으로부터 450 마이크로리터의 Poly-L-lysine을 제거한다. 다음으로, 칩 표면을 500 마이크로 리터의 0.1 몰 HEPES 버퍼로 헹굽니다. 샘플 건조를 방지하기 위해 폴리디메틸실록산 칩에 소량의 액체를 남겨 최종 패턴 품질을 유지합니다.사용 직전에 세포 배양 칩 당 0.1 몰 힙 버퍼에 밀리리터 당 50 밀리그램의 메 톡시 폴리에틸렌 글리코 시아 나미 달 발레 레이트 용액 500 마이크로 리터를 준비하고 60 분 동안 샘플을 배양합니다. 마이크로 피펫을 사용하여, 450 마이크로리터의 메톡시 폴리에틸렌 글리코시아나미달 발레레이트 용액을 제거한다. 칩 표면을 PBS로 5회 피펫팅 안팎으로 세척합니다.결합되지 않은 모든 mPEG-SVA를 제거합니다. 형광등 형광펜이 있는 유리 슬라이드를 현미경의 광학 경로에 놓습니다. 현미경에서 형광 모드로 전환하고 프리모 이미지의 초점을 조심스럽게 맞추어 로고와 텍스트에 모두 초점이 맞춰지도록 합니다.다음을 클릭하면 교정 데이터와 패턴을 확인하여 교정 절차를 마칠 수 있습니다. 교정할 때 스테이지의 Z 위치를 기록하고 이 위치를 나중에 프로토콜의 참조로 사용합니다. 스테이지로부터 보정 슬라이드를 꺼낸 후 상기 광개시제의 액적이 들어 있는 유리 슬라이드를 상기 스테이지 위에 놓고 PDMS 세포 배양 기판을 거꾸로 놓은 후, 상기 광개시제 액적에 놓는다.세포 배양 기판 표면의 3D 특징이 유리 슬라이드를 향하고 광 개시제에 완전히 잠겨 있는지 확인하여 적절한 패터닝을 보장합니다. 볼록 또는 오목한 구조의 상단 또는 하단에 각각 초점을 맞추고 원고에 설명 된대로 올바른 위치에있는 칩 영역에 초점을 맞 춥니 다. 기능에 따라 패터닝 설정을 조정하고 밀리리터당 1000밀리줄의 용량을 선택합니다.화면 오른쪽 하단의 재생 버튼을 클릭하여 패터닝을 시작합니다. 완료되면 녹색으로 표시된 패턴을 관찰하십시오. 마이크로 피펫을 사용하여 20 밀리리터의 PBS를 20 마이크로 그램의 로다민 표지 된 피브로넥틴 바이알에 추가하여 밀리리터 당 10 마이크로 그램의 농도를 얻습니다.단백질 덩어리를 피하고 빛으로부터 보호하기 위해 부드럽게 피펫하십시오. 마이크로피펫을 사용하여, 200 내지 500 마이크로리터의 단백질 용액을 세포 배양 칩에 첨가한다. 선택한 단백질에 따라 배양 시간과 온도를 조정하고 샘플을 덮으십시오.단백질 용액을 제거하고 칩을 500 마이크로리터의 멸균 PBS로 5회 세척한다. 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 세포 배양 칩의 모든 관련 기능 위에 PBS를 위아래로 여러 번 피펫팅해야 합니다. 세포 현탁액이 준비되면 PBS를 제거하고 세포 현탁액 1 밀리리터를 칩에 첨가합니다.그런 다음 섭씨 37도에서 60 분 동안 배양하십시오. 패턴 세포 배양 칩 상의 세포의 부착성을 명시야 현미경으로 확인하였다. 선 패턴의 경우 길쭉한 세포 형태를 찾으십시오.그리고 세포가 패턴화된 영역 외부에 부착되기 시작하면 기질의 세포 바로 위에서 배지를 위아래로 피펫팅하여 제거합니다. 염색 후 염색된 샘플을 유리 슬라이드의 PBS 방울에 거꾸로 놓습니다. 그런 다음 필요한 디테일 수준에 따라 적절한 이미지 획득을 보장하기 위해 적절한 대물렌즈와 Z 간격으로 Z 스택을 만듭니다.3D 렌더링 소프트웨어를 사용하여 Z 스택의 3D 렌더링을 생성합니다. 단백질의 광 유도 분자 흡수를 사용하여 오목한 피트를 패턴화하고 최대 강도 투영 및 직교도를 시각화했습니다. 강도 프로파일은 패턴화된 영역과 패턴화되지 않은 영역 사이의 높은 패턴 분해능의 날카로운 전환과 일관된 단백질 강도를 보여주었습니다.단일 초점면과 2 및 3 초점면 방법을 사용한 패터닝은 특징 위에 패턴의 완벽한 정렬을 보여주었습니다. 오목한 반 실린더, 볼록한 반 실린더, 안장 표면 및 PID는 다양한 너비의 선 또는 동심원을 사용하여 패턴화되었습니다. 인간 각질 세포의 골격 내부의 영향은 엽면을 사용하여 염색되고 시각화됩니다.진피 섬유아세포를 패턴화된 오목한 세미 실린더 상에서 배양하고 시각화하였다. 세포는 다중 큐 세포 배양 기질을 감지하고 부착했으며 F-액틴, 빈쿨린 및 핵에 의해 시각화된 대로 시간이 지남에 따라 생존 가능한 상태를 유지했습니다. 또한, 세포는 주로 피브로넥틴 라인에 초점 유착을 형성했다.로다민 피브로넥틴의 존재하에 패턴화된 오목한 실린더 상에서 배양된 인간 진피 섬유아세포는 다중 큐 기질에 부착되고 접촉 유도 패턴에 따라 정렬 반응을 보였다. 정렬 반응 및 세포 생존율은 전체 배양 기간 동안 유지됩니다. 이 프로토콜을 수행 할 때 가장 중요한 것은 세포 배양 칩의 표면이 마르는 것을 방지하는 것입니다.다양한 기질 재료, 단백질 코팅 및 세포 유형을 사용하려면 추가 최적화가 필요할 수 있습니다. 3D로 여러 환경 신호를 제공하면 복잡한 엔지니어 조직에서 세포 조직을 조정할 수 있는 새로운 가능성이 열릴 수 있습니다.

generation-multicue-cellular-microenvironments-uv-photopatterning

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

수성 2 단계 시스템은 세포 동시에 패턴 여러 사람들에게 사용되었습니다. 세포 패터닝을위한이 빠르고 쉬운 방법은 dextran과 폴리에틸렌 글리콜 및 두 개의 폴리머 솔루션 사이에 존재 계면 장력의 수성 솔루션의 위상 분리의 장점을 걸립니다.

수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

우리는 수성 환경에서 골격 표면의 세포 친화도를 수정하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 이산화 티타늄 광촉매를 이용하여 광조사된 영역에서 유기 필름을 분해합니다. 우리는 그것이 현장 및 현장 모두에서 스캐폴딩 단백질의 미세 도메인을 생성하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.

산화 티타늄을 사용하여 수성 환경에서 단백질과 세포를 포토 패터닝<sub&gt; 2</sub&gt; 광촉매

다음 프로토콜은 2차원(2D)과 3차원(3D) 세포 환경 사이의 중간 단계로 사용할 샌드위치와 같은 배양을 조립하는 절차를 설명합니다. 엔지니어링된 시스템은 현미경 검사, 생체 역학, 생화학 및 세포 생물학 분석에 적용할 수 있습니다.

샌드위치 같은 미세 환경은 셀 / 재료의 상호 작용을 활용하는

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 차별화 별개의 조직 패턴으로 자기 조직하는 고유 능력을 가지고; 이 공간 환경 그라데이션의 표현을 필요로하지만. 우리 hPSC 분화 패턴을 제어하기위한 생화학 적 및 기계적 그라디언트를 생성하는 간단하고 강력한 방법으로서 공판 미세 패턴을 제시한다.

차별화 운명의 공간 조직을 프로빙에 대한 인간 다 능성 줄기 세포의 스텐실 미세화

우리는 3차원 세포 배양 응용을 위한 합성 하이드로겔 매트릭스의 광 매개 형성 및 후속 생화학적 패터닝을 위한 순차적 프로세스를 설명합니다. 세포 적합성 photoclick chemistry를 가진 하이드로겔의 구성 및 변형이 입증되었습니다. 또한 패턴을 정량화 및 관찰하고 이러한 하이드로겔 내에서 세포 생존력을 결정할 수 있는 손쉬운 기술이 제시됩니다.

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이 문서에서는 물리와 화학의 높은 처리량 조작 신호 세포 microenvironments vivo에서 흉내 낸 고을 다중화 인공 세포 MicroEnvironment (MACME) 배열 준비 하 상세한 방법론 단일 셀 프로 파일링 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)를 위한 최적의 휴대폰 환경을 식별 합니다.

멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작

우리는 반복 패턴 형성을 얻기 위해 3 차원 기질에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 절차를 제시. 포함 하는 두 개의 다른 hydrogels 입방 장치 다 방향 영상 조직 패턴 형성에 대 한 달성 하기 위해 채택 된다.

반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어

여기에 제시된 방법은 포유류 문화 내에서 공간 조직을 드러내기 위하여 양적 화상 진찰과 함께 마이크로 패터닝을 이용합니다. 이 기술은 표준 세포 생물학 실험실에서 확립하기 쉽고 시험관 내에서 패터닝을 연구할 수있는 견인 시스템을 제공합니다.

마이크로패턴과 정량적 이미징을 사용하여 포유류 세포의 응급 공간 조직 매핑

이 프로토콜은 생물 공학 적 배경이 제한된 사람들이 간단하고 접근 할 수있는 리소 그래피프리 마이크로 패터닝 방법을 소개합니다. 이 방법은 세포 형태를 변조하기 위한 관심있는 모양의 마이크로 패턴 세포 외 매트릭스 단백질에 맞춤형 레이저 컷 스텐실을 활용합니다. 미세 패터킹에 대한 절차는 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 입증된다.

레이저 컷 스텐실을 사용한 간단한 리소그래피 없는 단일 셀 마이크로패터닝

여기서는 마이크로머신 마이크로유체 플랫폼을 사용하여 3차원 단순화 및 미분화 피부 모델을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 병렬 흐름 접근법은 주사기 펌프에 의해 제어되는 상피 세포의 파종을 위해 진피 구획의 시상 증착을 허용합니다.

마이크로머신 마이크로유체 플랫폼의 간소화된 3차원 스킨 온-어칩 모델 생성

여기에 제시된 프로토콜은 포유류 세포 내의 세포골격 구조를 연구하기 위하여 세포 모양을 표준화하는 micro패턴의 자동화된 제조를 가능하게 합니다. 이 사용자 친화적 인 기술은 시판되는 이미징 시스템으로 설정할 수 있으며 표준 세포 생물학 실험실에 접근 할 수없는 특수 장비를 필요로하지 않습니다.

적외선 레이저 보조 마이크로패터닝을 통한 세포 지오메트리 제어

배우세요 UV-광패터닝을 활용한 삼차원 세포 배양 기질 제작 방법으로 다큐 세포 미세환경을 생성하는 기술입니다. 이 방법은 생리학적으로 관련성 높은 다양한 세포 유형의 행동을 체계적으로 연구할 수 있는 강력한 플랫폼을 제공합니다.

삼차원 세포 배양 기질의 UV-광패터닝에 의한 다큐 세포 미세환경 생성

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