Name: 근육 내 지방 형성과 골격근의 세포 기원을 조사하는 가이드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 배우세요 근육 내 지방 시각화 및 정량화 프로토콜을 통해 골격근에서 지방세포 형성 메커니즘을 연구하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 근육병 연구에 활용됩니다.

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데이터 수집과 원고의 비판적 읽기를 도와 주신 Kopinke 연구소 회원들에게 감사드립니다. 우리는 또한 원고에 대한 귀중한 의견을 주신 플로리다 대학의 Myology Institute 회원들에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 1R01AR079449에 의해 지원되었습니다. 도 2는 바이오렌더로 작성하였다.

<ol><li>Milad, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+plasma+lipid+levels+exacerbate+muscle+pathology+in+the+mdx+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Increased plasma lipid levels exacerbate muscle pathology in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Skeletal Muscle. 7 (1), 19(2017).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+regional+body+fat+distribution%2C+and+the+metabolic+syndrome+in+older+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women.</a> Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+regional+adipose+tissue+distribution+and+both+type+2+diabetes+and+impaired+glucose+tolerance+in+elderly+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men and women.</a> Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+skeletal+muscle+strength%2C+mass%2C+and+quality+in+older+adults%3A+the+health%2C+aging+and+body+composition+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology%2C+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The loss of skeletal muscle strength, mass, and quality in older adults: the health, aging and body composition study.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (10), 1059-1064 (2006).</li>
<li>Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thigh+adipose+tissue+distribution+is+associated+with+insulin+resistance+in+obesity+and+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).</li>
<li>Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+lipid+content+is+increased+in+obesity+and+decreased+by+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss.</a> Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).</li>
<li>Burakiewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+fat+replacement+of+muscle+by+quantitative+MRI+in+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantifying fat replacement of muscle by quantitative MRI in muscular dystrophy.</a> Journal of Neurology. 264 (10), 2053-2067 (2017).</li>
<li>Murphy, W. A., Totty, W. G., Carroll, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+of+normal+and+pathologic+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Roentgenology%22%5BJournal%5D)">MRI of normal and pathologic skeletal muscle.</a> American Journal of Roentgenology. 146 (3), 565-574 (1986).</li>
<li>Willcocks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+prospective+longitudinal+study+of+magnetic+resonance+biomarkers+in+a+large+duchenne+muscular+dystrophy+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multicenter prospective longitudinal study of magnetic resonance biomarkers in a large duchenne muscular dystrophy cohort.</a> Annals of Neurology. 79 (4), 535-547 (2016).</li>
<li>Wokke, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+MRI+and+strength+measurements+in+the+assessment+of+muscle+quality+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Quantitative MRI and strength measurements in the assessment of muscle quality in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (5), 409-416 (2014).</li>
<li>Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins%2C+potency%2C+and+heterogeneity+of+skeletal+muscle+fibro-adipogenic+progenitors-time+for+new+definitions%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions.</a> Skeletal Muscle. 11 (1), 16(2021).</li>
<li>El Agha, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+fibrotic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in fibrotic disease.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).</li>
<li>Joe, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li>
<li>Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+adipose+is+derived+from+a+non-Pax3+lineage+and+required+for+efficient+regeneration+of+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles.</a> Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).</li>
<li>Scott, R. W., Arostegui, M., Schweitzer, R., Rossi, F. M. V., Underhill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hic1+defines+quiescent+mesenchymal+progenitor+subpopulations+with+distinct+functions+and+fates+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hic1 defines quiescent mesenchymal progenitor subpopulations with distinct functions and fates in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Stem Cell. 25 (6), 797-813 (2019).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+adipogenesis+originate+from+a+common+mesenchymal+progenitor+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 21 3654-3664 (2011).</li>
<li>Hogarth, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroadipogenic+progenitors+are+responsible+for+muscle+loss+in+limb+girdle+muscular+dystrophy+2B%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fibroadipogenic progenitors are responsible for muscle loss in limb girdle muscular dystrophy 2B.</a> Nature Communications. 10 (1), 2430(2019).</li>
<li>Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li>
<li>Stumm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odd+skipped-related+1+%28Osr1%29+identifies+muscle-interstitial+fibro-adipogenic+progenitors+%28FAPs%29+activated+by+acute+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Odd skipped-related 1 (Osr1) identifies muscle-interstitial fibro-adipogenic progenitors (FAPs) activated by acute injury.</a> Stem Cell Research. 32, 8-16 (2018).</li>
<li>Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+Hedgehog+signaling+restricts+injury-induced+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ciliary Hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis.</a> Cell. 170 (2), 340-351 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Das, A. K., Yang, Q. Y., Zhu, M. J., Du, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zfp423+promotes+adipogenic+differentiation+of+bovine+stromal+vascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zfp423 promotes adipogenic differentiation of bovine stromal vascular cells.</a> PLoS One. 7 (10), 47496(2012).</li>
<li>Sun, Y. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFR%CE%B1+regulated+by+miR-34a+and+FoxO1+promotes+adipogenesis+in+porcine+intramuscular+preadipocytes+through+Erk+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">PDGFRα regulated by miR-34a and FoxO1 promotes adipogenesis in porcine intramuscular preadipocytes through Erk signaling pathway.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2424(2017).</li>
<li>Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+and+characterization+of+fibro-adipogenic+progenitors+%28FAPs%29+and+myogenic+progenitors+%28MPs%29+in+skeletal+muscle+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) in skeletal muscle in the rat.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e61750(2021).</li>
<li>Lukjanenko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+disrupts+muscle+stem+cell+function+by+impairing+matricellular+WISP1+secretion+from+fibro-adipogenic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).</li>
<li>Santini, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+PDGFRalpha%28%2B%29+progenitor+cells+contribute+to+fibrosis+versus+healing+in+a+context-+and+spatiotemporally+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident PDGFRalpha(+) progenitor cells contribute to fibrosis versus healing in a context- and spatiotemporally dependent manner.</a> Cell Reports. 30 (2), 555-570 (2020).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+PDGFRalpha%2B+mesenchymal+progenitors+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of PDGFRalpha+ mesenchymal progenitors in human skeletal muscle.</a> Cell Death & Disease. 5, 1186(2014).</li>
<li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li>
<li>Soliman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+potential+of+Hic1-expressing+cardiac+stromal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogenic potential of Hic1-expressing cardiac stromal progenitors.</a> Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).</li>
<li>Chung, M. I., Bujnis, M., Barkauskas, C. E., Kobayashi, Y., Hogan, B. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-mediated+BMP%2FSMAD+signaling+regulates+lung+alveolar+stem+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Niche-mediated BMP/SMAD signaling regulates lung alveolar stem cell proliferation and differentiation.</a> Development. 145 (9), Cambridge, England. (2018).</li>
<li>Hilgendorf, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+fatty+acids+activate+ciliary+FFAR4+to+control+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Omega-3 fatty acids activate ciliary FFAR4 to control adipogenesis.</a> Cell. 179 (6), 1289-1305 (2019).</li>
<li>Waisman, A., Norris, A. M., Elías Costa, M., Kopinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+and+unbiased+segmentation+and+quantification+of+myofibers+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automatic and unbiased segmentation and quantification of myofibers in skeletal muscle.</a> Scientific Reports. 11 (1), 11793(2021).</li>
<li>Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+CNS+glial+progenitors+remain+committed+to+the+oligodendrocyte+lineage+in+postnatal+life+and+following+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration.</a> Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).</li>
<li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4(2001).</li>
<li>Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+reveals+that+transient+adipogenic+activation+is+a+hallmark+of+mouse+models+of+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration.</a> PLoS One. 8 (8), 71084(2013).</li>
<li>Mahdy, M. A., Lei, H. Y., Wakamatsu, J., Hosaka, Y. Z., Nishimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+muscle+regeneration+following+cardiotoxin+and+glycerol+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Anatomy+%3D+Anatomischer+Anzeiger%3A+Official+Organ+of+the+Anatomische+Gesellscaft%22%5BJournal%5D)">Comparative study of muscle regeneration following cardiotoxin and glycerol injury.</a> Annals of Anatomy = Anatomischer Anzeiger: Official Organ of the Anatomische Gesellscaft. 202, 18-27 (2015).</li>
<li>Pisani, D. F., Bottema, C. D., Butori, C., Dani, C., Dechesne, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+skeletal+muscle+adiposity%3A+a+glycerol+treatment+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mouse model of skeletal muscle adiposity: a glycerol treatment approach.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (3), 767-773 (2010).</li>
<li>Kawai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+glycerol+myopathy%3A+a+histological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Experimental glycerol myopathy: a histological study.</a> Acta Neuropathologica. 80 (2), 192-197 (1990).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Bmp3b+expression+maintains+skeletal+muscle+integrity+and+decreases+in+age-related+sarcopenia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Bmp3b expression maintains skeletal muscle integrity and decreases in age-related sarcopenia.</a> The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139617(2021).</li>
<li>Biferali, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prdm16-mediated+H3K9+methylation+controls+fibro-adipogenic+progenitors+identity+during+skeletal+muscle+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Prdm16-mediated H3K9 methylation controls fibro-adipogenic progenitors identity during skeletal muscle repair.</a> Science Advances. 7 (23), 9371(2021).</li>
<li>Biltz, N. K., Meyer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+quantification+of+fatty+infiltration+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle.</a> Skeletal Muscle. 7 (1), (2017).</li>
<li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), Cambridge, England. (2021).</li>
<li>Gómez-Gaviro, M. V., Sanderson, D., Ripoll, J., Desco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+tissue+clearing+and+three-dimensional+imaging+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of tissue clearing and three-dimensional imaging in health and disease.</a> iScience. 23 (8), 101432(2020).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

이 프로토콜은 근육 내 지방의 효율적인 시각화와 엄격한 정량화를 가능하게하는 광범위하고 상세한 프로토콜을 설명합니다. 동일한 근육을 두 부분으로 나눠서 하나는 면역 형광에 사용하고 다른 하나는 RT-qPCR 분석에 사용되는이 프로토콜은 매우 다양합니다. 또한 FAP의 유전 적 계보 추적과 결합하여 특정 조건 하에서 지방세포로의 전환을 연구 할 수 있으며 여러 추가 세포 유형을 표지하고 이미지화하는 데 매우 적응할 수 있습니다.
근육 내 지방을 시각화하는 가장 일반적으로 사용되는 방법은 파라핀 절편에 이어 헤마톡실린 및 에오신 염색 또는 Oil Red O (ORO)와 같은 친유성 염료에 대해 염색 된 냉동 섹션입니다. 그러나, 파라핀 처리 조직은 최상의 조직학을 유지하지만, 동일한 과정은 또한 친유성 염료의 사용을 막는 모든 지질을 추출한다. 친유성 염색 방법이 PFA 고정 및 고정되지 않은 조직 절편 모두에서 작동하지만, 지질 방울은 커버 슬립에 압력을 가하여 쉽게 변위되어 근육 내 지방의 공간 분포를 왜곡시킵니다. 이를 피하기 위해 최근 연구는 전체 마운트 접근법을 사용하여 ORO + 지방세포를 시각화하기위한 엄격한 프로토콜을 수립했습니다. 이를 위해, 저자들은 TA를 탈세포화하여 전체TA41에 걸친 근육내 지방의 공간적 분포를 시각화하였다. 이 기술이 강력한만큼, 그것은 또한 추가적인 세포 구조를 표시하기 위해 다른 공동 염색의 사용을 방지합니다. 여기에 제시된 전체 마운트 면역형광 접근법은 세포 환경의 미세 매핑을 허용하는 다양한 마커와 함께 지방세포를 공동염색하는데 사용될 수 있다. 그러나 한 가지 주요 과제는 항체의 조직 침투입니다. 섬유가 함께 유지될수록, 항체가 이용가능한 모든 항원에 동등하게 침투하고 결합하는 것이 더 어려워질 것이다. 따라서이 방법은 작은 섬유 그룹을 볼 때 가장 효과적입니다. 동시에, 이것은 또한 작고 벗겨진 섬유 다발에만 초점을 맞출 때 근육 내 지방의 전반적인 해부학 적 위치가 손실되기 때문에 한계가 있습니다. 그러나 새로운 조직 제거 방법과 새로운 이미징 기술의 현재 개발로 인해 향후42,43,44에서 더 큰 조직 침투 및 시각화가 가능할 것입니다.
근육 조직의 사전 고정은 지방 세포 형태를 보존하지만, 근육 건강의 중요한 측정 인 근섬유의 크기를 평가하는 도전 과제를 만듭니다. Myofiber 크기는 근섬유의 단면적을 측정함으로써 결정된다. 우리는 이전에 근육 조직의 사전 고정으로 인해 근섬유를 윤곽을 그리는 데 사용할 수있는 대부분의 마커가 실패하게된다고보고했습니다 31. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 우리는 고정된 근육 섹션(31)에서도 근섬유 크기를 측정할 수 있는 새로운 이미지 세분화 파이프라인을 개발했습니다. 따라서 우리는이 프로토콜과 결합하여 근육 조직의 사전 고정으로 인한 대부분의 단점을 극복하는 강력하고 효율적인 조직 처리 파이프 라인을 구축했습니다.
이 접근법의 또 다른 주요 장점은 다재다능성입니다. TA를 두 부분으로 나눔으로써 하나의 근육으로부터 얻을 수 있는 정보의 양이 최대화된다. 이것은 동물 수를 줄일뿐만 아니라 유전자 발현을 통해 조직학을 확인함으로써 추가 제어 층을 추가하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 또한, 많은 다른 유전자가 아디포겐 유전자를 넘어 검사 될 수 있습니다. 단리된 RNA는 또한 전체 근육 RNAseq 실험에 사용될 수 있다. 마지막으로, 스냅 냉동 근육 조각은 단백질 작업에도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 한 가지 한계는 부상이 TA의 전체 길이에 걸쳐 일관되지 않을 가능성입니다. 이것은 두 근육 부분이 포함 된 근육 내 지방의 양에서 분기하는 시나리오로 이어질 수 있으며 하류 분석에서 그러한 샘플을 제외 할 수 있습니다. 따라서 RT-qPCR에 의존하여 근육 내 지방의 양에 대한 주요 결론을 도출하는 것이 아니라 조직 학적 정량화를지지하는 데이터로 사용하는 것이 좋습니다.
함께,이 프로토콜은 지방 섬유증과 싸우기위한 새로운 치료 옵션을 개발하는 첫 번째 단계 인 근육 내 지방의 시각화 및 정량화를 가능하게하는 강력하고 효율적이며 엄격한 조직 처리 파이프 라인을 설명합니다. 동시에, 그것은 다재다능하며 근육 내의 많은 다른 세포 유형뿐만 아니라 다른 조직의 지방세포에 적응할 수 있습니다.

지방 섬유증으로 건강한 근육 조직의 침윤은 Duchenne 근이영양증 (DMD) 및 기타 신경 근육 질환뿐만 아니라 유육종증, 비만 및 당뇨병 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10의 두드러진 특징입니다. . 이러한 조건에서 지방 침투가 증가하면 근육 기능 감소와 밀접한 관련이 있지만 근육 내 지방 형태가 왜 그리고 어떻게 형성되는지에 대한 우리의 지식은 여전히 제한적입니다. FAPs는 골격근11,12를 포함한 대부분의 성인 장기에 존재하는 다능성 중간엽 기질 세포 집단이다. 그러나 나이가 들어감에 따라 만성 질환에서 FAP는 섬유성 흉터 조직을 생성하고 지방세포로 분화되며, 지방세포는 개별 근섬유 사이에 위치하여 근육 내 지방 13,14,15,16,17,18,19,20을 형성합니다.
근육 내 지방 형성과 싸우기 시작하려면 FAP가 지방 세포로 변하는 메커니즘에 대한 메커니즘을 정의해야합니다. PDGFRα는 여러 종의 근육 내 FAP를 확인하기 위한 현장의 "금 표준" 마커입니다 13,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27. 그 결과, Pdgfrα 전구모터의 제어 하에 여러 뮤린 타목시펜-유도성 Cre 라인이 생성되어, Cre-LoxP 시스템27,28,29를 사용하여 생체 내에서 FAP를 유전적으로 조작할 수 있게 되었다. 예를 들어, 이 유도성 Cre 라인을 유전자 리포터와 조합함으로써, FAPs의 계보 추적이 수행될 수 있으며, 이는 우리가 성공적으로 근육 및 백색 지방 조직20,30에서 FAPs의 운명 맵에 적용한 전략이다. 혈통 추적 외에도이 Cre 라인은 FAP에서 지방으로의 전환을 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.
FAPs의 아디포제닉 근육 내 지방으로의 전환 메커니즘을 정의하는 데있어 한 가지 주요 장애물은 다른 조건에서 형성된 근육 내 지방의 양을 엄격하고 재현 가능하게 정량화하는 능력입니다. 핵심은 근육과 지방 조직의 보존의 균형을 맞추고이를 지방 세포를 시각화하기 위해 사용 가능한 염색 방법과 일치시키는 것입니다. 예를 들어, 골격근은 종종 사전 고정 없이 스냅-얼어서 근섬유는 보존하지만 지방세포 형태를 방해한다(그림 1). 대조적으로, 파라핀 포매에 뒤따르는 고정은, 지방세포를 포함한 최상의 조직 조직학을 표시하면서, 모든 지질을 제거하고, 이로써 일반적으로 사용되는 염료인 Oil Red O와 같은 대부분의 친유성 염료를 사용할 수 없게 만든다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig1v2.jpg"> 그림 1: 스냅 냉동 대 고정 근육 조직에서 근육 내 지방의 대표적인 이미지 . (A) 실험 설정의 개략적인 개요. 글리세롤 손상 후 21일째에 지방세포(노란색), 근섬유(회색) 및 핵(시안) 내 (B) 스냅-냉동 및 (C) 고정된 TAs를 보여주는 면역형광 이미지. 배율 막대: 50μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
여기에 설명 된 프로토콜은 근섬유 및 지방 세포 형태를 보존하고 여러 세포 유형의 시각화 및 분석을 가능하게합니다. 이 접근법은 파라포름알데히드 (PFA) 고정 근육 조직에서 지방세포의 면역 형광 염색을 기반으로하며, 이는 다중 항체와의 공동 염색을 허용합니다. 또한 전체 마운트 이미징을 사용하여 손상되지 않은 조직에서 근육 내 지방을 공간적으로 표시하도록 쉽게 조정할 수 있으므로 근육 내 지방의 세포 미세 환경에 대한 정보를 제공합니다. 또한, 이 프로토콜은 근육 건강을 평가하기 위한 중요한 측정인 고정된 근육 조직(31)에서 근섬유의 단면 면적을 결정하기 위해 최근에 발표된 접근법과 조합될 수 있다. 이 접근법을 유전 적 계보 추적과 결합하여 FAPs를 지방세포로의 분화를 운명지도화하는 것도 여기에 요약되어 있습니다. 따라서, 여기에 설명된 다목적 프로토콜은 FAP의 엄격하고 재현 가능한 평가와 조직 절편 및 무손상 조직에서 근육 내 지방으로의 분화를 가능하게 한다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig2v2.jpg"> 그림 2: 회로도 프로토콜 개요. RT-qPCR을 통한 후속 RNA 분리 및 전사 분석을 위해 TA의 삼분의 일이 제거, 스냅-냉동 및 균질화되는 조직 처리의 개략적인 개요. TA의 다른 삼분의 일은 PFA 고정이며 냉동 절편 또는 전체 마운트 섬유에서 면역 염색을 위해 처리됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>16% PFA (12개, 10 mL 병 팩)</td><td>Electron Miscroscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>스냅프리징/비드 박동용 마이크로 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>2-메틸부탄(4 L)</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3551-4</td><td>isopentane</td></tr><tr><td>앱솔루트 에탄올(200 proof)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab fragment 당나귀 안티 마우스</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td>마우스 온 마우스 차단</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티 닭 2 차 항체</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티 마우스 2 차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티 토끼 2 차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr>, <tr><td>Alexa Fluor 568, 당나귀 항염소 2차 항체</td>, <td>Invitrogen</td><td>A11057</td><td></td></tr>, <tr><td>Alexa Fluor 568, 당나귀 항토끼 2차 항체</td>, <td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr>, <tr><td>Alexa Fluor 568, Phalloidin 항체</td>, <td>Invitrogen</td><td>A12380</td>, <td>1.5mL 메탄올에 용해(~66 &micro; M working solution)</td></tr><tr><td>BioLite 24-well Multidish</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>930186</td><td>24 well plate for PFA tissue incubation</td></tr><tr><td>Biometra TOne</td><td>analytikjena</td><td>8462070301</td><td>Thermal cycler</td></tr><tr><td>Chicken anti-GFP antibody</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>분자생물학, DNAse, RNAse 및 프로테아제 무함유 ThermoFisher를 위한 클로로포름/이소아밀 알코올 24:1(v/v)</td><td> 과학</td><td>AC327155000</td><td></td></tr><tr><td>옥수수 기름</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 염색</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>150 &micro; m, dH2O</td></tr><tr><td>당나귀 세럼 (100 mL)</td>의 M 작업 솔루션, <td>차단 솔루션용</td> <td>Millipore Sigma</td><td>5058837</td></tr><tr><td>Dumont #5 집게</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251-20</td><td>끝이 뾰족한 핀셋</td></tr> 파인 <tr><td>시저, 스트레이트 9 cm</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>플루오로마운트-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>마운팅 매체</td></tr><tr><td>글리세롤, 99.5%, 분자생물학용(500mL)</td><td>Acros Organics</td><td>327255000</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-PDGFR&alpha; 항체</td><td>R& D</td><td>AF1062</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 오븐</td><td>VWR</td><td>230301V</td><td>타목시펜 배양</td></tr><tr><td>ImmEdge 소수성 장벽 PAP 펜</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>소수성 펜</td></tr><tr><td>인슐린 주사기(마이크로 미세 IV 바늘 포함)(28G)</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기(슬립 팁 포함), 1mL</td><td>BD</td><td>329654</td><td>인슐린 주사기(바늘 없음), 구강용 gavaging</td></tr><tr><td>iScript cDNA 합성 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson 수의학</td><td>78938441</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8 도립 현미경</td> 광<td>시야 IF 및 컨포칼 이미징에 사용되는</td><td>Leica</td><td></td> micrscope</tr><tr><td>Micro Slides VWR</td><td></td><td>48311-703</td><td>양전하 현미경 슬라이드</td></tr><tr><td>마우스 anti-MYOD 항체</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-41017</td><td></td></tr><tr><td>마우스 anti-PAX7 항체(상등액)</td><td>DSHB</td><td>AB 428528</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Premier+ 마이크로톰 블레이드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3052835</td><td>마이크로톰 블레이드</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 분광광도계</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000</td><td>분광광도계 RNA 수율용</td></tr><tr><td>Play-Doh</td><td>Hasbro</td><td></td><td>모델링 화합물</td></tr><tr><td>PowerUp SYBR 그린 마스터 믹스</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A25742</td><td>녹색 염료 PCR 마스터 믹스</td></tr><tr><td>Puralube 수의사 연고</td><td>Puralube</td><td>17033-211-38</td><td>수의사 안과 연고</td></tr><tr><td>QuantStudi 6 Flex Real-Time 384-well PCR 시스템</td><td>Applied Biosystems</td><td>4485694</td><td>qPCR 기계</td></tr><tr><td>토끼 항페리리핀 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>9349S</td><td></td></tr><tr>IF 염색용 <td>Red-Rotor</td><td>Shaker Hoefer Scientific</td><td>PR70-115V</td><td>셰이커</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific 슬립라이트 커버 유리</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>152460</td><td>커버슬립</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td>에는 미니 스핀 컬럼이 포함되어</td></tr> 있습니다. <tr><td>Safe-Lock Tubes 1.5 ml, 천연</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Sample Tubes RB (2 mL)</td><td>QIAGEN</td><td>990381</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>Alfa Aesar</td><td>14314</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스강 비드, 2.8mm</td><td>프리셀리스</td><td>KT03961-1-101. BK</td><td>작은 구슬</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 비즈, 5 mm</td><td>QIAGEN</td><td>69989</td><td>중간 구슬</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 비즈, 7 mm</td><td>QIAGEN</td><td>69990</td><td>큰 비즈</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 일회용 메스</td><td>Miltex</td><td>327-4102</td><td>메스</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 공급 튜브, 20 G x 38 mm, 스트레이트</td><td>Instech Laboratories</td><td>FTSS-20S-3</td><td>gavage 바늘</td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>토론토 연구 화학 물질</td><td>T006000</td><td></td></tr><tr><td>조직 플러스 O.C.T. 화합물</td><td>Fisher HealthCare</td><td>4585</td><td>임베딩 매체</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>QIAGEN</td><td>85600</td><td>비드 비터</td></tr><tr><td>TissueLyser LT 어댑터, 12-Tube</td><td>QIAGEN</td><td>69980</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura</td><td>4566</td><td>시편 금형</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596026</td><td>구아니듐 티오시안산</td></tr>염 <tr><td>Tween20 (500 mL)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>VWR 마이크로 슬라이드 - Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311703</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Coplin 염색 용기</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6016</td><td>Coplin 용기</td></tr></tbody></table>

근육 내 지방 형성과 골격근의 세포 기원을 조사하는 가이드

A Guide to Examining Intramuscular Fat Formation and its Cellular Origin in Skeletal Muscle

섬유-아디포겐 전구세포(FAPs)는 골격근 항상성 및 재생 중에 중요한 역할을 하는 중간엽 기질 세포입니다. FAPs는 분자 근섬유 스캐폴드로서 작용하는 세포외 매트릭스를 구축하고 유지한다. 또한, FAPs는 근육 줄기 세포 (MuSCs)에 의해 감지되는 많은 유익한 인자를 분비하기 때문에 근섬유 재생에 없어서는 안될 필수 요소입니다. 그러나 병든 상태에서 FAP는 근육 내 지방 및 섬유성 흉터 조직의 세포 기원입니다. 이 지방 섬유증은 유육종증과 Duchenne 근이영양증과 같은 신경 근육 질환의 특징입니다. FAP가 근육 내 지방으로 분화되는 이유와 방법을 결정하는 데 중요한 장벽 중 하나는 특히 동결 조직 절편에서 지방 세포의 효과적인 보존 및 후속 시각화입니다. 스냅 냉동과 같은 골격근 조직 처리의 전통적인 방법은 개별 지방세포의 형태를 적절하게 보존하지 못하여 정확한 시각화 및 정량화를 방지합니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해 골격근 절편에서 지방세포 형태를 보존하여 근육 내 지방의 시각화, 이미징 및 정량화를 허용하는 엄격한 프로토콜이 개발되었습니다. 이 프로토콜은 또한 RT-qPCR을 위해 근육 조직의 일부를 처리하는 방법을 간략하게 설명하여 사용자가 아디포겐 유전자의 발현 차이를 관찰하여 지방 형성의 관찰 된 변화를 확인할 수있게합니다. 추가적으로, 근육 샘플의 전체 마운트 면역형광에 의해 지방세포를 가시화하도록 적응될 수 있다. 마지막으로,이 프로토콜은 FAP의 아디포겐 전환을 연구하기 위해 Pdgfrα 발현 FAP의 유전 적 계보 추적을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 RT-qPCR의 확인과 함께 지방세포의 고해상도 및 형태학적으로 정확한 면역형광 이미지를 일관되게 산출하여 근육내 지방의 견고하고 엄격하며 재현 가능한 시각화 및 정량화를 가능하게 합니다. 여기에 설명 된 분석 파이프 라인은 FAP가 근육 내 지방으로 어떻게 차별화되는지에 대한 이해를 향상시키는 첫 번째 단계이며 지방 형성을 예방하기위한 새로운 개입을 검증하는 프레임 워크를 제공합니다.

근육 내 지방의 면역 형광 시각화 상기 단계 및 도 1A를 관찰한 후, TA 조직 절편을 글리세롤 손상 후 21일째로부터 수집하였고, 이는 LN2-냉각된 이소펜탄에서 수확 직후에 스냅-냉동되거나 또는 2.5시간 동안 4% PFA에 고정되었다. 두 샘플을 동결절제하고 염색한 후, TA의 가장 큰 영역인 중간 배에서 이미지를 촬영하였다. 고정되지 않은 TAs로부터의 PERILIPIN+ 지방세포(그림 1B)는 고정된 절편(그림 1C)에 비해 형태학을 상당히 변화시켰기 때문에, 이들의 식별, 시각화 및 후속 정량화가 훨씬 더 어렵고 잠재적으로 부정확하다. 참고로, 첫 번째 PERILIPIN+ 지질 방울은 손상 후 약 5일 후에 검출되었으며, 대부분의 지방세포는 7일째까지 형성되었다. 부상 후 21 일까지 지방세포는 완전히 성숙했습니다.
TA 당 지방의 양은 유도 된 손상의 중증도와 강하게 상관 관계가 있기 때문에 TA는 근육 내 지방 형성을 효과적으로 관찰하고 연구하기 위해 크게 부상 당해야합니다. 사체 TA에 잉크를 사용하여 주사를 연습하는 것은 부상의 심각성을 향상시키는 좋은 방법입니다. 성공적인 부상은 근육의 50 % 이상인 경향이 있습니다. 참고로, 근육의 부상당한 영역은 근육 섬유가 없는 영역 또는 재생 근육 섬유의 알려진 특징인 적어도 하나의 중앙에 위치한 핵을 포함하는 근육 섬유에 의해 채워지는 영역을 나타낸다.
이 프로토콜은 3D에서 FAP와 지방에 대한 염색에 쉽게 적응할 수 있습니다. 이를 위해, TA 후-고정으로부터 다중 근섬유를 조심스럽게 분리하고, 이어서 전체 마운트 면역형광을 수득하였다. 핵심은 섬유를 유리 슬라이드에 적절하게 고정시키고 동시에 조직의 과도한 압축을 피하는 것입니다. 성형 가능한 점토 발을 사용하여 사용자는 필요한 두께를 조정하고 커버 슬립을 슬라이드에 고정시킬 수 있으며 거꾸로 된 현미경을 사용할 수도 있습니다 (그림 4A). 이 방법은 PDGFRα+ FAPs, Phalloidin+ 근섬유, 및 PERILIPIN-발현 지방세포를 표지하는데 성공적으로 사용되었다(도 4B, 보충 비디오 1 및 보충 비디오 2). 두께가 최대 150μm에 달하는 여러 z-평면에서 이미지를 얻은 후 현미경 소프트웨어 내의 3D 렌더링 모듈을 사용하여 3D 재구성을 만들었습니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig4v3.jpg"> 도 4: 전체 마운트 면역형광 염색. (A) 샘플을 장착하고 전체 마운트 염색을 위한 커버슬립을 추가하는 방법에 대한 상단 및 측면도. (B) FAP (녹색; 왼쪽) 및 지방 세포 (빨간색, 오른쪽)와 근섬유 (회색) 및 핵 (파란색)의 대표적인 3D 재구성. 배율 막대: 50μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig4v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
근육 내 지방의 정량화 근육내 지방의 이미지를 촬영한 후, ImageJ/FIJI의 세포 카운터 기능을 사용하여 PERLIPIN+ 지방세포의 수를 수동으로 계산했습니다(그림 5A). 다음으로, 근섬유 내의 중앙에 위치하는 핵에 의해 정의된 손상 부위뿐만 아니라 근육 절편의 전체 면적을 결정하였다. 손상 중증도를 조절하기 위해, 지방세포의 총 수를 부상당한 부위로 나누어 부상당한 근육의 1mm2 당 지방 세포의 수를 초래하였다. 일반적으로 &lt;30 % 부상을 나타내는 TA는 정량화에서 제외됩니다. 참고로, 지방세포는 횡단면적 당 0에서 여덟 개에 이르는 손상없이 드물지만 지방세포의 총 수는 여전히 전체 면적에 의해 정상화됩니다. 도 5B에서 강조된 바와 같이, 글리세롤 손상은 손상되지 않은 TA 근육에 비해 엄청난 양의 근육내 지방을 유발한다. 대안으로, 페리리핀 염색은 높은 신호 대 잡음비로 매우 깨끗하기 때문에, 입자 분석 기능을 사용하여 페리핀이 차지하는 전체 면적을 결정할 수도 있다. 그러나, 이 방법은 더 작은 대 더 적은 지방세포를 구별할 수 없을 것이다. 최소 네 마리의 개별 동물로부터 최대 세 개의 절편을 영상화하고 정량화하였으며, 마우스당 존재하는 지방 세포의 평균 수가 보고되었다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig5v2.jpg"> 그림 5: 근육내 지방의 정량화 . (A) ImageJ에서 Cell Counter 기능을 사용하여 PERILIPIN+ 지방세포(흰색)를 계수하는 방법의 대표적인 이미지. 스케일 바: 50 μm. (B) 글리세롤 주사 후 21일간 전체 TA 지방세포 정량화는 손상된 부위의 1mm2 로 정규화되었다. 각 점은 한 마우스의 평균을 나타냅니다. SEM으로 표시된 오류 막대. **** = p &lt; 0.0001입니다. (c) 클로로포름에 의한 균질화 및 후속 상분리 후의 RNA 층은 RT-qPCR 분석에 사용되고 있다. (d) 초기 아디포제닉 유전자인 Pparg 및 Cepbα, 및 글리세롤 손상 후 상이한 시점에서 두 개의 성숙한 지방세포 마커인 Plin1 및 Adipoq 의 발현 수준의 변화를 폴드한다. 각 점은 한 마우스의 평균을 나타냅니다. 오류 막대가 SEM으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig5v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
독립적으로 존재하는 근육내 지방의 양을 확인하기 위해, 다양한 아디포제닉 마커의 유전자 발현 수준이 결정될 수 있다. 이를 위해, RNA는 손상 후 상이한 지점에서 면역형광에 사용되는 동일한 TA 근육의 일부로부터 단리될 수 있다(상기 단계 참조). 비드 비터는 조직을 균질화하기 위해 구아니듐 티오시아네이트와 조합하여 사용되었다. 클로로포름을 첨가한 후 원심분리한 후, 상부 RNA 함유층을 조심스럽게 추출하고, 미니 스핀 컬럼을 RNA 클린업에 사용하였다(도 5C). 이 방법은 RT-qPCR 및 RNAseq와 같은 모든 다운스트림 분석에 적합한 고품질의 RNA를 일상적으로 생산합니다. RT-qPCR의 경우, 하우스키핑 유전자에 대한 아디포제닉의 상대적 발현 수준을 결정하고, 임의의 상대적 변화를 ΔΔCT 방법38에 따라 평가하였다. 도 5D에 기재된 바와 같이, 손상되지 않은 TA 근육과 비교하여, 글리세롤 손상은 손상 후 3일 이내에 Pparg 및 Cebpα와 같은 초기 아디포제닉 마커의 발현을 유도한다. 성숙 마커, 예컨대 아디포넥틴 (Adipoq) 및 페리리핀 (Plin1)은 글리세롤 손상 후 5일 이내에 검출될 수 있다.
지방세포의 유전 혈통 추적 여기에 제시된 지방세포 염색 프로토콜은 FAP의 유전적 혈통 추적을 포함하도록 쉽게 적응될 수 있으며, 그들의 운명을 지방세포로 지도화하고 따라갈 수 있다. 우리는 예를 들어, 재조합이 PdgfrαCreERT2에서 타목시펜 투여를 통해 유도될 수 있다는 것을 이전에 입증하였다; Rosa26 EYFP 마우스는 손상 2주 전에, 플록스 정지 코딩을 효과적으로 제거하고 FAPs에서 EYFP 발현을 불가분하게 활성화시켰다(도 6A). 우리는 여기에 제시된 타목시펜 요법으로 높은 재결합 효율을 달성했으며, PDGFRα + FAP의 ~ 75 %가 EYFP20을 발현하며 다른 실험실에서 27,39,40을보고한 것과 유사합니다. FAP가 실제로 근육 내 지방의 세포 기원임을 입증하면서, 대부분의 FAP는 글리세롤 손상 후 7 일 후에 EYFP+ PERILIPIN을 발현하는 지방세포로 변했습니다 (그림 6B).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig6v3.jpg"> 그림 6: FAP의 계보 추적. (A) 실험 설정의 개략적인 개요. (B) PDGFRα+ FAP(적색, 화살촉) 및 PERILIPIN+ 지방세포(적색, 별표) 내에서 EYFP(황색)의 성공적인 재조합 및 활성화를 보여주는 대표적인 면역형광 이미지. 스케일 바: 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig6v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
여러 세포 유형의 검출 이 프로토콜은 또한 근인성 구획을 시각화하는데 사용될 수 있다. PAX7 및 MYOD1에 대한 항체를 사용하여, 근육 줄기 세포 (MuSCs) 및 근모세포는 각각 PFA 고정 근육 조직 절편에서도 글리세롤 손상 후 5일 후에 쉽게 검출될 수 있다(도 7). 따라서, 제시된 프로토콜은 다재다능하고 표지 및 이미지 지방세포 및 FAPs뿐만 아니라 근인성 혈통의 다른 세포 유형에도 적응할 수 있다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig7v2.jpg"> 도 7: 근육줄기세포 및 근원세포 면역형광 염색 . (A) 실험 설정의 개략적인 개요. (b) 근육 줄기세포(MuSC)를 PAX7로 염색하고 근모세포(노란색, 오른쪽)를 MYOD1로 성공적으로 염색한 것을 보여주는 대표적인 면역형광 이미지. LAMININ은 근섬유 (흰색)를 윤곽을 그리며 핵은 시안색입니다. 배율 막대: 50μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig7v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 비디오 1 : FAP의 3D 렌더링. 근섬유, FAPs 및 핵의 입체 재구성은 각각 손상 후 21일째에 PHALLOIDIN(회색), PDGFRα(녹색) 및 DAPI(파란색)에 대해 염색하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/FAPs.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 비디오 2 : 근육 내 지방의 3D 렌더링. 글리세롤 손상 후 21 일 동안 근섬유를 대체 한 근섬유 다발 (회색, PHALLOIDIN)과 근육 내 지방 (적색, PERILIPIN)의 체적 렌더링. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/FAT.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

건강한 근육 조직을 근육 내 지방으로 대체하는 것은 인간의 질병과 상태의 두드러진 특징입니다. 이 프로토콜은 근육 내 지방을 시각화, 이미지 및 정량화하는 방법을 간략하게 설명하여 근육 내 지방 형성의 기초가되는 메커니즘에 대한 엄격한 연구를 가능하게합니다.

Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) are mesenchymal stromal cells that play a crucial role during skeletal muscle homeostasis and regeneration. FAPs build ...

유육종증과 신경근 질환의 특징인 근육 내 지방을 연구하는 데 있어 중요한 장벽 중 하나는 특히 동결 조직 절편에서 지방세포의 효과적인 보존과 후속 시각화입니다. 이 프로토콜은 근육 내 지방의 견고하고 엄격하며 재현 가능한 시각화 및 정량화를 위해 정렬 된 지방 세포 형태학 및 골격근 절편을 보존합니다. 우리의 분석 파이프 라인은 Duchenne 근육 이영양증과 같은 질병에서 지방 형성을 예방하기위한 새로운 개입을 검증하기위한 프레임 워크를 제공합니다 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 기술자 인 Connor Johnson이 될 것입니다.시작하려면 다리를 청소하여 신선한 알코올 닦아내기를 주입하여 소독하십시오. 30 ~ 50 마이크로 리터의 50 % 글리세롤을 인슐린 주사기에 넣으십시오. 정강이에 머리카락을 부드럽게 닦아 TA의 위치를 노출시킵니다. TA를 찾은 후, 바늘을 발목 근처의 원위 방향으로 TA에 삽입하십시오.바늘을 근육에 완전히 삽입하고 천천히 글리세롤을 주입하면서 점차적으로 바늘을 꺼내어 근육의 대부분을 손상시키는 데 도움이됩니다. 70 % 에탄올로 자르는 마우스의 모든 부위를 자유롭게 스프레이하여 머리카락을 해부 부위와 악기에서 떼어 낼 수 있도록하십시오. 가위를 사용하여 골반 근처의 다리 꼭대기 주위의 피부를 자릅니다.다리의 피부를 위에서 발목까지 부드럽게 당깁니다. 먼저, TA를 수확하기 전에 날카로운 팁 핀셋을 사용하여 외부 결합 조직층을 제거한다. 근육의 바닥에서 TA 아래의 핀셋을 밀어 원위 힘줄에서 시작하여 무릎쪽으로 부드럽게 위로 당깁니다. 근육의 끝에서 멈추십시오.아래 무릎에서 느껴지는 저항을 지나치지 마십시오. 무릎 아래에 도달하기 전에 상당한 저항이있는 경우, 결합 조직의 남은 층을 멈추고 계속 제거하십시오. TA가 핀셋으로 다리에서 부분적으로 들어 올려지면 메스와 동일한 동작을 사용하여 TA와 무릎 아래 연결을 끊습니다.발목의 힘줄을 가위로 장하여 TA를 완전히 제거하십시오. 섬유의 손상을 피하기 위해 힘줄의 근육 만 다루십시오. 힘줄 반대편에있는 끝에서 TA의 삼분의 일을 자릅니다. 마이크로 원심 분리 튜브에 넣고 액체 질소에 떨어 뜨려 스냅하십시오.조직의 다른 두 삼분의 일을 조직학을 위해 4%PFA로 표지된 웰에 잠급니다. 첫 번째와 마지막 조직이 고정에 배치 된 시점을 추적하십시오. 네 섭씨 온도에서 두 시간 반 동안 너트 레이터에 놓습니다.고정 후 웰에서 PFA를 제거하십시오. 조직을 차가운 1X PBS로 두세 번 헹구고 세척당 5분 동안 차가운 1X PBS로 두세 번 세척한다. 웰로부터 PBS를 제거하고 조직이 부유할 수 있도록 1X PBS에 충분한 30%수크로오스를 첨가한다.밤새 섭씨 네 도에서 너트 레이터에 올려 놓으십시오. 현미경을 켜고 이미징 소프트웨어를 시작하십시오. 슬라이드를 스테이지에 고정합니다.모든 채널을 사용하여 이미지화할 영역을 식별합니다. 이미징 소프트웨어에서 각 채널의 게인 및 노출 시간을 조정합니다. 각 채널에서 전체 조직의 이미지를 촬영하고 개별 타일을 병합하여 전체 TA 단면의 합성을 만듭니다.시작하기 전에 RNase 유리 물을 섭씨 45도까지 예열하고 신선한 70 % 에탄올을 준비하십시오. 1000 마이크로 리터의 구아니디늄 티오시아네이트를 샘플이 들어있는 각 튜브에 첨가하십시오. 비드 비터 승인 튜브를 사용하는 것이 중요합니다.세 개의 중간 구슬 또는 하나의 크고 작은 구슬을 각 튜브에 추가하십시오. 비드 비터를 사용하여 조직을 50 헤르츠에서 두 내지 네 분 동안 균질화한다. 조직 유형 및 샘플 크기에 따라 최대 10분이 걸릴 수 있습니다.클로로포름 200 마이크로 리터를 첨가하십시오. 샘플을 15초 동안 흔든다. 실온에서 두세 분 동안 인큐베이션한다.12에서 15분 동안 원심분리하고, 350 마이크로리터의 투명한 상청액을 350 마이크로리터의 G.Pipette에서 000배 첨가하고, 350 마이크로리터의 70% 에탄올을 함유하는 새로운 마이크로 원심분리 튜브에 첨가한다. 하부 단백질 및/또는 DNA 층을 흡인하지 않도록 주의하십시오. 이 혼합물의 최대 700 마이크로리터를 두 밀리리터 수집 튜브에 놓인 미니 스핀 컬럼으로 옮깁니다.제조업체의 지침에 따라 RNA 분리를 계속하십시오. 예상 수율에 따라 30 ~ 50 마이크로 리터의 RNase 유리 물로 희석하십시오. RNA를 얼음 위에 보관하고 분광 광도계를 사용하여 수율을 측정하십시오.저장된 RNA를 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 최대 한 마이크로그램의 RNA를 사용하여 cDNA를 cDNA 합성 키트로 합성하고 제조업체의 지침에 따라 cDNA를 합성합니다. 실행이 완료되면 80 마이크로 리터의 RNase 유리 물을 첨가하십시오.샘플을 영하 20도에 보관하십시오. 384 웰 포맷을 사용하여 각 웰의 바닥에 프라이머 한 마이크로리터를 첨가한다. 자유 건조 프라이머는 더 엄격한 기술적 반복을 초래합니다.프라이머가 완전히 증발 할 때까지 덮으십시오. 네 개에서 여덟 개의 기술적 반복실험으로 샘플 반응을 설정합니다. PCR 실행이 완료된 후, 원시 주기 역치 값을 하우스 키핑 유전자 수준으로 정규화하고 델타 델타 Ct.Perilipin 및 고정되지 않은 TA의 양성 지방세포를 계산하여 폴드 변화를 결정함으로써 고정 된 섹션에 비해 형태학이 크게 변경되어 식별, 시각화 및 후속 정량화가 훨씬 어렵고 잠재적으로 부정확 해집니다.대조적으로, PFA 고정은 지방세포 형태를 보존하여 근육 내 지방의 정확한 검출을 가능하게 합니다. 손상되지 않은 TA 근육과 비교하여, 글리세롤 손상은 손상 후 사흘 이내에 PPAR 감마 및 CEBP 알파와 같은 초기 아디포제닉 마커의 발현을 유도한다. 아디포넥틴 및 페리리핀과 같은 성숙한 마커는 글리세롤 손상 후 오일부터 검출될 수 있다.유전적 혈통 추적을 사용하여, 대부분의 PDGF 수용체 알파 FAPs는 계통 마커 EYFP를 발현한다. 글리세롤 손상 후 칠일 후, EYFP 양성 FAP는 지방세포를 발현하는 EYFP 양성 페리리핀으로 변하여 FAP가 실제로 근육내 지방의 세포 기원임을 입증합니다. 프로토콜은 또한 근인성 구획을 시각화하도록 적응될 수 있다.PAX7 및 MYOD1에 대한 항체를 사용하여, 근육 줄기 세포 및 근원세포 마커는 각각 PFA 고정 근육 조직 절편에서도 글리세롤 손상 후 오일 동안 용이하게 검출될 수 있다. 이 프로토콜은 또한 지방세포 및 다른 성인 조직을 시각화하고 정량화하도록 적응될 수 있다. 또한, 우리의 조직 보존 기술은 다양한 서있는 기술과 호환됩니다.

a-guide-to-examining-intramuscular-fat-formation-its-cellular-origin

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

인간의 근육에서 유래한 주요 부착 세포 유형은 근육 세포와 섬유아세포입니다. 여기에서 세포 집단은 CD56 항원을 기반으로 하는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 농축됩니다. 이후 특정 항체를 사용한 면역 라벨링과 이미지 분석 기법을 사용하여 개별 세포의 세포질 및 핵 특성을 정량화할 수 있습니다.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

때문에 비만 및 다른 동반 질환의 급격한 음의 연결, 역할 지방에 대한 연구는 질병에 재생 및 전반적인 건강을 보증합니다. 우리는 고립과 현장에서 사용하여 지방의 연구를 허용 지방 창고의 절제 및 생체 외 방법에 프로토콜을 제시한다.

현지화, 식별 및 절제 쥣과 지방이 종점의

지방세포는 별도의 창고에 존재하며 고유한 미세 환경 내에서 다양한 역할을 합니다. 지방세포 의 특성과 기능의 지역적 차이가 드러나기 때문에, 표준화된 식별과 창고의 격리는 현장의 발전을 위해 매우 중요합니다. 본 명세서에서, 우리는 다양한 마우스 지방 창고의 절제에 대한 상세한 프로토콜을 제시한다.

다양한 마우스 지방 창고의 식별 및 해부

증가하는 증거는 골격근 내부의 지질의 과도한 침투가 지방 독성과 당뇨병을 초래한다는 것을 나타냅니다. 여기에서, 우리는 조직 처리, Bodipy로 염색, 이미지 획득 및 분석을 포함하는 완전한 프로토콜을 제시하여 섬유 유형 특이적 방식으로 지질 방울의 크기, 밀도 및 세포 내 분포를 정량화한다.

골격근의 지질 액적 함량의 섬유 유형 및 세포내 특이적 분석

지방세포는 갓 태어난 마우스의 견갑골 간 갈색 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 분리하여 지질 방울을 축적하고 분자 마커를 발현하며 성숙한 갈색 지방세포의 미토콘드리아 형태를 보여주는 세포로 분화합니다. 이러한 세포는 면역 형광 및 투과 전자 현미경으로 추가로 분석됩니다.

Differentiation and Imaging of brown adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice(신생아 마우스의 견갑간 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 갈색 지방세포의 분화 및 이미징)

본 연구는 온전한 근육 부피를 통해 근육 내 지방 조직(IMAT) 침착을 시각화 및 정량화하고 IMAT를 구성하는 개별 지방 세포의 메트릭을 정량화하기 위한 탈세포화 기반 방법론을 설명합니다.

골격근 지방 침윤의 탈세포화 기반 정량화

우리는 육질 형질의 차이를 설명하기 위해 Bos indicus 와 교배된 황소의 골격근 조직을 조사했다. Warner-Bratzler 전단력(WBSF)은 4.7kg에서 4.2kg 범위로 밝혀졌습니다. Myosin heavy chain isoforms는 동물 간의 차이를 밝혀냈고, myofibril fragmentation index는 압통도(WBSF) 변화에 대한 추가 통찰력을 제공했습니다.

Longissimus 근육 탐구 : Bos indicus 및 교잡 황소의 육류 품질과의 상관 관계 밝혀기

근육 간 지방 조직(IMAT)의 생물학은 인체 조직의 접근성이 제한되어 있기 때문에 대부분 탐구되지 않았습니다. 여기에서는 이 고유한 지방 저장소의 세포 구성을 식별하기 위해 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 위한 냉동 인간 IMAT의 핵 분리 및 라이브러리 준비에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

인간 근육 간 지방 조직에서 핵 분리 및 다운스트림 단일 핵 RNA 염기서열분석

이 연구에서는 제브라피시 유충에 대해 EBD(Evans Blue Dye) 분석을 수행하는 간단한 방법을 설명합니다.  이 기술은 골격근 무결성의 특성화와 근이영양증의 제브라피시 모델을 묘사하기 위한 강력한 도구이며 새로운 치료법 개발을 위한 귀중한 방법입니다.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

얼룩말은 근육 기능과 질병을 연구하는 훌륭한 모델입니다. 초기 배발생 동안 제브라피쉬는 규칙적인 근육 수축을 시작하여 리드미컬한 수영 행동을 일으키며, 이는 근육이 파괴될 때 변경됩니다. 여기에서는 근육 기능의 척도로서 수영 성능을 조사하기 위해 촉각 유발 반응 및 운동 분석에 대해 설명합니다.

터치 유발 대응 및 로코 분석 실험을 사용하여 Zebrafish의 근육의 성능 및 기능을 평가하기 위해

배우세요 근육 내 지방 시각화 및 정량화 프로토콜을 통해 골격근에서 지방세포 형성 메커니즘을 연구하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 근육병 연구에 활용됩니다.

근육 내 지방 형성과 골격근의 세포 기원을 조사하는 가이드

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