Name: 측면 소프트 라이트 조명을 통한 대뇌 오가노이드 문화 촉진 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 배우세요 대뇌 오가노이드 배양 및 이전 기술을 측면 소프트 라이트 조명을 활용하여 개선하는 방법을. 이 프로토콜은 iPSC 배양, 신경 유도, 자동화 시스템 설계에 활용됩니다.

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이 연구는 광동성 자연 과학 재단 (보조금 번호 2020A0505100062), 광저우시 과학 기술 핵심 주제 프로젝트 (보조금 번호 201904020025), 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 31872800, 32070582, 82101937), 광저우시 박사후 연구 보조금 프로젝트 (Bangzhu Chen)의 지원을 받았다.

이 프로토콜은 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다. 광저우 의과 대학 세 번째 부속 병원 윤리위원회 (의료 및 윤리 검토 [2021] No. 022)의 승인이 부여되었습니다. 실험 전에, 각 배지는 Juergen A. Knoblich사의 화학식12 (보충 표 1-4)에 따라 제조되거나, 시판되는 대뇌 오가노이드 키트를 사용하였다 ( 표 참조). 이 연구에 사용 된 iPSC는 이전에 우리 실험실에서 설립되었으며 정보에 입각 한 면제를 받았습니다. SCA3-iPSCs는 ATXN3 유전자 13에 26/78 CAG 반복을 보유하는 것으로 유전자형화된31 세 여성 척수 소뇌 운동 실조증 유형 3 (SCA3) 환자로부터 생성되었다 (보충 도 1A). 이전 기사에서 언급된 정상 인간 iPSCs는 NC-iPSCs 14로 선택되었고, ATXN3 유전자는14/14 CAG 반복을 갖는 것으로 확인되었다(보충 도 1B).
1. 유도만능줄기세포(iPSCs)의 제조
<ol><li>자원 봉사자와 환자의 정보에 입각 한 동의하에 정맥 천자에 의해 말초 혈액 3 mL를 수집하십시오.</li>
	<li>Ficoll-Paque 방법15에 따라 말초 혈액 단핵구를 분리한다.</li>
	<li>센다이 리프로그래밍 키트의 프로토콜에 따라 iPSC를 설정합니다( 자료 표 참조).<ol>
<li>iPSCs를 mTeSR1 배지로 배양하여 마트리겔로 덮은 35mm 페트리 접시에 넣는다(기저막 매트릭스, 자료표 참조). 매일 매체를 바꿉니다. iPSC 성장 밀도는 75%를 초과하지 않아야 합니다.</li>
		<li>세포를 PSC 해리 용액 ( 물질 표 참조)으로 소화하고 3-5 일마다 1:5의 비율로 계대 배양하십시오. 주의: 센다이 바이러스는 여기에 사용됩니다. 그것은 생물 안전 캐비닛에서 작동해야하며 자기 보호 조치를 취해야합니다. 현지 국가에서 합법적으로 사용할 수 있는지 여부는 분명해야합니다. 지역 생물 안전 법률 및 규정은 사용 시 엄격하게 준수되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. EB 준비 (0-1 일)
<ol><li>iPSCs로부터 mTeSR1 배지를 피펫으로 제거하고, 1 mL의 1x PBS로 2x 세척하였다.</li>
	<li>PBS를 피펫으로 제거하고, 300 μL의 세포 분리 용액 ( 표 문헌 참조)을 첨가하여 iPSCs를 37°C에서 3-4분 동안 단일 세포로 소화시켰다.</li>
	<li>세포를 2 mL의 EB 형성 배지 (보충 표 1)에 재현탁시킨 다음, 샘플을 300 x g (실온)에서 5분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>특수 24웰 플레이트를 부착 방지 헹굼 용액(500μL/웰)으로 5분 동안 전처리 하십시오(재료 표 참조). 참고 : 부착 방지 헹굼 솔루션은 최적의 EB 및 스페로이드 형성에 필수적입니다.</li>
	<li>세포를 Y-27632 (최종 농도, 10 μM, 물질 표 참조)를 함유하는 EB 형성 배지에 재현탁시키고, 세포 밀도는 1.5 x 106 세포/mL이다.</li>
	<li>부착 방지 헹굼 용액을 제거하고, 2 mL의 EB 형성 배지로 각 웰을 헹구었다.</li>
	<li>세포를 3 x 10 6 셀/웰의 밀도로 특수 24웰 플레이트에 추가합니다(그림 1A, 왼쪽). 참고: 일반적으로 각 웰에 300개의 EB를 준비할 수 있습니다. 이 방법은 동일한 크기의 대량의 EB를 준비 할 수 있습니다.</li>
	<li>플레이트를 실온에서 2분 동안 100 x g 에서 원심분리한다. 플레이트의 바닥에 있는 각 챔버에 세포를 균일하게 분배한다(도 1A, 오른쪽). 참고 : 적절한 원심 분리기가없는 경우 플레이트를 정적 배양을 위해 인큐베이터에 직접 배치 할 수도 있지만 EB 볼의 형성 시간은 정상적인 원심 분리보다 몇 시간 늦습니다.</li>
	<li>샘플을 37°C 및 5%CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 원심분리가 이전 단계에서 사용되지 않은 경우, 36시간 동안 인큐베이션한다. 샘플을 안정적으로 유지하고이 기간 동안 인큐베이터에서 꺼내지 마십시오.</li>
</ol>3. 소프트 라이트 램프의 제조 (1 일째)
<ol><li>A5 용지 크기의 두께가 0.3-0.5cm 인 투명 아크릴 보드를 사용하십시오. 아크릴 판의 앞면과 뒷면에 흰색 패드를 붙여 넣습니다.<ol>
<li>아크릴 플레이트의 측면에서 조명이 들어올 수 있도록 플레이트 가장자리에 LED 백색 조명 행을 설치한 다음 병렬로 쏘아 올립니다(보충 그림 2A-F, 그림 1B). 참고 : 초기 단계의 EB의 직경은 약 200 μm ~ 300 μm이므로 깨끗한 벤치의 형광등 아래에서 육안으로 명확하게 관찰하기가 어렵습니다. 반대로 확산 반사가 향상됨에 따라 측면 조명이 있는 부드러운 빛을 사용하여 EB를 명확하게 감지할 수 있습니다(그림 1B, C). 6웰 플레이트는 후속 실험에서 EB 배양에 권장됩니다. 그러나 부드러운 빛의 시각 효과를보다 잘 보여주기 위해이 연구에서 접시 대신 그림과 비디오를 찍는 데 요리가 사용되므로 오해하지 마십시오. 측면 조명 소프트 라이트 램프는 6 웰 플레이트에도 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. EB 전송 및 중간 교체 (2-5 일)
<ol><li>새로운 6-웰 저접착성 플레이트를 준비하고, 각 웰에 EB 형성 배지 2 mL를 첨가한다.</li>
	<li>1000μL 와이드 보어 피펫 팁( 재료 표 참조)으로 배지와 함께 EB를 제거하고 6웰 저접착 플레이트(~100EB/웰)로 옮깁니다. 참고: 작동 프로세스는 EB를 더 쉽게 관찰할 수 있도록 소프트 라이트 램프(3단계에서 언급)를 채택합니다. 다른 실내 광원을 끄면 부드러운 빛의 시각 효과를 높일 수 있습니다.</li>
	<li>매일 같은 양의 신선한 EB 형성 배지로 교체하십시오. 보조 흐름을 사용하여 EB를 중앙에 모으고 매체를 변경합니다.<ol>
<li>우물의 가장자리로 천천히 피펫팅하여 오래된 매체를 흡인하십시오. 너무 열심히 빨지 마십시오. 그렇지 않으면 EB가 함께 제거됩니다. 그런 다음 새 매체를 추가하여 EB를 다시 일시 중단합니다. 참고: 원리 보조 흐름(그림 1D). 접시를 원형 궤도를 따라 회전시켜 소용돌이 흐름을 유도하십시오. 소용돌이 흐름으로 인해 이차 흐름이 중심을 향하도록 유도됩니다. EB 또는 오가노이드는 회전을 통해 생성된 이차 흐름으로 인해 웰의 중심으로 수렴되며, 그 후에 배지 변화 또는 배아 전달이 쉽게 실행될 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 다능성 마커 OCT4로 라벨링하여 다능성 확인 (4일째)
참고: EB의 직경이 300μm보다 크면 OCT4 마커 면역형광 염색을 위해 여러 EB를 취하여 다능성을 검출하십시오.
<ol><li>EBs를 4°C에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드에 고정시키고, 1x PBS에서 3x로 세척하여 매번 10분 동안 3배로 세척하였다.</li>
	<li>EBs를 2시간 동안 0.3% 트리톤 X-100 및 3% BSA를 함유하는 실온 PBS로 옮기고, 매번 10분 동안 PBS 3x로 세척하였다. 참고: Triton X-100으로 처리한 후 EB는 액체 표면에 떠 다니며 청소하는 동안 액체로 쉽게 빨아들일 수 있습니다. 입체 현미경으로 조작하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>OCT4 일차 항체 ( 표 참조)를 1:200의 비율로 1% BSA를 함유하는 1x PBS 1 mL로 희석하고, 4°C에서 밤새 인큐베이션하기 위해 EBs를 첨가한 다음, 매번 10분 동안 PBS 3x로 세척한다.</li>
	<li>각각의 이차 항체 ( 물질 표 참조)를 1:500에서 1x PBS로 희석하고 EBs에 1 mL를 첨가한다.</li>
	<li>실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 1x PBS 3x로 10분 동안 각각 세척하였다.</li>
	<li>PBS를 제거하고, 1 μg/mL DAPI를 함유하는 1x PBS 용액 2 mL를 첨가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 다음, 매번 10분 동안 PBS 3x로 세척한다.</li>
	<li>소량의 액체를 함유하는 EB를 슬라이드 상으로 옮기고, 가장자리에 시판되는 석유 젤리로 코팅된 커버 글라스(표 표 참조)로 슬라이드를 밀봉한 다음, 형광 공초점 현미경으로 이미지를 관찰하고 수집한다. 참고: OCT4 발현은 EB 다능성12를 나타낸다. OCT4의 발현이 90 % 미만이면 EB를 폐기하고 EB를 다시 준비해야합니다.</li>
</ol>6. 신경 유도 (5-7 일)
<ol><li>낮은 접착력을 가진 새로운 6-웰 플레이트를 준비하고, 각 웰에 3 mL의 신경 유도 배지 (보충 표 2)를 첨가한다.</li>
	<li>측면 소프트 라이트(3단계에서 언급)를 켜고 다른 실내 광원을 끕니다.</li>
	<li>EB를 신경망 유도 매체(~100EB/웰)가 추가된 6웰 플레이트로 옮깁니다. 원래 매체를 가능한 한 적게 새 우물에 추가하십시오. 참고 : 오가노이드 전송의 간단한 기술을 소개합니다. 당연히, 중력 하에서, 그리고 매질보다 상대적으로 더 높은 밀도로, 재현탁된 EB는 그림 1E에 도시된 조작을 적용함으로써 점차적으로 가라앉을 것이다. 따라서 EB를 편리하게 전송할 수 있습니다. EBs에 비해, 자유 세포 및 죽은 세포 단편은 더 느리게 가라앉기 때문에, 대부분의 자유 세포 및 죽은 세포 단편은 따라서 이러한 침전 방법을 통해 제거될 수 있다(도 1F).</li>
	<li>샘플을 37°C 및 5%CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 참고 : 현미경 하에서, EBs의 직경은 약 500 μm이었고, 가장자리는 반투명하여 신경 상피층이 형성되었음을 나타냅니다.</li>
	<li>다음 단계로 진행합니다.</li>
</ol>7. 기저막 매트릭스에 임베딩 (7-10 일)
<ol><li>멤브레인 매트릭스를 4°C 냉장고에 미리 60분 동안 놓고 용해시킨다. 필요한 행렬의 양을 미리 계산하십시오. 약 100개의 EB가 1.5mL의 멤브레인 매트릭스에 포매되었다.</li>
	<li>측면 소프트 라이트를 켜고 본체 상단의 광원을 끕니다.</li>
	<li>응고를 방지하기 위해 멤브레인 매트릭스를 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	<li>매번 소량의 EB를 신선한 팽창 배지가 들어있는 60mm 접시에 옮기십시오 (보충 표 3). 단일 EB를 더 쉽게 제거할 수 있도록 EB 수를 줄입니다.</li>
	<li>그런 다음 새로운 6-웰 저접착 플레이트를 사용하십시오. 매번 단일 EB (약 10 μL 배지 포함)를 200 μL 와이드 보어 피펫 팁 ( 재료 표 참조)으로 흡입 한 다음 6-웰 플레이트의 바닥에 첨가하여 액적을 만듭니다. 우물 당 다섯 방울을 사용하십시오. 참고: 핵심은 피펫 건(pipette gun)의 범위를 50μL로 조정하고 EB를 빨아들인 다음 그림 1E의 작동을 참조하는 것입니다. EB가 피펫 팁의 보어에 정착하면 팁이 플레이트의 웰 바닥에 빠르게 닿아 약 10μL의 액체를 밀어 액적을 형성합니다.</li>
	<li>15 μL의 멤브레인 매트릭스를 EB를 함유하는 각 방울에 첨가하고 신속하게 혼합한다. EB 볼을 물방울 중앙에 끼워 넣습니다. 참고: EB는 EB를 손상시키는 표준 피펫 팁으로 흡입되어서는 안 됩니다. 대신 200μL 와이드 보어 피펫 팁을 사용해야 합니다.</li>
	<li>6-웰 플레이트를 30분 동안 37°C 인큐베이터에 넣고, EBs를 함유하는 막 매트릭스 액적을 응고시킨다.</li>
	<li>확장 배지 3mL를 각 웰에 넣고 매트릭스 내장 EB를 부드럽게 날려 현탁시킵니다.</li>
	<li>3일 동안 37°C 및 5%CO2 에서 인큐베이션한다. 참고 : EB의 표면에서 싹이 트면 확장 된 신경 상피가 형성되었음을 의미합니다16.</li>
</ol>8. 오가노이드 성숙 (10-40 일)
<ol><li>원래 배지를 부드럽게 제거하고, 3 mL의 성숙 배지 (보충 표 4)를 각 웰에 첨가한다.</li>
	<li>오가노이드 플레이트를 37°C 인큐베이터의 수평 진탕기 상에 놓는다.</li>
	<li>문화권을 수평으로 계속 회전시킵니다. 셰이커를 적절한 속도로 설정하십시오. 참고 : 6 웰 플레이트에서 대뇌 오가노이드를 배양 할 때 수평 쉐이커 제조업체에 따르면 0.11808 x g의 상대 원심력 (RCF)이 더 적합합니다 (재료 표 참조). 상대 원심력과 회전 속도17,18 사이의 변환에 따르면, RCF = 1.118 x 10-5 × R × rpm 2, 여기서 RCF = 상대 원심력 (g), rpm = 분당 회전 (r / min) 및 R = 회전 반경 (cm), 흔들림 던지기라고도합니다. 다른 쉐이커의 흔들림 던지기 매개 변수는 다를 수 있습니다. 따라서, 회전 속도는 rpm = 299 x (RCF/R)1/2인 것으로 추정될 수 있다.</li>
	<li>2-3 일마다 신선한 성숙 배지를 교체하십시오.</li>
	<li>20-30 일 후, 점차적으로 성숙하기 위해 대뇌 오가노이드를 배양하십시오. 참고: 이 기간 동안 오가노이드는 신경 마커 검출 및 전사체 시퀀싱19,20,21과 같은 실험 및 검출에 사용될 수 있습니다.</li>
</ol>9. 냉동 절편과 대뇌 오가노이드의 면역형광
<ol><li>오가노이드를 4°C에서 16시간 동안 4% 파라포름알데히드에 고정시킨 다음, 이를 10분 동안 1x PBS로 3배 세척하였다.</li>
	<li>PBS를 제거하고, 오가노이드를 4°C에서 하룻밤 동안 30% 수크로오스에 침지시켰다.</li>
	<li>오가노이드를 37°C에서 1시간 동안 10%/7.5% 젤라틴/수크로오스에 내장한 다음, 이를 임베딩 몰드로 신속하게 옮깁니다.</li>
	<li>드라이 아이스를 100 % 에탄올에 첨가하여 드라이 아이스 / 에탄올 슬러리를 준비하고 오가노이드 샘플을 넣어 빠르게 동결시킵니다.</li>
	<li>냉동된 샘플을 -80°C 냉동고에 보관한다. 필요한 경우 두께가 20μm인 냉동 단면을 만듭니다.</li>
	<li>단계 5.3.-5.5를 참조하십시오. 면역 형광을 위해. PAX6 항체를 사용하여 정점 전구 세포를 표지하고, TUJ1 항체 (물질 표 참조)를 사용하여 신경 세포22,23,24를 표지하고, DAPI를 핵 DNA 염색에 표지한다.</li>
</ol>

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대뇌 오가노이드는 의학 연구를위한 새로운 길을 열어줍니다. 이 기술의 많은 유용한 응용은 단지 탐구되기 시작했다28. 이 연구는 유전적으로 병든 대뇌 오가노이드와 정상 뇌 오가노이드의 전사체 시퀀싱 결과가 질병과 건강의 차이를 반영할 수 있음을 발견했다. 예를 들어, RNA-seq 데이터 분석 결과(도 3B)는 SCA3 질환 29,30,31,32에 대한 많은 보고된 연구와 일치한다. 중간 변화, EB 전달 및 포장과 같은 실험 작업은 대뇌 오가노이드를 배양하고 균일 성이 좋은 오가노이드를 준비 할 수 있는지 여부를 결정하는 데 중요합니다33,34</su...

2차원(2D) 배양 시스템과 비교하여, 3차원(3D) 배양 시스템은 특정 장기의 복잡한 구조의 진정한 복제 및 효율적인 재생을 포함하여 몇 가지 장점을 갖는다1. 따라서 대뇌 오가노이드는 인간 뇌 발달 및 질병2, 약물 스크리닝 및 세포 치료의 연구 분야에서 중요한 보조 방법 중 하나입니다.
회전 현탁액 방법에 의해 대뇌 오가노이드를 배양하는 것은 그들의 발달과 성숙에 도움이됩니다3. 대뇌 오가노이드 배양 시스템은 큰 성공을 거두었지만 여전히 적용을 제한하는 중대한 도전에 직면 해 있습니다. 예를 들어, 수동 재배는 복잡한 조작 단계를 포함하며 대규모 응용 프로그램을 달성하는 데 장애물을 초래합니다. 또한, 대뇌 오가노이드 배양의 각 발달 단계에서, 상이한 배지 및 사이토카인의 변화가 필요하다4. 그러나 초기 단계에서 오가노이드 또는 EB는 작은 크기 (약 200 μm ~ 300 μm)를 가지며 적절한 장치 없이는 거의 시각적으로 접근 할 수 없습니다. 필연적으로, 일정량의 귀중한 오가노이드 샘플은 배지가 변경될 때 플러시됩니다. 다른 종류의 오가노이드 배양에서 이것을 극복하기 위해 많은 기술이 탐구되었으며, 일부 예에는 개입없이 3 일 동안 전체 오가노이드 칩을 배양 배지에 침지하는 것이 포함됩니다5; 오래된 배지가 흡수성 종이를 사용하여 흡수된 후에 커버슬립을 통해 신선한 배지를 첨가하는단계(5); 또는 유체 교환을 위해 복잡한 미세 유체 파이프 라인을 적용 6,7,8. 오가노이드 재배의 초기 단계에서 직면 한 또 다른 장애물은 육안으로 직접 관찰을 달성하기가 어렵 기 때문에 오가노이드 전달 단계 중에 오가노이드 손상 및 손실을 초래하는 불량한 작동을 유발할 수 있습니다. 따라서, 오가노이드를 생성하기 위해 중간 변화 및 오가노이드 전달을 용이하게하는보다 실현 가능한 프로토콜을 수립 할 필요가있다.
이러한 문제를 극복하기 위해 엔지니어링 원칙에 기반한 해당 최적화 된 작업이 제안되어 많은 오가노이드 절차가 상당히 편리하게 용이합니다. 자연에서 태양이 창문 틈을 통해 집에 비추면 육안으로는 광선에서 춤추는 먼지를 볼 수 있습니다. 먼지에 햇빛이 확산되어 반사되기 때문에 일부 빛은 안구로 굴절되어 시각적 이미지를 생성합니다. 이 현상 9,10의 원리에서 영감을 얻은 이 연구는 부드러운 조명 램프를 만들고 EB를 옆으로 비췄습니다. EB는 시야 범위에 영향을 미치지 않고 시각적으로 명확 할 수 있음을 발견했습니다. 중심을 가리키는 이차 흐름은 와류(11)로 인해 배양 플레이트를 회전시킴으로써 액체에서 생성된다. 원래 분산된 EB는 플레이트의 중앙에 축적됩니다. 이를 바탕으로, 오가노이드의 침강 속도가 세포의 침강 속도보다 빠르다는 현상이 있으며, 원심분리 없이 배지 변경 및 오가노이드 이송이 용이한 조작방법이 제안된다. 배양 배지 내의 오가노이드는 이러한 전달 조작을 통해 자유 세포 및 죽은 세포 단편으로부터 효과적으로 분리될 수 있다.
여기서, 조작하기 쉬운 프로토콜이 인간 다능성 줄기 세포로부터 대뇌 오가노이드를 생성하도록 제안된다. 운영 기술은 엔지니어링 원리를 적용하여 최적화되었으며, 3D 문화에서의 작업을 2D 문화에서처럼 간단하고 실현 가능하게 만들었습니다. 향상된 액체 교환 방법 및 오가노이드 전달 작동은 다른 유형의 오가노이드 배양 및 자동 배양 기계 설계에도 도움이됩니다.

<table><tbody><tr><td>0.2 &무; m 필터</td><td>NEST 생명 공학, 중국</td><td>331001</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; L 광구경 피펫 팁</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>9405163</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L 광폭 피펫 팁</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>9405020</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Merck, 독일</td><td>8057400005</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>Servicebio, 중국</td><td>G1101</td><td></td></tr><tr><td>6-well 저접착 플레이트</td><td>NEST Biotechnology, 중국</td><td>703011</td><td>EB 현탁액 배양에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Aaccute cell detachment solution</td><td>STEMCELL Technologies, Canada</td><td>07920</td><td>iPSC를 단일 세포로 소화하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>AggreWell800 24-well</td><td>STEMCELL Technologies, Canada</td><td>34811</td><td>EB 준비를 위한 미세 다공성 배양 플레이트.</td></tr><tr><td>Anti-Adherence 헹굼 솔루션</td><td>STEMCELL Technologies, Canada</td><td>07010</td><td>세포 부착을 방지하기 위한 배양기류용 헹굼 솔루션</td></tr><tr><td>B27-vit. 보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech, 미국</td><td>GMP100-18B</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Beyotime Biotechnology, 중국</td><td>ST025</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf, 독일</td><td>5810 R</td><td>다양한 유형의 원심분리기 튜브, 시약 병 및 작업 플레이트의 원심분리에 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>Shitai 실험실 장비, 중국</td><td>10212020C</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime Biotechnology, 중국</td><td>C1002</td><td>핵 염색에 사용됩니다. DAPI를 이중 가닥 DNA와 결합한 후 최대 여기 파장은 364nm, 최대 방출 파장은 454nm였습니다.</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>ES-quality FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque</td><td>General Electric Company, 미국</td><td>17-5442-02</td><td>Ficoll-Paque 방법에 따라 말초 혈액 단핵 세포를 분리합니다.</td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>상곤 비오티치, 중국</td><td>A609764</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스 보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스 보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>염소 항닭 IgY&nbsp; 2차 항체</td><td>Abcam, 영국</td><td>ab150171</td><td>염소 항닭 IgG. 활용: Alexa Fluor 647. 예: 652nm, Em: 668nm. 1:500 희석에서 사용하십시오.</td></tr><tr><td>염소 항 마우스 IgG 2 차 항체</td><td>Abcam, 영국</td><td>ab150120</td><td>염소 항 마우스 IgG. 활용: Alexa Fluor 594. 예: 590nm, Em: 617nm. 1:500 희석에서 사용하십시오.</td></tr><tr><td>염소 항토끼 IgG 2차 항체</td><td>Abcam, 영국</td><td>ab150077</td><td>염소 항토끼 IgG. 활용: Alexa Fluor 488. 예: 495nm, Em: 519nm. 1:500 희석에서 사용하십시오.</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Merck, 독일</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>수평 셰이커</td><td>Servicebio, 중국</td><td>DS-H200</td><td>제조업체 INFORS HT(스위스)에 따르면 0.11808 x g의 상대 원심력(RCF)이 더 적합합니다.</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Merck, 독일</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning, 미국</td><td>354277</td><td>Matrigel은 4도 이상의 환경에서 응고됩니다. C, 그래서 그것은 저온에 이하 포장되어야 합니다.</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies, 캐나다</td><td>85850</td><td>iPSC 배양 배지</td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>OCT4 일차 항체</td><td>Abcam, 영국</td><td>ab19857</td><td>호스트: 토끼. 500으로 디졸브 &mu; 엘 PBS. 1:200 희석에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>병리학 냉동 슬라이서</td><td>Leica, 독일</td><td>Leica CM1860</td><td></td></tr><tr><td>PAX6 1 차 항체</td><td>Abcam, 영국</td><td>ab78545</td><td>호스트 : 마우스. 1:100 희석에서 사용하십시오.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>STEMCELL Technologies, Canada</td><td>37350</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PSC 해리 솔루션</td><td>Beijing Saibei Biotechnology, 중국</td><td>CA3001500</td><td>효소가 없는 해리 솔루션은 iPSC 분해 및 통과에 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Sendai Reprogramming Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>A16518</td><td>Sendai Reprogramming Kit의 프로토콜에 따라 iPSC를 설정합니다.</td></tr><tr><td>슬라이드 유리</td><td>Shitai 실험실 장비, 중국</td><td>188105W</td><td></td></tr><tr><td>소프트 라이트 램프</td><td>너트</td><td></td><td>너트 간단한 자체 제작 장치는 준비를 위해 보충 그림 2를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>STEMdiff 대뇌 오가노이드 키트</td><td>STEMCELL Technologies, Canada</td><td>8570</td><td>포함: 1. EB 형성 배지; 2. 감응작용 매체; 3. 확장 매체; 4. 성숙 매체.</td></tr><tr><td>STEMdiff 대뇌 오가노이드 성숙 키트</td><td>STEMCELL Technologies, 캐나다</td><td>8571</td><td>성숙 배지</td></tr><tr><td>자당</td><td>Sangon Bioteach, 중국</td><td>A502792</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck, 독일</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>TUJ1 1차 항체</td><td>Abcam, 영국</td><td>ab41489</td><td>숙주: 닭. 1:1000 희석에서 사용하십시오.</td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Sangon Bioteach, 중국</td><td>A510146</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies, Canada</td><td>72302</td><td>PBS에서 5mM 원액을 준비하고 624&micro에서 1mg을 재현탁합니다. PBS의 L.</td></tr><tr><td>Weblink</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Raw 염기서열 분석 데이터</td><td>게놈 염기서열 아카이브(유전체학, 단백질체학 및 기타) Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of</td><td>Sciences GSA-Human: HRA002430</td><td>https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/</td></tr></tbody></table>

측면 소프트 라이트 조명을 통한 대뇌 오가노이드 문화 촉진

Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination

현재 대뇌 오가노이드 배양 기술은 여전히 운영이 복잡하고 대규모로 적용하기가 어렵습니다. 간단하고 실용적인 해결책을 찾아야합니다. 따라서, 본 연구에서 보다 실현 가능한 대뇌 오가노이드 프로토콜이 제안된다. 초기 단계에서 중간 변화 및 오가노이드 전달의 피할 수없는 불편 함을 해결하기 위해 현재 연구는 엔지니어링 원칙을 적용하여 운영 기술을 최적화합니다. 배아체(EB) 샘플을 측면으로 비추기 위해 소프트 라이트 램프를 채택하여 EB를 향상된 확산 반사 효과를 통해 육안으로 볼 수 있도록 했습니다. 회전에 의해 생성 된 이차 흐름의 원리를 사용하여, 오가노이드는 우물의 중심을 향해 모여 중간 변화 또는 오가노이드 전달의 작동을 용이하게합니다. 분산 된 세포와 비교할 때, 배아체는 피펫에서 더 빨리 정착합니다. 이 현상을 사용하면 대부분의 자유 세포 및 죽은 세포 단편을 간단한 방법으로 효과적으로 제거 할 수있어 EB가 원심분리로 인한 손상을 입지 않도록합니다. 이 연구는 대뇌 오가노이드 문화의 작동을 용이하게하고 뇌 오가노이드의 적용을 촉진하는 데 도움이됩니다.

본 연구는 iPSCs(도 2B)를 대뇌 오가노이드로 유도하였다(도 2C). 초기 단계에서 재배된 EB는 OCT4 마커(그림 2A)를 나타내었으며, 이는 양호한 다능성을 나타냈다. 후기 단계에서 EB는 성숙한 대뇌 오가노이드로 발전했습니다 (그림 2D). 이 연구는 정상적인 건강한 개인과 SCA3 환자의 iPSC를 대뇌 오가노이드로 배양했습니다 (그림 3A). 마차도요세프 병(MJD)으로도 알려진 SCA3는 ATXN3 유전자25의 폴리글루타민 확장으로 인한 퇴행성 신경퇴행성 질환이다. RNA-seq 데이터 (공개 저장소에 업로드, 자료 표 참조)는 신경 전달 물질 수송, 시냅스 형성 및 조절과 ...

대뇌 오가노이드는 장기 발달 및 인간 질병 병리학을 연구하기위한 전례없는 기회를 제공합니다. 대뇌 오가노이드 배양 시스템으로 큰 성공을 거두었지만이 기술을 적용하는 데는 여전히 운영상의 어려움이 있습니다. 본 프로토콜은 중간 변화 및 오가노이드 전달을 용이하게 하는 대뇌 오가노이드 절차를 기술한다.

At present, cerebral organoid culture technology is still complicated to operate and difficult to apply on a large scale. It is necessary to find a simple ...

이 프로토콜은 대뇌 오가노이드 문화의 작동을 용이하게하고 뇌 오가노이드의 적용을 촉진하는 데 도움이됩니다. 초기 단계의 오가노이드는 많은 작업에 편리한 측면 소프트 라이트 램프를 사용하여 육안으로 볼 수 있습니다. 향상된 배지 변경 방법 및 오가노이드 전달 작업은 다른 유형의 오가노이드 배양 및 자동 배양 기계 설계에도 도움이됩니다.시작하기 위해, iPSCs를 35 밀리미터 페트리 디쉬로 덮인 마트리겔에서 mTeSR1 배지로 배양하고 매일 배지를 변경한다. iPSC 성장 밀도는 75%를 초과하지 않아야 하며, 이어서, iPSCs로부터 mTeSR1 배지를 피펫팅하고 이를 PBS 1밀리미터로 두 번 세척한다. PBS를 피펫팅한 후, 300 마이크로리터의 세포 분리 용액을 첨가하여 iPSCs를 섭씨 37도에서 3 내지 네 분 동안 단일 세포로 소화시킨다.나중에, 세포를 두 밀리미터의 EB 형성 배지에 재현탁시키고, 샘플을 300배 g에서 5분 동안 원심분리한다. 전문화 된 24 웰 플레이트를 웰 당 500 마이크로 리터의 부착 방지 헹굼 용액으로 5 분 동안 처리하십시오. 이제, 세포를 Rho 키나제 억제제 Y27632를 함유하는 EB 형성 배지에 재현탁시킨다.순응 방지 헹굼 용액을 제거한 후, 두 밀리리터의 EB 형성 매질로 각 웰을 헹구십시오. 다음으로, 세포를 웰 당 여섯 번째 세포에 세 번 10의 밀도로 전문화된 24 웰 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2분 동안 100배 g에서 원심분리한다. 플레이트의 바닥에있는 각 챔버에 세포를 균일하게 분배하십시오.샘플을 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 원심분리가 이전 단계에서 사용되지 않은 경우, 36시간 동안 인큐베이션하고 샘플을 안정적으로 유지한다. A5 용지 크기의 두께가 0.3 ~ 0.5cm인 투명 아크릴 보드를 사용하고 아크릴 판의 앞면과 뒷면에 흰색 패드를 붙여 넣으십시오.그런 다음 아크릴 판의 측면에서 조명이 들어갈 수 있도록 플레이트 가장자리에 LED 흰색 조명 행을 설치 한 다음 병렬로 쏠 수 있습니다. 이제 새로운 여섯 개의 우물 낮은 접착 플레이트를 준비하고 각 웰에 두 밀리리터의 EB 형성 배지를 추가하십시오. 1000 마이크로리터의 넓은 보어 피펫 팁을 사용하여 배지와 함께 EB를 제거한 후, 웰당 약 100개의 EB를 여섯 개의 웰 저 접착 플레이트로 옮깁니다.EB 형성 배지를 매일 동일한 부피의 신선

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Research

연구

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Bioengineering

생명공학

출처: Ibanez-Rios, M.I., et al., 신경 세포 이식의 인간 대뇌 오가노이드 모델. J. Vis. 경험. (2023년)이 비디오는 세포-기질 혼합물을 사용하여 형광 표지된 신경 전구 세포(NPC)를 인간 대뇌 오가노이드에 주입하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 재현 가능하고 동물이 없어 오가노이드 중단을 최소화하면서 이식이 가능합니다. 이는 신경 이식 및 중추신경계(CNS) 질환을 모델링하기 위한 귀중한 플랫폼을 제공합니다.

이식 모델링을 위한 인간 대뇌 오가노이드에 형광 신경 전구 세포 주입

이 동영상은 유도만능줄기세포(iPSC)에서 대뇌 오가노이드를 생성하는 분석을 보여줍니다. 인간 iPSC는 배아체(EB)를 형성하도록 유도됩니다. EB는 유도 배지를 사용하여 고분자 골격 위에서 배양되어 신경 줄기 세포, 전구 세포 및 미성숙 뉴런으로의 분화를 촉진합니다. 마지막으로, EB는 매트릭스에 삽입되어 대뇌 오가노이드 형성을 위한 유지 배지로 전달됩니다.

유도 만능 줄기 세포 유래 대뇌 오가노이드 생성

이 비디오는 단세포 현탁액에서 뇌종양 오가노이드의 준비 및 배양에 대해 설명합니다. 라미닌이 풍부한 세포외 기질을 영양소를 위한 골격 및 배양 배지로 사용하여 세포가 오가노이드 내에서 증식하고 자가 조직화되도록 촉진합니다. 그 결과, 세포 다양성과 뇌종양의 미세환경을 모방하는 체외 오가노이드가 생성됩니다.

Generating an Organoid Culture from a Brain Tumor Cell Suspension(뇌종양 세포 현탁액에서 오가노이드 배양 생성)

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 전뇌형 오가노이드를 생성하는 과정을 간략하게 설명하며, 줄기 세포 응집체에서 뇌 피질을 모방하고 다양한 뉴런 유형으로 분화하는 복잡한 구조로 진행되는 과정을 보여줍니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 전뇌형 대뇌 오가노이드 생성

이 비디오는 배아의 육안 시각화를 개선하기 위해 측면 소프트 라이트 조명 기술을 활용하여 대뇌 오가노이드 배양 중 배아의 조작 및 전달을 용이하게 하는 방법을 보여줍니다. 소프트 라이트 조명의 설정, 매체 변화 및 배아체 전달 방법, 대뇌 오가노이드 발달을 위한 배아체의 신경 분화를 유도하는 절차를 설명합니다.

측면 소프트 라이트 조명을 사용하여 대뇌 오가노이드 배양을 최적화하는 기술

우리는 거꾸로 현미경으로 유출 물에 미생물의 문화와 정기적으로 이미지 세포를 조명하기 optogenetic 시스템과 함께 사용 연속 배양 장치를 설계했다. 조명 동적 응답은 며칠에 걸쳐 측정 될 수 있도록 배양 샘플링, 촬상 한 화상 분석이 완전 자동화된다.

미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현

대뇌 organoids 초기 인간의 두뇌 개발에서 체 외에서조사 하는 새로운 모델 시스템을 나타냅니다. 이 문서는 효율적으로 중요 한 특성 및 유효성 검사 단계를 포함 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 균질 등 개 형 organoids를 생성 하는 상세한 방법론을 제공 합니다.

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

이 논문은mm2당 수백 개의 마이크로컨테이너를 사용하는 새로운 유형의 배양 기질에 대한 제조 프로토콜을 제시하며, 이 배양에서 오가노이드는 고해상도 현미경을 사용하여 배양 및 관찰할 수 있습니다. 세포 파종 및 면역 염색 프로토콜도 자세히 설명되어 있습니다.

오가노이드의 배양 및 3D 이미징을 위한 고처리량 플랫폼

본 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 유래한 대뇌 오가노이드의 재현 가능한 생성, 유지 및 노화를 위한 단계별 절차를 제공합니다. 이 방법은 장기간 대뇌 오가노이드를 배양하고 성숙시킬 수 있어 뇌 노화 및 노화 관련 병인과 관련된 과정의 모델링을 용이하게 합니다.

노화 연구를 위한 iPSC 유래 뇌 오가노이드의 장기 배양을 위한 강력한 조직 제작

우리는 두 가지 리포터 전략에 적용된 공초점 영상 및 추적 파이프라인을 설명합니다: 개별 세포 행동을 해석하는 모자이크 오가노이드와 인간 및 쥐 장내 오가노이드에서 세포 유형 전이를 모니터링하는 FATE 리포터 오가노이드입니다.

인간 및 쥐 장내 오가노이드에서 클론 역학과 운명 전이를 모니터링하기 위한 생세포 영상 및 단세포 추적

배우세요 대뇌 오가노이드 배양 및 이전 기술을 측면 소프트 라이트 조명을 활용하여 개선하는 방법을. 이 프로토콜은 iPSC 배양, 신경 유도, 자동화 시스템 설계에 활용됩니다.

측면 소프트 라이트 조명을 통한 대뇌 오가노이드 문화 촉진

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