Name: 길이 척도에 걸친 염색체 형태 포착 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 배우세요 Hi-C 3.0 프로토콜을 사용하여 다양한 길이 척도에서 염색체 접힘 특징을 정확하게 탐지하는 방법을. 포르말데히드와 DSG 교차결합제를 활용하여 프로모터-인핸서 상호작용을 분석하고 낮은 배경 신호로 고품질 시퀀싱 라이브러리를 생성합니다.

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프로토콜 개발을 위해 Denis Lafontaine과 생물 정보학 지원을 위해 Sergey Venev에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 공통 기금 4D 뉴클레옴 프로그램에서 JD(U54-DK107980, UM1-HG011536)로의 보조금으로 지원되었습니다. JD는 Howard Hughes Medical Institute의 연구원입니다.
이 문서는 HHMI의 출판물에 대한 오픈 액세스 정책의 적용을 받습니다. HHMI 연구소장은 이전에 대중에게 비독점적 CC BY 4.0 라이선스를 부여하고 연구 논문에서 HHMI에 대한 재라이선스 라이선스를 부여했습니다. 이러한 라이선스에 따라 저자가 수락한 이 논문의 원고는 출판 즉시 CC BY 4.0 라이선스에 따라 무료로 사용할 수 있습니다.

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<li>Akgol Oksuz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+chromosome+conformation+capture+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays.</a> Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).</li>
<li>Ghuryeid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+Hi-C+links+with+assembly+graphs+for+chromosome-scale+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrating Hi-C links with assembly graphs for chromosome-scale assembly.</a> PLoS Computational Biology. 15 (8), 1007273(2019).</li>
<li>Gu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-mapping+of+nuclear+compartments+using+ultra-deep+Hi-C+shows+that+active+promoter+and+enhancer+elements+localize+in+the+active+A+compartment+even+when+adjacent+sequences+do+not%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Fine-mapping of nuclear compartments using ultra-deep Hi-C shows that active promoter and enhancer elements localize in the active A compartment even when adjacent sequences do not.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+3D+genome+architecture+through+in+situ+DNase+Hi-C%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mapping 3D genome architecture through in situ DNase Hi-C.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2104-2121 (2016).</li>
<li>Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C+3.0%3A+Improved+Protocol+for+Genome-Wide+Chromosome+Conformation+Capture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hi-C 3.0: Improved Protocol for Genome-Wide Chromosome Conformation Capture.</a> Current Protocols. 1 (7), 198(2021).</li>
<li>Belton, J. -M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+A+comprehensive+technique+to+capture+the+conformation+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Hi-C: A comprehensive technique to capture the conformation of genomes.</a> Methods. 58 (3), 268-276 (2012).</li>
<li>Truch, J., Telenius, J., Higgs, D. R., Gibbons, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+tackle+challenging+ChIP-Seq%2C+with+long-range+cross-linking%2C+Using+ATRX+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">How to tackle challenging ChIP-Seq, with long-range cross-linking, Using ATRX as an example.</a> Methods in Molecular Biology. 1832, Clifton, N.J. 105-130 (2018).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">In situ chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Current Protocols. 1 (8), 174(2021).</li>
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<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+dynamics+of+chromosomal+organization+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle dynamics of chromosomal organization at single-cell resolution.</a> Nature. 547 (7661), 61-67 (2017).</li>
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<li>Meng, L., Wang, C., Shi, Y., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Si-C+is+a+method+for+inferring+super-resolution+intact+genome+structure+from+single-cell+Hi-C+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Si-C is a method for inferring super-resolution intact genome structure from single-cell Hi-C data.</a> Nature Communications. 12 (1), 4369(2021).</li>
<li>Tavares-Cadete, F., Norouzi, D., Dekker, B., Liu, Y., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-contact+3C+reveals+that+the+human+genome+during+interphase+is+largely+not+entangled%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multi-contact 3C reveals that the human genome during interphase is largely not entangled.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1105-1114 (2020).</li>
<li>Vermeulen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-contact+4C%3A+long-molecule+sequencing+of+complex+proximity+ligation+products+to+uncover+local+cooperative+and+competitive+chromatin+topologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multi-contact 4C: long-molecule sequencing of complex proximity ligation products to uncover local cooperative and competitive chromatin topologies.</a> Nature Protocols. 15 (2), 364-397 (2020).</li>
<li>Oomen, M. E., Hedger, A. K., Watts, J. K., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+chromatin+interactions+between+and+along+sister+chromatids+with+SisterC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting chromatin interactions between and along sister chromatids with SisterC.</a> Nature Methods. 17 (10), 1002-1009 (2020).</li>
<li>Mitter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+sister+chromatids+in+the+replicated+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformation of sister chromatids in the replicated human genome.</a> Nature. 586 (7827), 139-144 (2020).</li>
<li>Krietenstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+Details+of+Mammalian+Chromosome+Architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural Details of Mammalian Chromosome Architecture.</a> Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).</li>
<li>Hughes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+hundreds+of+cis-regulatory+landscapes+at+high+resolution+in+a+single%2C+high-throughput+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment.</a> Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).</li>
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<li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li>
<li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiChIP%3A+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

세포 취급을 위한 중요한 단계 더 적은 수의 입력 셀을 사용할 수 있지만 이 프로토콜은 딥 시퀀싱 후 적절한 복잡성을 보장하기 위해 시퀀싱 레인당 ~5 × 106개의 셀(~400M 읽기)에 최적화되었습니다. 세포는 고정 전에 가장 잘 계산됩니다. 울트라딥 라이브러리 생성을 위해 일반적으로 원하는 판독 깊이에 도달할 때까지 레인(및 셀)의 수를 곱합니다. 최적의 고정을 위해, FA 고정 전에 혈청 함유 배지를 PBS로 교체해야하며, 고정 용액은 농도 구배15,22없이 즉시 첨가되어야한다. 세포 수확의 경우, 트립신 화 후 더 평평한 모양에서 구형으로의 전환이 핵 형태에 영향을 미칠 수 있기 때문에 트립신 화보다 스크래핑이 선호됩니다. DSG를 첨가 한 후에는 느슨하고 덩어리진 세포 펠릿이 쉽게 손실됩니다. 이 단계에서 셀을 취급할 때 주의하고 응집을 줄이기 위해 최대 0.05% BSA를 추가하십시오.
방법 수정 이 프로토콜은 인간 세포17을 사용하여 개발되었습니다. 그러나 염색체 형태 포획 경험에 비추어 볼 때 이 프로토콜은 대부분의 진핵 세포에서 작동해야 합니다. 상당히 낮은 입력(~1 × 106 셀)의 경우 용해 및 형태 캡처 절차[단계 2.1-2.4]에 볼륨의 절반을 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 또한 1.7mL 튜브가 있는 탁상용 원심분리기에서 DNA 분리[단계 2.5]를 수행할 수 있게 하여 낮은 DNA 농도에 대한 펠릿화를 개선할 수 있습니다. DNA의 정량화 (2.6.6 단계)는 진행 방법을 나타냅니다. 소량의 분리 된 DNA (1-5 μg)의 경우 크기 선택 (3.3 단계)을 건너 뛰고 CFU로 부피를 130 μL에서 ~ 45 μL로 줄인 후 비오틴 제거를 진행하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜은 FA 및 DSG와의 후속 가교 및 DpnII 및 DdeI와의 분해 후 고품질 데이터를 보장하기 위해 특별히 개발되었습니다. 그러나 FA에 이어 EGS (에틸렌 글리콜 비스 (숙신이 미딜 숙시 네이트))와 같은 대안적인 가교 전략은 ChIP-seq23 및 ChIA-PET24에서도 사용되며17도 똑같이 잘 작동 할 수 있습니다. 유사하게, 상이한 효소 조합, 예컨대 DpnII 및 HinfI18 또는 MboI, MseI, 및 NlaIII19가 소화에 사용될 수 있다. 효소 조합을 조정할 때 특정 5' 오버행을 채울 수 있는 비오티닐화 뉴클레오티드를 사용하고 각 칵테일에 가장 최적의 완충액을 사용해야 합니다. DpnII는 자체 완충액과 함께 제공되며 효소 제조업체는 DdeI 분해를 위한 특정 완충액을 권장합니다. 그러나 이 프로토콜에서 DpnII 및 DdeI를 사용한 이중 분해의 경우 제한 버퍼는 두 효소 모두에 대해 100% 활성으로 평가되기 때문에 권장됩니다.
형태 캡처 문제 해결 염색체 형태 포착의 세 가지 주요 단계인 가교, 소화 및 종교화는 결과를 젤에 시각화하기 전에 모두 수행되었습니다. 이 세 단계 각각의 품질을 결정하고 문제가 발생할 수 있는 부분을 식별하기 위해 분해 전후(CI) 분취량을 가져와 결찰된 Hi-C 샘플과 함께 젤에 로드합니다(그림 2). 이 젤은 Hi-C 샘플의 품질과 프로토콜을 계속할 가치가 있는지 여부를 결정하는 데 사용됩니다. CI 및 DC가 없으면 잠재적인 차선의 단계를 정확히 찾아내기가 어렵습니다. 차선의 결찰은 결찰 자체의 문제, 채우기 또는 가교 문제로 인한 것일 수 있습니다. 가교 문제를 해결하려면 라이브러리당 1개 × 10개 7개 이상의 세포를 사용하지 말고 새로운 가교 시약과 깨끗한 세포(즉, PBS로 헹궈짐)로 시작하십시오. 결찰을 위해 세포와 결찰 혼합물이 얼음 위에 보관되어 있는지 확인하십시오. 16°C에서 4시간 인큐베이션 직전에 T4 DNA 리가아제를 첨가하고 잘 혼합한다.
라이브러리 준비 문제 해결 10회 이상의 PCR 주기가 필요하거나 PCR 적정 후 겔에서 PCR 산물을 볼 수 없는 경우(그림 4), Hi-C 샘플을 저장할 수 있는 몇 가지 옵션이 있습니다. PCR 적정에서 다시 작업하면 첫 번째 옵션은 PCR을 다시 시도하는 것입니다. 여전히 생성물이 충분하지 않은 경우, 비드를 1x TLE 완충액으로 2회 세척한 후 A-테일링 및 어댑터 라이게이션(단계 3.6)의 또 다른 라운드를 시도할 수 있다. 이 추가 A-테일링 및 어댑터 결찰 후 이전과 같이 PCR 적정을 진행할 수 있습니다. 여전히 제품이 없으면 마지막 옵션은 3.3 단계에서 0.8x 분수를 다시 음압하고 거기에서 진행하는 것입니다.
Hi-C3.0의 한계와 장점 Hi-C는 세포 집단에서 유전자좌 쌍 간의 상호 작용의 평균 빈도를 캡처하는 집단 기반 방법이라는 것을 인식하는 것이 중요합니다. 일부 전산 분석은 집단25에서 형태의 조합을 풀도록 설계되었지만 원칙적으로 Hi-C는 세포 간의 차이를 인식하지 못합니다. 단일 셀 Hi-C(26,27)를 수행할 수 있고 계산 추론(28)을 수행할 수 있지만, 단일 셀 Hi-C는 초고해상도 3C 정보를 얻기에 적합하지 않습니다. Hi-C의 추가 제한 사항은 쌍별 상호 작용만 감지한다는 것입니다. 다중 접촉 상호 작용을 감지하기 위해 짧은 읽기 시퀀싱(Illumina)16과 결합된 빈번한 커터를 사용하거나 PacBio 또는 Oxford Nanopore 플랫폼의 긴 읽기 시퀀싱을 사용하여 다중 접촉 3C29 또는 4C30을 수행할 수 있습니다. 자매 염색분체 사이의 접촉을 특이적으로 감지하기 위한 Hi-C 유도체도 개발되었습니다.31,32.
Hi-C19 및 Micro-C33을 사용하여 서브킬로베이스 해상도에서 접촉 맵을 생성할 수 있지만 둘 다 많은 양의 시퀀싱 읽기가 필요하며 이는 비용이 많이 드는 작업이 될 수 있습니다. 비용 없이 유사하거나 더 높은 분해능을 얻기 위해 특정 게놈 영역(캡처-C 34) 또는 특정 단백질 상호 작용(ChiA-PET 35, PLAC-seq36, Hi-ChIP37)에 대한 농축을 적용할 수 있습니다. 이러한 보강 응용 프로그램의 강점과 단점은 제한된 수의 상호 작용만 샘플링된다는 것입니다. 이러한 보강으로 Hi-C의 글로벌 측면 (및 글로벌 정규화 옵션)이 손실됩니다.
Hi-C3.0의 중요성과 잠재적 응용 분야 이 프로토콜은 고분해능, 초심층 3C를 가능하게 하는 동시에 TAD 및 구획(17 )과 같은 대규모 폴딩 기능을 감지하도록 설계되었습니다(그림 6). 이 프로토콜은 각 Hi-C 라이브러리에 대해 튜브당 5개 × 10개6 개의 셀로 시작하며, 이는 최대 10억 개의 쌍 최종 판독을 얻기 위해 플로우 셀에서 하나 또는 두 개의 레인을 시퀀싱하기에 충분한 재료여야 합니다. 초심층 시퀀싱의 경우 매핑된 판독 및 PCR 중복 수에 따라 5 × 106 세포의 다중 튜브를 준비해야 합니다. 최고 해상도(<1kb)에서 루핑 상호작용은 대부분 CTCF 부위 사이에서 발견되지만 프로모터-인핸서 상호작용도 검출할 수 있습니다. 독자는 데이터 분석에 대한 자세한 설명을 위해 Akgol Oksuz et al.17 을 참조할 수 있습니다.

염색체 형태 포착은 2002 년부터 사용되었습니다1. 기본적으로 모든 형태 포착 변형은 3D 염색질 조직을 보존하기 위해 DNA-단백질 및 단백질-단백질 상호 작용의 고정에 의존합니다. 그 다음에는 일반적으로 제한 소화에 의한 DNA 단편화가 뒤따르고, 마지막으로 주변 DNA의 종교화가 말단에 이르러 공간적으로 근위 유전자좌를 고유한 공유 DNA 서열로 변환합니다. 초기 3C 프로토콜은 PCR을 사용하여 특정 "일대일" 상호 작용을 샘플링했습니다. 후속 4C 분석은 "일대일" 상호작용2의 검출을 허용한 반면, 5C는 "다대다" 상호작용3을 검출하였다. 염색체 형태 캡처는 차세대 고처리량 시퀀싱(NGS)을 구현한 후 완전한 결실을 맺었으며, 이를 통해 게놈 전체의 Hi-C4 및 3C-seq5, TCC6 및 Micro-C 7,8과 같은 유사한 기술을 사용하여 "올-투-올" 게놈 상호 작용을 검출할 수 있었습니다(Denker 및 De Laat9의 검토 참조).
Hi-C에서 비오틴화 뉴클레오티드는 소화 후 및 결찰 전에 5' 돌출부를 표시하는 데 사용됩니다(그림 1). 이를 통해 스트렙타비딘 코팅 비드를 사용하여 적절하게 소화되고 재생산된 단편을 선택할 수 있어 GCC10과 차별화됩니다. Hi-C 프로토콜에 대한 중요한 업데이트는 가짜 결찰 생성물을 줄이기 위해 손상되지 않은 핵(즉, 제자리)에서 소화 및 알코올화를 수행한 Rao et al.11에 의해 구현되었습니다. 또한 HindIII 분해를 MboI (또는 DpnII) 분해로 대체하면 단편 크기가 감소하고 Hi-C의 분해능 잠재력이 증가했습니다. 이러한 증가는 상대적으로 작은 스케일의 구조의 검출 및 작은 시스-요소 사이의 DNA 루프, 예를 들어, 루프 압출(11,12)에 의해 생성된 CTCF-결합 부위 사이의 루프와 같은 접촉점의 보다 정확한 게놈 국소화를 가능하게 하였다. 그러나 이러한 잠재력에는 대가가 따릅니다. 첫째, 해상도가 2배 증가하려면 시퀀싱 읽기13이 4배(22) 증가해야 합니다. 둘째, 작은 단편 크기는 소화되지 않은 이웃 단편을 소화되고 종교화된 단편(14)으로 착각할 가능성을 증가시킨다. 언급 한 바와 같이, Hi-C에서, 소화 된 단편과 종교화 된 단편은 결찰 접합부에 비오틴이 존재함으로써 소화되지 않은 단편과 다르다. 그러나, 결찰 접합부만 아래로 당겨지도록 하기 위해 의무가 없는 말단에서 적절한 비오틴 제거가 필요하다 14,15.
NGS의 비용이 감소함에 따라 염색체 접힘을 더 자세히 연구하는 것이 가능해졌습니다. DNA 단편의 크기를 감소시키고 그에 따라 분해능을 증가시키기 위해, Hi-C 프로토콜은 더 빈번하게 절단 제한 효소 16을 사용하거나 제한 효소17, 18,19의 조합을 사용하도록 적응될 수 있다. 대안적으로, 마이크로-C 중의 MNase 7,8 및 DNase Hi-C20 중의 DNase는 최적의 소화를 달성하기 위해 적정될 수 있다.
3C 방법의 기초에 대한 최근의 체계적인 평가는 모든 길이 척도에서 염색체 접힘 특징의 검출이 1 % FA와 3mM DSG17을 사용한 순차적 가교로 크게 향상되었음을 보여주었습니다. 또한 HindIII 분해가 가능한 Hi-C는 구획과 같은 대규모 접힘 특징을 감지하는 데 가장 적합한 옵션이었으며 Micro-C는 DNA 루프와 같은 소규모 접힘 특징을 감지하는 데 탁월했습니다. 이러한 결과는 FA 및 DSG 가교결합제의 조합과 DpnII 및 DdeI 엔도뉴클레아제21을 사용한 이중 분해를 사용하는 단일 고해상도 "Hi-C 3.0" 전략의 개발로 이어졌습니다. Hi-C 3.0은 모든 길이 스케일에서 접힘 형상을 정확하게 감지하기 때문에 일반적인 사용에 효과적인 전략을 제공합니다17. Hi-C 3.0 프로토콜의 실험 부분은 여기에 자세히 설명되어 있으며 시퀀싱 후 예상 할 수있는 일반적인 결과가 표시됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig01.jpg"> 그림 1: 6단계의 Hi-C 절차. 셀은 먼저 FA로 고정 된 다음 DSG (1)로 고정됩니다. 그런 다음 용해는 DdeI 및 DpnII로 이중 소화에 선행합니다 (2). 비오틴은 오버행 필인에 의해 첨가되고 근위 무딘 끝은 DNA 정제 (4) 전에 결찰됩니다 (3). 비오틴은 초음파 처리 및 크기 선택 전에 의무화되지 않은 끝에서 제거됩니다 (5). 마지막으로, 비오틴의 풀다운은 PCR에 의한 어댑터 결찰 및 라이브러리 증폭을 허용합니다(6). 약어 : FA = 포름 알데히드; DSG = 디숙신이미딜글루타레이트; B = 비오틴. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>1 kb Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500100</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 마그네틱 비드, 60 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU)</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC500396</td><td></td></tr><tr><td>Annealing Buffer (5x)</td><td>보충 자료</td><td></td>의 레시피 보기<td></td></tr><tr><td>ATP 10 mM</td><td>ThermoFisher</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-25i 고속 냉장 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브 35 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>357002</td><td></td></tr><tr><td>결합 완충액 (2x)</td><td>보충 자료</td><td></td><td></td>의 레시피 참조</tr><tr><td>biotin-14-dATP 0.4 mM</td><td>Invitrogen</td><td>19524-016</td><td></td></tr><tr><td>BSA 10 mg/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td>20 mg/mL</td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼</td><td>Falcon</td><td>353089</td><td></td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>원추형 폴리프로필렌 튜브 50 mL</td><td>Denville</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브 15 mL</td><td>Denville</td><td>C1017-P</td><td></td></tr><tr><td>Covaris 마이크로 튜브 AFA 섬유 스냅캡 130 &마이크로; L</td><td>Covaris</td><td>520045/520077</td><td></td></tr><tr><td>Covaris Sonicator</td><td>Covaris</td><td>E220/E220evolution/M220</td><td></td></tr><tr><td>배양 플라스크 175 cm2</td><td>Falcon</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>배양 플레이트 150 mm x 25 mm</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>dATP 1 mM</td><td>Invitrogen</td><td>56172</td><td></td></tr><tr><td>dATP 10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>56172</td><td></td></tr><tr><td>dCTP 10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>56173</td><td></td></tr><tr><td>DdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0175L</td><td></td></tr><tr><td>dGTP 10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>56174</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-5x10ML</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix 25 mM</td><td>Invitrogen</td><td>10297117</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homogenizer</td><td>DWK Life Sciences</td><td>8853010002/8853030002</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DpnII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543M</td><td></td></tr><tr><td>DSG</td><td>ThermoScientific</td><td>20593</td><td></td></tr><tr><td>dTTP 10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>56175</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 70%</td> <td>Fisher</td><td>A409-4</td><td>100%</td></tr> <tr><td>브롬화 에티듐</td>에서 희석 <td>Fisher</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>포름 알데히드 (37 %)</td> <td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>젤 로딩 염료 (6x)</td> <td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>초순수에 글리신 2.5 M</td><td>시그마</td><td>G8898-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630 세제</td><td>MP Biomedicals</td><td>198596</td><td></td></tr><tr><td>Klenow DNA 중합 효소 5 U /&micro; L</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment 3-->5' 엑소-, 5 U/&마이크로; L</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>ligation buffer (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>저분자량 DNA ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3233L</td><td></td></tr><tr><td>용해 완충액</td><td>보충 레시피 보기 재료</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자분 분리기</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge tubes 1.7 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>MyOne Streptavidin C1 beads</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1 (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3.1 (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70013-032</td><td></td></tr><tr><td>PCR (스트립) 튜브</td><td>Biorad</td><td>TBS0201/ TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>PCR 열순환기</td><td>Biorad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Pfu Ultra II 버퍼 (10x)</td><td>Agilent</td><td></td><td>Pfu</td></tr><tr><td>Ultra II Fusion HS DNA 중합효소가 포함되어 있습니다&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>600674</td><td></td></tr><tr><td>Phase lock tube 15 mL</td><td>Qiagen</td><td>129065</td><td></td></tr><tr><td>Phase lock tube 2 mL</td><td>Qiagen</td><td>129056</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td><td>Invitrogen</td><td>15593-049</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>초</td>순수 10 mg/mL Invitrogen <td></td> 중 ThermoFisher 78440 <td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td></td><td>25530-031</td><td></td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, DNase 및 프로테아제 무함유 10 mg/mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Argos Technologies</td><td>EW-04397-40 또는 Rocking Platform</td><td></td></tr><tr><td>SDS 1%</td><td>Fisher</td><td>BP13111</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate pH = 5.2, 3 M</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell GT 수평 전기영동 시스템</td><td>Biorad</td><td>1704401</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제 1 U/&micro; L</td><td>Invitrogen</td><td>100004817</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 중합효소 3 U/&micro; L</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>T4 결찰 완충액 (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>Y90001</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 10 U/&micro; L</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td></td></tr><tr><td>TBE buffer</td><td>보충 자료</td><td></td><td></td>의 레시피 보기</tr><tr><td>Tris Low EDTA Buffer (TLE)보충</td> <td>자료</td><td></td><td></td>의 레시피 보기</tr><tr><td>Triton X-100 (10%)</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Truseq adapter oligos</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT))https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td><td></td> <td>250 nmole 및 HPLC 정제</td></tr><tr><td>트윈 20 세제</td><td>Fisher</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>트윈 세척 버퍼</td><td>보충 자료</td><td></td><td></td>의 레시피 참조</tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>(G560)SI-0236</td><td></td></tr></tbody></table>

길이 척도에 걸친 염색체 형태 포착

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

염색체 형태 캡처(3C)는 3차원 염색질 상호 작용을 감지하는 데 사용됩니다. 일반적으로 포름알데히드(FA)와의 화학적 가교는 염색질 상호 작용을 수정하는 데 사용됩니다. 그런 다음 제한 효소를 사용한 염색질 분해와 단편 말단의 후속 재생은 3차원(3D) 근접성을 고유한 결찰 산물로 변환합니다. 마지막으로, 가교결합의 역전, 단백질 제거 및 DNA 분리 후, DNA를 전단하고 고처리량 시퀀싱을 위해 준비합니다. 유전자좌 쌍의 근접 결찰 빈도는 세포 집단의 3 차원 공간에서의 공동 국소화 빈도의 척도입니다.
시퀀싱된 Hi-C 라이브러리는 모든 유전자좌 쌍 간의 상호 작용 빈도에 대한 게놈 전체 정보를 제공합니다. Hi-C의 분해능과 정밀도는 염색질 접촉과 염색질의 빈번하고 균일한 단편화를 유지하는 효율적인 가교에 의존합니다. 이 논문에서는 두 개의 가교제(포름알데히드[FA] 및 디숙신이미딜 글루타레이트[DSG])를 결합한 후 두 가지 제한 효소(DpnII 및 DdeI)를 사용하여 더 미세하게 분해하여 가교 효율성을 높이는 개선된 현장 Hi-C 프로토콜인 Hi-C 3.0에 대해 설명합니다. Hi-C 3.0은 루프 및 토폴로지 연관 도메인(TAD)과 같은 더 작은 규모에서 게놈 접힘 특징과 구획과 같은 더 큰 핵 전체 규모의 특징을 정확하게 정량화하기 위한 단일 프로토콜입니다.

이 원고의 수치는 이전에 Lafontaine et al.21에 의해 출판된 것과 별도의 복제 실험에서 생성되었습니다. 고처리량 시퀀싱 데이터를 얻은 후 오픈 크로마틴 집단 (Open2C: https://github.com/open2c)을 사용하여 Hi-C 데이터를 처리했습니다. 유사한 파이프라인은 4D Nucleome 프로젝트(https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline)의 데이터 포털에서 찾을 수 있습니다. 간단히 말해서, Nextflow 파이프라인 증류기는 (https://github.com/open2c/distiller-nf) (1) Hi-C 분자의 서열을 참조 게놈에 정렬하고, (2) .sam 정렬을 구문 분석하고 Hi-C 쌍으로 파일을 형성하고, (3) PCR 중복을 필터링하고, (4) Hi-C 상호 작용의 빈 매트릭스로 쌍을 집계합니다. 쿨러라고 하는 이러한 HDF5 형식의 매트릭스는 (1) HiGlass 서버(https://higlass.io/)에서 볼 수 있으며, (2) 구획, TAD 및 루프와 같은 접는 특징을 추출하고 정량화하기 위해 Open Chromatin Collective(https://github.com/open2c/cooltools)에서 유지 관리하는 "cooltools" 컬렉션에 있는 대규모 오픈 소스 계산 도구 세트를 사용하여 분석할 수 있습니다.
Hi-C3.0 라이브러리의 일부 품질 지표는 몇 가지 간단한 메트릭/지표를 사용하여 판독 쌍을 참조 게놈에 매핑한 직후에 평가할 수 있습니다. 첫째, 전형적으로 ~50%의 서열화된 판독 쌍이 인간 세포에 대해 고유하게 맵핑될 수 있다. 염색체의 고분자 특성으로 인해 이러한 매핑된 판독의 대부분(~60%-90%)은 염색체(cis) 내의 상호 작용을 나타내며 상호 작용 빈도는 게놈 거리가 증가함에 따라 빠르게 감소합니다(거리 의존적 붕괴). 거리 의존적 붕괴는 게놈 거리의 함수로 접촉 확률(염색체 팔당)을 보여주는 "스케일링 플롯"에서 가장 잘 시각화할 수 있습니다. 우리는 다른 가교제와 효소의 사용이 장거리 및 단거리 거리에서 거리 의존적 붕괴를 변경할 수 있음을 발견했습니다17. DSG 가교결합을 추가하면 Mnase와 같은 효소 및 더 작은 단편을 생성하는 DpnII-DdeI의 조합과 결합할 때 단거리에서 상호 작용의 검출 가능성이 증가합니다(그림 6A).
거리 의존적 감쇠는 2D 상호 작용 매트릭스에서 직접 관찰 할 수도 있습니다 : 상호 작용은 중앙 대각선에서 멀리 떨어져있을 때 더 드물어집니다 (그림 6B). 또한 구획, TAD 및 루프와 같은 게놈 폴딩 특징은 Hi-C 매트릭스 및 스케일링 플롯에서 일반적인 게놈 전체 평균 거리 의존적 붕괴로부터의 편차로 식별 할 수 있습니다. 중요하게도, FA 외에 DSG와의 가교는 염색체의 중합체 특성으로 인해 제한되지 않는 무작위 결찰을 감소시키고, 따라서 염색체 사이(트랜스에서)에서 발생할 가능성이 더 높다는 것입니다(그림 6C). 무작위 결찰을 줄이면 특히 염색체 간 및 매우 긴 범위(&gt;10-50Mb) 염색체 내 상호 작용의 경우 신호 대 잡음비가 증가합니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2.jpg"> 그림 6: 매핑 및 필터링된 Hi-C 라이브러리의 대표적인 결과 . (A) 다양한 효소에 대한 접촉 확률 및 그 유도체가 포함된 스케일링 플롯으로, 단편 길이(상단) 및 FA 또는 FA + DSG와의 가교결합(하단)으로 정렬됩니다. MNAse(마이크로C) 또는 DpnII-DdeI(Hi-C 3.0)를 사용한 분해는 FA(하단)에 DSG를 추가하는 것과 마찬가지로 단거리 접촉(상단)을 크게 증가시킵니다. (B) 열은 FA 가교 후 DpnII 분해 및 FA + DSG 가교 후 DpnII 또는 DdeI 분해의 Hi-C 히트 맵을 보여줍니다. 흰색 화살표는 DSG 가교 및 DdeI 소화 후 "점"의 강도가 증가하는 것을 보여 주며 이는 DNA 루프의 더 나은 검출을 의미합니다. 행은 패널 C와 정렬하여 증가하는 해상도로 염색체 3의 다른 부분을 보여줍니다: 맨 위 줄: 전체 염색체 3(0-198,295,559Mb); 중간 줄 : 186-196 Mb; 맨 아래 줄: 191.0-191.5Mb. (C) A에 표시된 지역에 대한 커버리지 그래프. 검은색 화살표는 FA 전용 가교결합에 대한 낮은 커버리지(%cis 읽기)를 나타냅니다. 약어 : FA = 포름 알데히드; DSG = 디숙신이미딜글루타레이트; CHR = 염색체. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
매핑된 모든 읽기가 유용한 것은 아닙니다. 두 번째 품질 지표는 PCR 중복 수입니다. 정확한 중복 읽기는 결찰 및 초음파 처리 후 우연히 발생할 가능성이 거의 없습니다. 따라서 이러한 판독은 PCR 증폭으로 인한 것일 수 있으며 필터링해야 합니다. 복잡성이 낮은 라이브러리를 증폭하기 위해 너무 많은 PCR 주기가 필요할 때 중복이 자주 발생합니다. 일반적으로 Hi-C의 경우 대부분의 라이브러리는 적정 PCR에 의해 결정된 최종 PCR 증폭의 5-8주기만 필요합니다(3.9단계 참조; 그림 4). 그러나, 충분한 복잡성을 갖는 라이브러리는 PCR 증폭의 14 사이클 후에도 수득 될 수있다.
소위 광학 복제라고 하는 중복 읽기의 또 다른 범주는 패턴화된 플로우 셀(예: HiSeq4000)을 사용하는 Illumina 시퀀싱 플랫폼의 증폭 프로세스에서 발생할 수 있습니다. 광학 중복은 유동 세포에 과부하가 걸려 (큰) 클러스터를 두 개의 개별 클러스터라고 부르거나 첫 번째 PCR 후 원래 쌍을 이루는 말단 분자의 국소 재 클러스터링에서 발견됩니다. 두 가지 유형의 광학 복제는 모두 국소적이기 때문에 유동 세포에서의 위치에 따라 PCR 복제와 식별하고 구별할 수 있습니다. PCR 중복이 &gt;15%인 라이브러리는 재생성이 필요한 반면, 광학 중복이 있는 라이브러리는 로딩 프로세스를 최적화한 후 다시 로드할 수 있습니다.
보충 표 S1: 버퍼 및 용액. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Hi-C 3.0은 포름알데히드 및 디숙신이미딜글루타레이트 가교결합제를 DpnII 및 DdeI 제한 효소의 칵테일과 결합하여 신호 대 잡음비와 염색질 상호 작용 감지의 분해능을 높이는 개선된 Hi-C 프로토콜입니다.

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

이 프로토콜은 낮은 배경 신호로 여러 길이 스케일에 걸쳐 염색체 접힘 특징을 정확하게 감지합니다. 예를 들어, 프로모터 인핸서 상호작용은 염색체 구획의 맥락에서 분석될 수 있다. 제한 엔도뉴클레아제의 사용은 투입 물질의 분해 수준을 최적화하는 것을 우회합니다.결찰 제품을 포획하기 위해 겔 분리에 의한 선택이 필요하지 않습니다. 가장 일반적인 문제는 DSG 고정 후 세포가 손실되고 고품질 라이브러리를 생성하기에 충분한 DNA를 캡처하는 것입니다. 시작하려면 5 x 10을 포함하는 150mm 플레이트에서 진공 트랩에 연결된 파스퇴르 피펫으로 배지를 6 번째 셀로 흡입합니다.10 밀리리터의 HBSS로 세포를 두 번 씻으십시오. 세포를 가교하려면 23.125 밀리리터의 1 % 포름 알데히드 용액을 15 센티미터 플레이트에 붓습니다. 실온에서 10 분 동안 배양하고 2 분마다 손으로 플레이트를 부드럽게 흔 듭니다.다음으로, 1.25 밀리리터의 2.5 몰 글리신을 첨가하고 플레이트를 부드럽게 소용돌이 치며 가교 반응을 진정시킨 다음 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 가교를 중지하기 위해 15 분 동안 얼음에서 계속 배양하십시오. 세포 스크레이퍼 또는 고무 경찰관으로 플레이트에서 세포를 긁어 내고 세포 현탁액을 피펫으로 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.현탁액을 실온에서 10분 동안 1, 000회 G로 원심분리하고 흡인하여 상층액을 버린다. Dulbecco의 인산염 완충 식염수 또는 DPBS 10ml로 펠릿을 한 번 씻으십시오. 이어서, DSG 가교를 진행하기 전에 다시 원심분리한다.DSG와의 가교를 위해 펠렛 셀을 9.9ml의 DPBS에 재현탁시킵니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 300 밀리몰 DSG를 추가하십시오. 튜브를 반전으로 혼합하고 회전 장치에서 실온에서 40 분 동안 세포를 가교 결합시킵니다.가교 결합 후 1.925 밀리리터의 2.5 몰 글리신을 넣고 뒤집어 혼합하고 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 다음으로, 세포를 2, 000 배 G에서 15 분 동안 원심 분리하고 펠렛을 1.7 밀리리터 튜브로 옮기기 전에 0.05 % 소 혈청 알부민 DPBS 1 밀리리터에 재현탁시킨다. 세포를 섭씨 4도에서 15분 동안 2, 000배 G로 원심분리하고 상층액을 버린다.염색체 확인 캡처를 진행하기 전에 펠릿을 액체 질소에서 스냅 동결합니다. 10 마이크로리터의 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 1밀리리터의 빙냉 용해 완충액에 가교결합된 세포 분취량을 재현탁시키고, 얼음 상에서 15분 동안 Dounce 균질화기로 옮긴다. 유봉 A를 천천히 위아래로 30 번 움직여 세포를 균질화하고 1 분 동안 배양하여 세포가 30 회 더 치기 전에 식도록합니다.마지막 스트로크 후 용해물을 1.7 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 용해된 현탁액을 2, 500회 G에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 플릭 또는 와동하여 젖은 펠릿을 다시 부유시킵니다.가능한 한 많은 상청액을 제거하여 최소한의 덩어리로 요구르트와 같은 물질을 얻으십시오. 원심분리 전에 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 제한 버퍼에 펠릿을 재현탁합니다. 두 번째 세척 후, 셀 크기에 따라 펠릿의 캐리오버 부피에 대략 340 마이크로리터를 추가한 후 피펫팅에 의해 360 마이크로리터의 제한 완충액에 펠릿을 재현탁시킨다.염색질 무결성을 테스트하기 위해 18 마이크로 리터의 용해물을 따로 보관하거나 나머지 용해물을 CI.To 하고 38 마이크로 리터의 1 % 나트륨 도데 실 설페이트를 hi-C 튜브에 추가하여 총 부피 380 마이크로 리터를 만들고 기포를 도입하지 않고 피펫 팅하여 조심스럽게 혼합합니다. 염색질을 열기 위해 10분 동안 흔들지 않고 섭씨 65도에서 샘플을 배양합니다. 그런 다음 즉시 튜브를 얼음 위에 놓습니다.Triton X-100으로 소화 혼합물을 준비한 후이 혼합물 107 마이크로 리터를 hi-C 튜브에 첨가하여 총 부피 487 마이크로 리터를 만들고 간격 진탕으로 열 혼합기에서 섭씨 37도에서 밤새 염색질을 분해합니다. 다음날, 샘플을 섭씨 65도까지 20 분 동안 옮겨 나머지 엔도 뉴 클레아 제 활성을 비활성화시킵니다. 샘플을 얼음 위에 놓은 후 10마이크로리터의 소화 조절 또는 DC를 따로 보관하고 섭씨 4도에서 보관하십시오.피펫으로 또는 회전하여 뚜껑에서 응결을 제거하십시오. 그런 다음 58 마이크로 리터의 비오틴 필 인 믹스를 추가하여 총 부피를 535 마이크로 리터로 만듭니다. 기포를 형성하지 않고 부드럽게 피펫팅한 후 섭씨 23도에서 써모믹서에서 4시간 동안 배양합니다.배양 후, 665 마이크로 리터의 결찰 혼합물을 첨가하여 샘플 부피를 1, 200 마이크로 리터로 만든다. 피펫팅으로 샘플을 혼합하고 섭씨 16도에서 열혼합기에서 4시간 동안 배양합니다. 다음으로, 50 마이크로 리터의 단백질 분해 효소 -K를 두 개의 분획으로 hi-C 샘플 튜브에 첨가하고 간격 흔들림으로 섭씨 65도에서 밤새 배양합니다.DNA 정제를 위해 100% 얼음처럼 차가운 에탄올을 넣고 섭씨 4도에서 30분 동안 18, 000배 G에서 튜브를 원심분리합니다. 펠릿이 아닌 쪽에서 상청액을 완전히 제거하고 10분 동안 또는 펠릿이 눈에 띄게 건조될 때까지 샘플을 자연 건조합니다. 펠릿이 건조되면 피펫팅 또는 소용돌이를 통해 450마이크로리터의 트리스 저EDTA에 용해시킵니다.가용화된 현탁액을 3킬로달톤 분자량 컷오프를 사용하여 0.5mm 원심 필터 유닛 또는 CFU로 옮깁니다. CFU를 최대 속도로 10분 동안 원심분리하고 플로우 스루를 폐기합니다. 두 번째 세척 후 80 마이크로 리터의 트리스 저 EDTA를 컬럼에 첨가하십시오.컬럼을 새 수집 튜브로 전환하여 최대 속도로 2분 동안 원심분리합니다. 마지막으로 샘플을 0.8%아가로스 겔에 넣습니다. PCR 적정 결과가 있는 아가로스 겔은 대부분의 라이브러리가 최종 PCR 증폭의 5-8 사이클을 필요로 한다는 것을 보여주었습니다.아가로스 겔 상의 더 작은 단편에 의해 관찰된 바와 같이, 최종 증폭된 PCR 라이브러리의 세포 분해는 적절한 결찰 접합부의 존재를 확인하고 시퀀싱 전에 품질 검사의 역할을 한다. 시퀀싱 후, 매핑된 데이터는 DpnII와 DdeI의 조합이 종래의 포름알데히드 가교결합에 DSG를 첨가함에 따라 단거리 접촉을 상당히 증가시킨다는 것을 보여주었다. 향상된 신호는 2D 상호 작용 매트릭스에서 직접 장거리 및 단거리에서 관찰 할 수도 있습니다.구획 신호는 장거리에서 CRISPR이며 염색질 루프에 의해 형성된 점은 짧은 거리에서 더 두드러집니다. 포름 알데히드 외에도 DSG와의 가교는 무작위 결찰을 감소시켜 cis의 상대적 적용 범위를 향상시킵니다. 가교 도중과 가교 후에 세포를 잃지 않는 것이 중요합니다.세포 펠릿은 느슨하거나 보이지 않을 수 있으며 세포는 일부 완충액의 피펫 팁에 달라붙을 수 있습니다.

capturing-chromosome-conformation-across-length-scales

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

히 - C 방식은 염색질 상호 작용 (1) 편견, 게놈 차원의 식별이 가능합니다. 히 - C의 커플 근접 결합 및 대규모 병렬 시퀀싱합니다. 그 결과 데이터가 여러 스케일에서 게놈 구조를 연구하는 데 사용할 수 있습니다 : 초기 결과는 같은 염색체 지역, 개방적이고 닫힌 염색질의 분리 및 megabase 규모의 염색질 구조와 같은 기능을 확인.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

관련된 염색체 트랩 (ACT) 분석은 장거리 DNA 상호 작용을 확인하는 소설 편견 방법입니다. 장거리 DNA 상호 작용의 특성은 우리가 정상적인 생리 모두와 질병 상태에서 유전자 발현에 핵 건축의 관계를 확인할 수 있습니다.

장거리 DNA의 상호 작용을 확인을위한 관련 염색체 트랩

이 작품 설명 프로토콜 위한 고해상도 제자리에 이 C 라이브러리에서의 세대 단단히 준비 사전 gastrulation 초파리 melanogaster 태아.

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

Chromatin 반복; 유전자 규칙에 있는 중요 한 역 그러나, chromatin 루프의 선택적이 고 가역 수정 허용 하는 아무 기술 발전 되었습니다. 여기 우리가 chromatin 루프 개편에 대 한 강력한 시스템 설명 loci를 대상으로 선택적으로 고 역에서 유전자 발현 조절에 CRISPR-dCas9 (CLOuD9)을 사용 하 여.

CRISPR 중재 Chromatin 루프 구조 개편

유전자와 규제 요소 간의 물리적 상호 작용의 식별 도전 이지만 염색체 구조 캡처 방법에 의해 촉진 되었습니다. 4 C-seq 프로토콜이 수정이 PCR 템플릿-증폭을 최소화 하 여 PCR 바이어스를 완화 하 고 또한 금지 효소 다이제스트 단계를 통합 하 여 읽기의 mappability을 극대화.

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

우리는 배아 줄기 세포에서 생성된 배아 체에서 높은 처리량 시퀀싱에 이어 정량적 염색체 형성 캡처의 적용을 보고합니다. 이 기술은 배아 줄기 세포 분화 동안 주어진 유전자의 putative 강화제와 프로모터 영역 사이의 접촉을 식별하고 정량화할 수 있습니다.

정량적 염색체 형성(4C)에 의한 배아체에서 증강-프로모터 접촉 식별

게놈은 핵 공간에서 염색체 형성 포획 기술을 통해 드러나게 할 수 있는 다른 구조물로 조직됩니다. 핵 내 Hi-C 방법은 드로소필라 세포주에서 크로마티닌 상호작용의 게놈 전체 컬렉션을 제공하며, 이는 제한 단편 수준에서 메가베이스 해상도로 탐색할 수 있는 접촉 맵을 생성합니다.

드로소필라 세포의 인핵 하이-C

이 프로토콜은 위상 연관 도메인(TAD)의 경계 및 조절 및 기타 DNA 서열 요소 간의 장거리 염색질 상호 작용을 포함하여 고해상도에서 메가 기반 크기의 표적 게놈 영역의 3D 조직을 특성화하는 데 사용되는 Capture Hi-C 방법을 설명합니다.

Capture Hi-C를 통한 고분해능 3D 염색질 조직 해독

게놈 전체 염색체 형태 캡처 방법인 Micro-C-XL을 사용하여 뉴클레오솜 분해능으로 3차원 게놈 조직을 매핑하기 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

Micro-C-XL을 사용한 포유류 3D 게놈 상호 작용 매핑

여기에서는 학부 참여 및 학습에 중점을 두고 염색체 형태 캡처(3C) 기술의 적응을 자세히 제시합니다.

3C로 A 받기: 학부생을 위한 염색체 형태 캡처

우리는 유크로마틴, 헤테로크로마틴, RNAP II의 재현 가능한 지도화를 가능하게 하는 3색 염색질 단분자 위치 현미경(SMLM) 염색 및 분석 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 크로마틴 관련 표적을 포함한 고밀도 핵 환경에서 효율적인 다색 라벨링을 가능하게 하여 신뢰할 수 있는 동시 검출을 가능하게 합니다.

밀집된 핵 환경에서 크로마틴 연구를 위한 다중 표지 단일 분자 위치 현미경 프로토콜

배우세요 Hi-C 3.0 프로토콜을 사용하여 다양한 길이 척도에서 염색체 접힘 특징을 정확하게 탐지하는 방법을. 포르말데히드와 DSG 교차결합제를 활용하여 프로모터-인핸서 상호작용을 분석하고 낮은 배경 신호로 고품질 시퀀싱 라이브러리를 생성합니다.

길이 척도에 걸친 염색체 형태 포착

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