Name: 체외 괴사성 장염의 Apical-Out Enteroid 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 배우세요 체외 괴사성 장염 연구를 위한 apical-out enteroid 모델링 방법을. 이 기술은 경구 치료제 테스트와 상피 무결성 평가에 활용됩니다.

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이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. HC는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 보조금 P20GM134973에 의해 지원됩니다. KB는 어린이 병원 재단 (CHF)과 장로교 건강 재단 (PHF) 보조금의 지원을 받습니다. 우리는 공초점 이미징을 제공 한 핵심 시설의 사용에 대한 OUHSC의 분자 생물학 및 세포 측정 연구 연구소에 감사드립니다.

이 연구의 모든 동물 절차는 오클라호마 대학 건강 과학 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 조산 비인간 영장류(NHP, 90% 임신, 올리브 비봉, 파피오 아누비스)로부터의 소장 편의 샘플을 별도의 연구를 위해 안락사 후 수득하였다(프로토콜 #101523-16-039-I).
1. 아피칼 아웃 엔테로이드 NEC-in-a-dish 모델 구축
<ol><li>배지 및 엔테로이드 치료의 제조 참고: 일단 표준 무균 기술에 따라 제조되면, 매체는 4°C에서 최대 1주일 동안 저장될 수 있다.<ol><li>50mL의 인간 오가노이드 성장 배지와 50mL의 오가노이드 보충제를 혼합하여 무항생제 배지(AFM) 를 준비합니다(자료표 참조). 9,900 μL의 PBS에 0.5 M EDTA 100 μL를 첨가하여 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산/1x 인산염 완충 식염수(EDTA/PBS)를 제조하였다.</li>
		<li>Chill Dulbecco의 변형된 독수리의 배지/영양소 햄의 혼합물 F12 + 15 mM HEPES 버퍼(DMEM/F12)를 2-8°C에서 냉각시킨다.</li>
		<li>100 μg의 TNF-α 분말을 1x PBS 1 mL에 현탁시켜 TNF-α 원액을 제조하였다. 용매로서 AFM을 사용하여 TNF-α 스톡을 20 ng/mL 및 50 ng/mL 농도로 추가로 희석한다. LPS 2 mg을 1 mL의 1x PBS에 현탁시켜 LPS 원액을 제조하였다. AFM을 용매로 사용하여 스톡 LPS를 100 μg/mL 및 200 μg/mL로 추가로 희석합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>3D 엔테로이드의 극성 반전 참고: 다음 절차는 단일 24웰 평평한 바닥 조직 배양 플레이트를 두 개의 24웰 초저 부착 조직 배양 플레이트로 되돌리기 위한 것입니다. 조직 배양 플레이트는 사용 전에 적어도 30분 동안 37°C로 가온되어야 한다. 기저측성 3D 엔테로이드의 유도는 많은 그룹(35,36)에 의해 이전에 기술된 바와 같이 달성되었으며, 매체에 대한 약간의 수정(위에서 상세히 설명함)이 있었다. 일반적인 엔테로이드 유도 절차는 인간의 그것과 다르지 않습니다. 간단히 말해서, 적출된 조직은 세척되고, 작은 단편으로 절단되고, 세포 파쇄 완충액에서 인큐베이션된다. 이어서, 세포 용액은 70 μM 세포 스트레이너를 통해 실행되어, 고밀도로 플레이팅되는 크립트를 생성한다.<ol><li>확립된 3D 기저측성 엔테로이드로 구성된 24웰 플레이트의 각 웰에서 흡인된 배지.</li>
		<li>500μL의 5mM 빙냉 EDTA/PBS를 24웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 최소 5x-6x의 p200 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 기저막 추출물/ECM 돔을 부드럽게 기계적으로 파괴합니다.</li>
		<li>네 개의 웰의 내용물을 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 얼음처럼 차가운 EDTA/PBS 8mL를 원뿔형 튜브에 첨가합니다. 나머지 20개의 웰을 동일한 방식으로 옮깁니다.</li>
		<li>15 mL 코니컬 튜브를 4°C에서 330 rpm의 회전 플랫폼 또는 진탕기 상에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 1시간 인큐베이션 후, 원뿔형 튜브를 4°C에서 3분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 각 튜브에서 상층액을 제거하고 버립니다.</li>
		<li>세포 펠릿을 5mL의 DMEM/F12로 결합 및 세척하고 세포 현탁액을 두 개의 15mL 코니컬 튜브에 분배합니다.</li>
		<li>세포를 4°C에서 3분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 펠릿화하였다. 상층액을 제거하고 AFM 12mL를 각 튜브에 첨가하여 세포 펠릿이 재현탁되도록 합니다.</li>
		<li>500 μL의 엔테로이드 현탁액을 두 개의 24-웰 초저 부착 플레이트의 각 웰에 피펫한다.</li>
		<li>플레이트를 37°C 및 5%CO2에서 2-5 일 동안 또는 엔테로이드가 극성을 역전시킬 때까지 인큐베이션한다.</li>
		<li>엔테로이드 반전을 확인하기 위해서는 먼저 확인 면역 형광 염색 및 평균 반전 시간 (~ 3 일)을 설정 한 다음 기본 광학 현미경 시각화를 사용하여 극성 반전을 확인합니다. Apical-out enteroids는 외관상 매우 세포성이며, basolateral-out enteroids는 종종 큰 중앙 루멘 또는 싹을 틔우는 것에 의해 지배됩니다 ( 보충 그림 1 참조). 참고: 절차가 표준화되면 apical-out으로의 전환율은 일반적으로 95%를 초과합니다. apical-out enteroids의 사용은 말단 실험으로 의도되었지만 이론적으로 apical-out enteroids를 소수의 basolateral-out enteroids로 통과시키는 것이 가능합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Apical-out NEC-in-a-dish 참고 : 엔테로이드가 극성을 역전시킨 후에는 apical-out 입체 형태에서의 수명이 3-4 일 이상 확인되지 않았으므로 후속 실험에서 배양물을 신속하게 사용하십시오. 다음의 NEC-in-a-dish 모델의 경우, 엔테로이드를 24시간 동안 처리한 다음, 직후에 수집하여 하류 실험을 위해 보존하였다.<ol><li>엔테로이드가 95% 이상의 효율로 극성을 시각적으로 역전시키면, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 24웰 플레이트의 8개의 웰을 15mL 원뿔형 튜브에 수집합니다. apical-out enteroids가 현탁액에 있기 때문에, 단순히 엔테로이드 / 미디어 솔루션을 피펫하십시오. 15 mL 튜브를 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리한다.</li>
		<li>일단 세포가 펠릿화되면, 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 1x PBS (대조군)의 원하는 부피 (여기에 첨가된 최고 처리 부피와 일치하도록 10 μL)와 혼합된 AFM 4 mL에 재현탁시켰다.</li>
		<li>500 μL의 엔테로이드/PBS/AFM 현탁액을 24-웰 초저 부착 플레이트의 8개 웰에 피펫하고, 플레이트를 37°C 및 5%CO2에서 24 시간 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>1.3.1.-1.3.3단계를 반복합니다. TNF-α (20 ng / mL 및 50 ng / mL) 및 LPS (100 μg / mL 및 200 μg / mL) 노목시아에서의 치료. 모든 저산소증 치료에 대해, 단계 1.3.1.-1.3.3.을 반복하되, 플레이트를 24시간 동안 37°C, 5%CO2, 및 1%O2 의 별도의 인큐베이터에 놓는다. 참고: 1.3.4 단계. 1.3.1.-1.3.3 단계와 동시에 수행 할 수 있지만 명확성을 위해 위의 절차는 복잡성을 줄이기 위해 처리로 분리되었습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 면역형광염색 및 공초점 현미경 검사
<ol><li>염색액의 제조<ol><li>7 mL의 최종 부피로 1x PBS에 7 μL의 트리톤 X-100을 혼합하여 0.1% 트리톤 X-100을 제조하였다. 30 mL의 최종 부피에 1x PBS에 30 μL의 트윈-20을 첨가하여 PBST (PBS-Tween)를 제조하였다.</li>
		<li>PBST의 6.3 mL에 NDS 700 μL를 첨가하여 10% 정상 당나귀 혈청 (NDS)/PBST를 준비하십시오. PBST에 NDS 70μL를 첨가하여 1% NDS/PBST를 7mL의 최종 부피로 준비한다. 주: 당나귀 혈청은 이차 항체 숙주와 상관관계를 맺기 위해 여기에서 사용되었다. 그러나, 차단 혈청 종은 비특이적 결합을 적절하게 차단하기 위해 이차 항체 종과 일치해야 한다.</li>
	</ol></li>
	<li>염색 (1 일째)<ol><li>24-웰 플레이트의 네 웰의 내용물을 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 원하는 모든 웰 / 트리트먼트에 대해 반복하고 각 처리는 별도의 튜브에서 반복하십시오. 튜브를 4°C에서 4분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 엔테로이드가 펠릿화되면 상층액을 제거하십시오.</li>
		<li>세포 펠렛을 실온에서 30분 동안 고정성 4% 포름알데히드 고정성 300 μL에 재현탁시켰다(RT). 30분 후, 튜브를 4°C에서 4분 동안 300 x g 에서 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 펠렛을 500 μL의 멸균, RT 1x PBS로 세척하였다.</li>
		<li>튜브를 4°C에서 4분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 상청액을 제거하고 0.1% 트리톤 X-100의 500 μL를 첨가하고, RT에서 1시간 동안 앉히십시오.</li>
		<li>1시간 후, 튜브를 4°C에서 4분 동안 300 x g 에서 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 500 μL의 1x PBS로 세척하고, 튜브를 2-8°C에서 15분 동안 200 rpm으로 회전기 또는 진탕기 상에 놓는다. 이것을 총 4 배 반복하십시오.</li>
		<li>튜브를 4°C에서 4분 동안 300 x g 에서 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 500 μL의 10% NDS/PBST를 첨가하고, RT에서 45분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 동안, 24-웰 플레이트의 8개 웰에 대해 20μL의 재조합 항빌린 항체, 10μL의 E-카데린 항체 및 1970μL의 1% NDS/PBST를 결합하여 1차 항체 용액을 제조하였다.</li>
		<li>45분 인큐베이션 후, 튜브를 4°C에서 4분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 상청액을 제거하고 250μL의 일차 항체 용액으로 교체한다. 튜브를 2-8°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.</li>
	</ol></li>
	<li>염색 (2 일째)<ol><li>튜브를 4°C에서 4분 동안 300 x g 에서 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 펠렛의 크기에 따라 각 튜브에 250-500 μL의 PBST를 첨가하고, 2-8°C에서 1시간 동안 200 rpm으로 회전기 또는 진탕기에 놓는다. PBST 세척을 4x 반복한다.</li>
		<li>52 μL의 Cy3 당나귀 항토끼 IgG (H+L)를 50% 글리세롤에 첨가하고 5.2 μL의 당나귀 항-마우스 형광 녹색 488 이차 항체를 1% NDS/PBST의 5142.8 μL에 첨가하여 2차 항체 용액을 제조하였다.</li>
		<li>마지막 PBST 세척 및 원심분리에 이어서, 튜브로부터 상청액을 제거하였다. 200 μL의 이차 항체 용액을 각 튜브에 분주하고 2-8°C에서 밤새 어둠 속에서 인큐베이션한다.</li>
	</ol></li>
	<li>스테인드 아피칼 아웃 엔테로이드 장착 (Day 1)<ol><li>청색 핵 염료를 함유 한 글리세롤 기반 마운트를 1 시간 이상 RT로 가져 오십시오.</li>
		<li>튜브를 4°C에서 4분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 상청액 100μL를 제거하고 나머지 ∼100μL의 상청액에 세포를 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 0.5 mL 튜브로 옮긴다.</li>
		<li>튜브를 20초 동안 미니 원심분리기에서 원심분리하여 세포를 펠릿화한다. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 100 μL의 원거리 적색 핵산 염색에 재현탁시켰다. 튜브를 RT에서 10분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>튜브를 20초 동안 미니 원심분리기에서 원심분리하여 세포를 펠릿화한다. 상청액을 제거하고 세포 펠렛을 1x PBS의 100 μL에 재현탁시켰다. 두 번째 세척을 반복하십시오.</li>
		<li>튜브를 20초 동안 미니 원심분리기에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 70 μL의 상층액을 제거하였다. 세포를 PBS의 잔여 부피에 재현탁시키고, 내용물을 표지된 커버슬립 (24 mm x 60 mm)으로 옮긴다.</li>
		<li>75μL의 장착제를 시편에 직접 바르고 피펫 팁으로 기포를 제거합니다. 커버 슬립이 어둠 속에서 RT에서 밤새 (18-24 시간) 경화되도록하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>스테인드 아피칼 아웃 엔테로이드 장착 (Day 2)<ol><li>밤새 경화시킨 후, 글리세롤의 박층(∼15 μL)을 커버슬립에 도포한다. 커버슬립을 유리 슬라이드에 장착하고 제자리에 살짝 밀어 넣습니다. 탭하여 커버슬립과 슬라이드 사이의 거품을 제거합니다.</li>
		<li>커버슬립을 공초점 현미경으로 20x 배율로 이미징하기 전에 최소 2시간 동안 어둠 속에서 RT로 설정되도록 합니다. 다양한 공초점 획득 방법을 사용한 엔테로이드의 현미경 시각화는 Lallemant et al.37을 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>면역형광 정량화 참고: 이 방법은 ImageJ 소프트웨어(https://imagej.nih.gov/ij/)를 사용하여 배경 신호를 제거하여 보정된 총 형광을 결정합니다.<ol><li>ImageJ에서 공초점 이미지를 열고 관심 영역(ROI) 도구로 원하는 영역의 윤곽을 그립니다.</li>
		<li>분석 > 측정 설정으로 이동하여 사용자 정의 매개변수를 설정합니다. 설정 탭>서 영역 > 통합 밀도 평균 회색 값을 선택합니다.</li>
		<li>측정 분석으로 이동>니다. 측정값이 포함된 팝업 창이 나타납니다. 이러한 측정값을 복사하여 스프레드시트에 붙여넣습니다.</li>
		<li>배경 신호를 빼려면 이미지의 작은 비형광 영역을 선택합니다. 해당 지역에 대한 분석 > 측정 으로 이동합니다. 측정값이 포함된 팝업 창이 나타납니다. 출력을 복사하여 스프레드시트에 붙여넣습니다.</li>
		<li>선택된 세포의 면적에 배경 판독값의 평균 형광을 곱하고, 통합 밀도에서 합을 빼서 보정된 총 세포 형광(CTCF)을 계산한다. 스프레드시트 또는 통계 소프트웨어 패키지에 레코드를 유지하면서 관심 있는 모든 이미지에 대해 위의 단계를 반복 합니다(자료 표 참조).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Apical-out NEC-in-a-dish 세포 생존력
<ol><li>엔테로이드 트리트먼트<ol><li>1 단계에서와 같이 24 시간 동안 apical-out NEC-in-a-dish 모델을 수립하십시오.</li>
		<li>세포 생존율 분석 시약을 4°C에서 하룻밤 동안 해동시킨다. 분석 당일, 사용 30 분 전에 시약을 RT로 가져 오십시오. 혼합할 시약을 반전시킨다.</li>
		<li>분석을 수행하기 전에 각 웰에서 100μL의 배지를 제거하고 나머지 400μL를 남겨 둡니다. 각 웰에 세포 생존율 분석 시약 400μL를 추가합니다.</li>
		<li>내용물을 200 rpm에서 5분 동안 RT에서 플레이트 진탕기 상에서 잘 혼합하여 세포 용해를 유도하였다. 진탕 후, 플레이트를 RT에서 추가로 25분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>25분 인큐베이션 후, 피펫팅을 통해 하나의 웰의 내용물을 혼합하고, 800 μL의 200 μL를 96-웰, 불투명, 폴리스티렌, 클리어-바닥 플레이트의 단일 웰로 옮긴다. 나머지 600μL에 대해 반복하여 웰당 네 번의 기술적 반복실험을 생성합니다. 이러한 방식으로 24-웰 플레이트의 각 웰의 나머지 내용물을 96-웰 플레이트로 옮긴다.</li>
		<li>발광이 가능한 플레이트 리더를 사용하여 0.25ms 적분에서 값을 기록하고 치료 간의 상대 값을 비교합니다. 또는 치료 발광을 아데노신 삼인산염(ATP) 표준과 비교한다.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없으며 이해 상충이 없습니다.

장 상피 크립트에서 유래 된 엔테로이드 모델의 최근 개발은 괴사 성 장염 병인을 연구하는보다 생리학적으로 관련된 시험관 내 조직을 허용합니다. 장 상피의 모든 주요 분화된 세포 유형을 포함함에도 불구하고, 3D 엔테로이드는 여전히 몇 가지 중요한 제한의 대상이 된다. 종래의, 기저측성-아웃 엔테로이드는 3D ECM 하이드로겔 돔에 현탁되며, 그 조성 및 밀도는 조직 배양 환경(39) 내에서 정상적인 확산을 제한할 수 있다. 중요하게도, 이들 엔테로이드는 세포의 정점 표면에 대한 제한된 접근을 공급하는데, 이는 생체내에서 LPS의 장세포 TLR4 결합과 같은 발광 박테리아 및 항원과 상호작용할 수 있는 표면이다.
NEC의 병태생리학은 불분명하지만, 조산기 장 상피에서 정점 TLR4의 발현 및 활성화의 증가는 두드러진 역할을 하는 것으로 생각된다40. TLR4 활성화...

조산아의 최대 10 %에서 발생하는 소장의 심각한 염증성 질환 인 괴사 성 장염 (NEC)은 일반적으로 높은 이환률 및 사망률 1,2과 관련이 있습니다. 외과 적 개입이 필요한 매우 낮은 출생 체중 (<1500g) 유아의 사망률이 50 %에 근접하는 것은 드문 일이 아닙니다3. NEC의 정확한 병인은 현재 이해되지 않았지만, 수식 먹이기와 같은 위험 요소는 질병2,4의 발달에서 dysbiosis, 미성숙 장 상피 및 기능 장애 장 장벽과 같은 생리 학적 이상을 가진 화합물로 생각됩니다. 상당한 노력에도 불구하고, NEC의 예방 또는 치료에 거의 진전이 없었다 지난 십 년동안 5. NEC 및 관련 장 상피 장벽 기능 장애를 연구하기위한 새로운 시험관 내 방법은 동물 모델의 연구 결과가 지금까지 침대 옆으로 잘못 번역 된 것처럼 질병의 병인에 대한 이해를 증진시키는 데 필요합니다6.
다수의 시험관내 모델이 NEC 동안 작용 메카니즘을 조사하기 위해 이용되었다. 인간 장 상피 세포주인 Caco-2는 NEC 7,8의 시험관내 모델에서 가장 일반적으로 활용되는 모델 중 하나입니다. Caco-2 세포는 소장의 테두리 형태학적 특징을 에뮬레이트하지만, 세포주로서, 점액 생성 잔 세포를 포함하는 매우 다양한 생체내 세포 유형으로 분화되지 않으며, 고도로 번역가능한 모델에 요구된다. HT-29-MTX, 인간 결장 선암종 세포는, 혼합된 장내세포 및 잔 세포 표현형을 포함하지만, 여전히 장내 상피9의 크립트계 세포 유형이 결여되어 있다. IEC-6 및 IEC-18은 미성숙 장폐색-유사 형태를 갖는 형질전환되지 않은 세포주이지만, 인간 조직으로부터 유래되지 않으며, 이들의 번역 능력을 제한한다. FHs 74-Int 및 H4 장 세포주는 인간 태아 조직으로부터 유래되고 단단한 접합부 또는 편광 단층10,11을 형성하지 않으며, 따라서 NEC에 감수성인 가장 미숙아에 비해 미성숙하다. 전형적으로, 시험관내 NEC 모델은 NEC12에서 장 염증을 개시하는 주요 수용체인 톨 유사 수용체 4(TLR4)를 유도하기 위해 리포폴리사카라이드(LPS) 치료법을 이용한다. 반응성 산소 종(ROS) 처리를 통해 매개되는 손상은, 전형적으로 과산화수소를 통해, NEC와 같은 산화적 손상 및 아폽토시스(apoptosis)13,14를 유도하는데 종종 사용된다. 장 염증의 주요 동인으로서, 염증성 TLR4 신호전달의 하류 성분인 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)는 또한 생체내 병인(15)을 모방하기 위해 이들 시험관내 모델에서 일반적으로 활용된다.
유도성 만능 줄기 세포 (iPSCs)로부터 생성 된 오가노이드는 이들이 유래 된 조직의 복잡한 생체 내 구조 및 세포 유형 조성을 재구성 할 수있는 능력으로 인해 장의 시험관 내 모델로서 인기를 얻었습니다16,17. 관련 시험관내 시스템인 엔테로이드는 iPSC 유래 오가노이드보다 더 쉽게 확립되고 유지되는 절제된 장내 크립트로부터 유래된 오가노이드이다. 엔테로이드는 전형적으로 기저측성 세포 표면에 제한된 실험적 접근을 갖는 3차원(3D) 세포외 매트릭스(ECM)에서 성장한다. 미세 주입18,19와 같은 방법은 정점 표면에 대한 이러한 장벽을 극복하기 위해 개발되었지만 루멘 내에 슬로프 된 세포 파편과 점액이 축적되면 미세 주입이 기술적으로 어렵고 일관성이 없습니다. 맞춤형 로봇 미세 주입 플랫폼이 널리 접근 할 수 없기 때문에20, 기술 능력 및 일반 기술의 실험실 간 변동성은 미세 주입 프로토콜로 극복하기위한 중요한 변수가됩니다. 해리된 3D 엔테로이드로부터 유래된 2차원(2D) 단일층은, 여전히 장 상피의 모든 주요 세포 유형을 포함하며, 정점 표면에 대한 접근을 허용하지만, 전통적으로 중간엽 근섬유아세포(21)의 피더층 없이는 유지하기가 어려웠다. 세포 배양 투과성 지지체는 근본적인 근섬유아세포를 사용하지 않고 엔테로이드 단층의 정점 및 기저측 측면 모두에 접근하기 위해 사용될 수 있지만, 이러한 삽입물은 공초점 현미경과 같은 양식과 함께 사용하기 전에 막의 절제 및 장착이 필요하며, 이는 전통적인 현미경 검사법(22)을 사용할 때 기술적으로 더 까다롭고 어려운 과정을 초래한다. NEC는 전통적인 3D 엔테로이드 23,24,25 및 투과성 지지 체 26,27을 사용하여 시험관 내에서 모델링되었으며, 장 염증은 최근 장내 온 칩 모델28,29로 복제되었습니다. 미세유체학을 통합한 장-온-어-칩 모델은 지금까지 가장 진보되고 번역 가능한 모델이지만, 이 기술은 비싸고, 복잡하며, 대부분의 조사자(30)가 접근할 수 없다.
apical-out enteroid 기술의 최근 발전은 시험관내 상피31,32,33의 구조적 완전성에 대한 손상의 위험없이 3D 엔테로이드의 정점 표면에 더 쉽게 접근 할 수있게했습니다. Apical-out enteroids는 생체 내 장 상피의 세포 유형 조성 및 장벽 기능을 공유하지만, 일반적인 3D 엔테로이드와 달리 이들 세포의 정점 표면은 배양 배지에 직면하여 영양 흡수, 미생물 감염 및 발광 분비에 대한보다 생리 학적으로 관련된 연구를 가능하게합니다31. apical-out enteroids의 추가적인 이점은 실험 제제를 엔테로이드에 균질하게 분배하는 능력이다. 엔테로이드 크기에 기초한 다양한 치료 부피는 미세주입과 마찬가지로 요구되지 않으며, 현탁 배양물에서 이러한 엔테로이드를 유지하는 능력은 실험제 확산(32)에 대한 임의의 ECM 간섭을 무효화한다.
괴사성 장염은 여러 장 상피 세포 유형 및 다양한 환경 및 병리 생리학적 요인34를 포함하는 다인자 질환이다. 장 장내 장내 세포의 다양한 세포 조성은 NEC와 같은 복잡한 질병을 모델링 할 때 단일 배양에 비해 명확한 개선입니다. 흥미롭게도, 단일 염증 노출이 종종 시험관내 단일배양물에서 손상을 유도하기에 충분한 반면, 엔테로이드는 마우스 모델(23)과 마찬가지로, NEC 유사 손상을 유도하기 위해 최소 두 개의 염증 성분을 필요로 하는 것으로 보인다6. 여기에서, 우리는 저산소증 (NEC6의 중요한 임상 적 특징) 및 LPS 또는 TNF-α과 함께 apical-out enteroids를 사용하여 NEC와 같은 염증에 대한 상피 반응을 연구하고 잠재적으로 치료 표적을 확인하기 위해 개선 된 생리학 적으로 관련성이 높은 시험관 내 모델로서 apical-out NEC-in-a-dish 모델을 제시합니다. 우리는 소장 3D 엔테로이드의 극성을 역전시키는 프로토콜과 상피 장벽 붕괴 및 접합 단백질 발현 변화를 확인하기위한 면역 형광 염색 프로토콜을 설명합니다. 마지막으로, 우리는 이중 히트, apical-out NEC-in-a-dish 모델의 영향을 결정하기 위해 간단한 엔테로이드 생존력 분석을 추가로 시연합니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원추형 튜브</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D 세포 생존도 분석</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 초저 부착 24-웰 마이크로플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리 24 mm x 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>102460</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 IgG (H+L) 고도의 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 토끼 IgG 항체, Cy3 conjugate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AP182C</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>E-cadherin 항체 (7H12)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-19051</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액 4%, 완충형, pH 6.9</td><td>Millipore Sigma</td><td>1004960700</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>피지</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult 오가노이드 성장 배지 (인간)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>06010</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 컨포칼 현미경</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>대장균 O111:B4의 지질다당류, 겔 여과 크로마토그래피로 정제</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3012-10MG</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>566460</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-well, Nunclon 델타 처리, 평면 바닥 마이크로플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>PBS(인산염 완충 식염수), 1x [-] 칼슘, 마그네슘, pH 7.4</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr>NucBlue <td>Fisher Scientific</td><td>P36983</td><td>을 사용한 유리 퇴색 방지 장착제</td> 연장<td></td></tr><tr><td>재조합 항-빌린 항체 [SP145]</td><td>Abcam</td><td>ab130751</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TNF-&알파; 단백질 100 &마이크로; g</td><td>Bio-Techne</td><td>210-TA-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3 다중 모드 마이크로플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L</td><td>Fisher Scientific</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 요오드화물(642/661)</td><td>Thermo Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>튜브, 0.5 mL, 플랫 캡</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

체외 괴사성 장염의 apical-out enteroid 모델

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

괴사 성 장염 (NEC)은 장내 염증과 괴사를 특징으로하는 조산아에 영향을 미치는 치명적인 질병입니다. 엔테로이드는 최근 위장 병리를 모델링하는 유망한 시스템으로 부상했습니다. 그러나 현재 사용되는 엔테로이드 조작 방법은 상피의 정점 표면 (3 차원 [3D])에 대한 액세스가 부족하거나 시간이 많이 걸리고 자원 집약적 인 (2 차원 [2D] 단층)입니다. 이러한 방법은 종종 모델이 생리적으로 번역 가능해지기 위해 미세 주입과 같은 추가 단계가 필요합니다. 여기에서, 우리는 장내 극성을 역전시켜 시험관 내에서 NEC를 연구하기위한 생리 학적으로 관련되고 저렴한 프로토콜을 설명하며, 그 결과 정점 표면이 바깥쪽으로 향하게됩니다 (apical-out). 노목스 또는 저산소 조건 하에서 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α) 또는 리포폴리사카라이드 (LPS)에 노출된 후 장내 장벽 완전성 및 접합 단백질 발현을 검사하기 위한 면역형광 염색 프로토콜이 또한 제공된다. 24시간 동안 노목성 또는 저산소 LPS 또는 TNF-α에 노출된 3D apical-out enteroids의 생존력도 또한 평가된다. 저산소증과 함께 LPS 또는 TNF-α에 노출된 엔테로이드는 상피 구조의 파괴, 부착물 접합 단백질 발현의 손실 및 세포 생존력의 감소를 나타내었다. 이 프로토콜은 NEC 요법의 잠재적 상피 표적을 식별하고 치료제에 대한 조기 장 반응을 연구하는 생리학적으로 관련되고 비용 효율적인 플랫폼을 제시하는 새로운 apical-out NEC-in-a-dish 모델을 설명합니다.

장내 염증을 모델링하기 위해 엔테로이드를 사용하는 것은 괴사 성 장염의 맥락에서도 이제는 일반적입니다. 그러나 현재 사용되는 대부분의 방법은 엔테로이드의 정점 표면에 대한 접근이 부족하여 경구 치료제로 궁극적으로 사용하기위한 화합물의 생리적 관련성을 부정하거나 엔테로이드 유래 단층과 마찬가지로 기술적으로 어렵고 시간이 많이 걸립니다. NEC의 현재 시험관내 엔테로이드 모델의 유용성을 증가시키기 위해, 우리는 엔테로이드의 극성을 역전시키고, 24 시간 저산소증 및 LPS 또는 TNF-α과 결합하여 apical-out NEC-in-a-dish 모델을 생성하였다. 면역형광 염색은 루멘을 향한 핵(청색)의 정점 국소화와 상피의 외부 가장자리에서 빌린32(적색, 정점 마커)의 검출을 확인하였다(도 1A). 200 μg/mL LPS, 50 ng/mL TNF-α 또는 저산소증 단독에 대한 노출은 대조군에 비해 총 세포 형태학, E...

이 프로토콜은 극성이 역인 작은 장 장내염을 활용하여 정점 표면에 접근 할 수있는 apical-out 괴사 장염 (NEC) 인 - 접시 모델을 설명합니다. 우리는 NEC 관련 상피 파괴를 검출하기위한 면역 형광 염색 프로토콜 및 NEC-in-a-dish 프로토콜을 실시한 apical-out enteroids의 생존력을 결정하는 방법을 제공합니다.

체외 괴사성 장염의 Apical-Out Enteroid 모델

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

이 프로토콜은 최초의 정점 아웃 인 어 디쉬 모델을 설명하며 경구 투여를 위한 잠재적 치료제의 시험관 내 모델링을 설정할 때 기저 측면 아웃 엔터로이드 인-어-디쉬 모델에 비해 중요한 개선입니다. 이 방법을 사용하면 엔터 로이드의 정점 표면에 접근 할 수 있습니다. 화합물은 세포 배지에 첨가 될 수 있으며 화합물은 생체 내에서와 같이 정점으로 흡수됩니다.잠재적인 경구 치료제를 테스트하기 위해 장 염증의 시험관 내 시스템을 구축하는 데 관심이 있는 연구자는 이 기술이 특히 유용할 수 있습니다. 다른 연령과 종에서 유래 한 조직은 추가 표준화가 필요할 수 있습니다. 따라서 환자는 극성 반전 시간을 설정하는 동안 필요할 수 있습니다.3D 엔터로이드의 극성을 반전시키기 위해 확립된 3D 기저측 아웃 엔테로이드의 24웰 플레이트의 각 웰에서 미디어를 흡입합니다. 24웰 플레이트의 각 웰에 500마이크로리터의 5밀리몰 아이스 콜드, EDTA 또는 PBS를 추가하고 P 200 피펫으로 5-6회 위아래로 피펫팅하여 기저막 추출물 또는 세포외 기질 돔을 기계적으로 부드럽게 방해합니다. 4 개의 우물의 내용물을 15 밀리리터의 연대기 튜브로 옮깁니다.그런 다음 8 밀리리터의 얼음처럼 차가운 EDTA 슬래시 PBS를 튜브에 첨가하십시오. 나머지 20 개의 우물을 같은 방식으로 옮깁니다. 튜브를 섭씨 4도에서 회전 플랫폼 또는 셰이커에서 330RPM으로 1시간 동안 배양합니다.배양 후 튜브를 원심분리하고 각 튜브로부터 상청액을 버린다. 펠릿을 5 밀리리터의 DMEM F12로 결합하고 세척하십시오. 그런 다음 세포 현탁액을 원심분리하고 상층액을 제거한 후 튜브에 무항생제 배지 12ml를 추가하여 세포 펠릿이 재현탁되도록 합니다.피펫 500 마이크로리터의 엔테로이드 현탁액을 24 웰 초저 부착 플레이트의 각 웰 내로 넣는다. 플레이트를 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 2-5일 동안 또는 엔테로이드가 극성을 바꿀 때까지 배양합니다. 기권 첫날, 24 웰 플레이트의 4 웰의 내용물을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다.별도의 튜브에서 각 처리와 함께 원하는 모든 웰에 대해 반복하십시오. 튜브를 원심 분리하고 실온에서 알데히드 정착액으로부터 4 %의 300 마이크로 리터로 펠릿을 재현 탁하십시오. 30분 후 펠렛을 500 마이크로리터의 PBS로 세척한다.튜브에 0.1 % 트리톤 X 100 500 마이크로 리터를 추가하십시오. 튜브를 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 그런 다음 튜브를 섭씨 2도에서 8도에서 15분 동안 200RPM의 회전 장치 또는 셰이커에 놓습니다.마지막 배양 후 PBS T에 500 마이크로 리터의 10 % NDS를 추가하고 실온에서 45 분 동안 배양합니다. 배양 중에 1 차 항체 용액을 준비하십시오. 다음날 펠릿의 크기에 따라 튜브에 250-500 마이크로 리터의 PBS T를 추가하고 섭씨 2-8도에서 1 시간 동안 200RPM의 회전 장치 또는 셰이커에 놓습니다.200 마이크로리터의 2차 항체 용액을 첨가하고 어둠 속에서 섭씨 2 내지 8도에서 튜브를 배양한다. 다음날, 튜브를 회전시키고 100 마이크로 리터의 상청액을 제거하여 염색 된 정점 엔터 로이드를 장착하십시오. 나머지 100 마이크로리터의 상청액에 세포를 재현탁시키고 세포 현탁액을 500 마이크로리터 튜브로 옮깁니다.미니 원심 분리기에서 튜브를 20 초 동안 원심 분리합니다. 상청액을 제거하고 펠렛을 실온의 100 마이크로리터에 재현탁시켜 원적색 핵산 염색한다. 20분 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하고, 펠릿을 100 마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨다.2차 세척 및 원심분리 후 70 마이크로리터의 상청액을 제거하고 펠렛을 PBS의 나머지 부피에 재현탁시킨다. 이어서 세포 현탁액을 표지된 24 x 60 밀리미터 커버 슬립으로 옮긴다. 75마이크로리터의 마운팅제를 시편에 직접 바르고 피펫 팁으로 기포를 제거합니다.어둠 속에서 밤새 경화 한 후 커버 슬립에 글리세롤을 얇게 바르고 커버 슬립을 유리 슬라이드에 장착하고 부드럽게 제자리에 누릅니다. 탭하여 커버 슬립과 슬라이드 사이의 거품을 제거합니다. 커버 슬립을 어둠 속에서 실온에서 2시간 동안 방치한 후 컨포칼 현미경으로 20배 배율로 엔테로이드를 이미징합니다.장내 치료의 경우, 텍스트 원고에 설명 된대로 24 시간 동안 접시 모델에서 정점 괴사 성 장염을 확립하십시오. 분석을 수행하기 전에 각 웰에서 100 마이크로리터의 배지를 제거하여 나머지 400 마이크로리터를 남깁니다. 400 마이크로리터의 세포 생존율 분석 시약을 각 웰에 추가합니다.내용물을 플레이트 쉐이커에서 200RPM에서 5분 동안 격렬하게 혼합하여 세포 용해를 유도합니다. 다음으로, 200 마이크로 리터를 96 웰의 투명한 바닥 플레이트의 단일 웰로 옮깁니다. 나머지 600 마이크로 리터에 대해 반복하여 웰 당 4 개의 기술 복제를 만듭니다.발광이 가능한 플레이트 리더를 사용하여 0.25밀리초 적분에서 값을 기록하고 처리 간의 상대 값을 비교합니다. 대조군의 대표적인 면역형광 염색은 내강을 향한 핵의 정점 국소화와 상피의 바깥쪽 가장자리에서 악당의 검출을 확인했다. 대조군과 비교하여 리포 다당류, 종양 괴사 알파 또는 저산소증 단독에 노출된 것은 전체 세포 형태 E-카드헤린 또는 악당 국소화 또는 형광 강도의 명백한 변화를 유도하지 않았습니다.저산소증과 함께 리포 다당류 또는 종양 괴사 알파로 치료하면 상피 구조가 파괴되고 ECA 청력 및 악당 염색의 손실로 밝혀진 부착 접합부 및 브러시 경계 단백질 발현의 상당한 손실이 입증되었습니다. 정점 세포 생존율은 정상 또는 저산소 조건 하에서 결정되었다. 정상 조건 하에서 대조군과 비교하여 리포폴리사카라이드 또는 종양 괴사 알파는 엔테로이드의 세포 생존율에 유의한 영향을 미치지 않았다.그러나, 저산소증 단독에 비해 저산소증과 함께 리포 다당류 또는 종양 괴사 알파에서 생존력의 현저한 감소가 관찰되었다. 정점 아웃 인 어 디쉬 모델을 설정하는 동안. EDTA를 세포 현탁액에 얼음처럼 차갑게 유지하는 것을 잊지 마십시오.이렇게 하면 극성 반전이 향상되고 모든 ECM이 적절하게 액화 및 제거됩니다. QPCR, RNA-seq, 웨스턴 블로팅 또는 장벽 투과성의 기능적 평가와 같은 다른 다운스트림 애플리케이션을 추가로 수행하여 저산소증에서 염증 신호 전달에 대한 반응을 특성화할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 지질다당류 치료에 의해 유도된 인간 유래 신생아 장 모델에서 괴사성 장염 질환의 발달을 보여줍니다. 이 모델은 장 병태생리학을 연구하는 데 도움이 됩니다.

인간 상피 장 모델에서 괴사성 장염의 유도

Enteroids 인간 질병의 연구에 새로운 모델로 떠오르고 있다. 프로토콜 신생아 조직에서 생성 된 enteroids의 lipopolysaccharide (LPS) 치료를 사용 하 여 인간의 necrotizing enterocolitis에의 enteroid 모델을 시뮬레이션 하는 방법을 설명 합니다. 수집 된 enteroids 그 인간의 necrotizing enterocolitis에 본 유사 염증 성 변화를 보여 줍니다.

Necrotizing Enterocolitis의 소설 인간 상피 Enteroid 모델

괴사 장염 (NEC)은 미숙아, 특히 매우 낮은 출생 체중 유아에서 자주 발생하는 가장 심각한 위장 (GI) 질병이며 사망률이 높고 불분명한 병인. NEC의 원인은 염증성 면역 규제 시스템 이상과 관련이 있을 수 있습니다. NEC 동물 모델은 NEC 질병 면역 연구를 위한 필수 도구입니다. NEC 동물 모델은 일반적으로 C57BL/6J 신생아 마우스를 사용; BALB/c 신생아 마우스는 거의 사용되지 않습니다. 관련 연구는 마우스가 감염될 때, Th2 세포 분화는 C57BL/6J 마우스에 비해 BALB/c 마우스에서 우세하다는 것을 보여주었습니다. 연구 결과는 NEC의 발생 그리고 발달이 T 도우미 타입 2 (Th2) 세포의 증가와 연관되고 일반적으로 감염을 동반한다는 것을 건의했습니다. 따라서, 본 연구는 신생아 BALB/c 마우스를 사용하여 NEC를 가진 아이들에서 관찰된 것과 유사한 임상 적 특성 및 장 병병리학적 변화를 가진 NEC 모델을 유도하였다. 추가 연구는 이 동물...

괴사 장염의 신생아 BALB/c 마우스 모델

이 프로토콜은 인간이 아닌 영장류 회장으로부터 분리된 3차원(3D) 엔테로이드로부터 유래된 2차원(2D) 단층에 대한 스크래치 상처 분석을 확립하고 수행하는 방법을 설명한다.

히알루론산 35kDa가 장내 유래 단분자층을 사용한 조기 소장 손상 및 치유의 시험관 내 모델에 미치는 영향

이 프로토콜은 태아의 장 조직에서 3 차원 장 모델 인 enteroids의 확립을 자세히 설명합니다. 상피 바이오마커의 면역형광 영상화를 모델 특성화에 사용하였다. 박테리아 내독소인 리포폴리사카라이드의 정점 노출은 미세주입 기술을 사용하여 형광 덱스트란의 누출에 의해 측정된 용량 의존적 방식으로 상피 투과성을 유도하였다.

태아 조직 유래 장내 투과성 테스트

본 프로토콜은 장 투과성을 결정하기 위해 정점 엔터로이드 모델에서 루시퍼 옐로우를 활용하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 방법은 괴사 성 장염과 같은 염증성 장 질환을 모델링하는 장내 세포에서 세포 투과성을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

정점 장내구 모델에서 루시퍼 옐로우를 사용한 장 투과성 측정

대장균은 출생 무렵에 박테리아를 섭취하는 신생아에게 패혈증을 일으킵니다. 대장균이 장내에서 혈류로 이동하는 능력과 관련된 과정은 잘 이해되지 않았습니다. 이 시험관 내 모델은 대장균 균주가 장 상피 세포를 통해 이동하는 능력을 평가합니다.

신생아 대장균 균 혈증 분리물의 장 트랜스사이토시스 평가

이 프로토콜은 질병 발병에 대한 기계론적 연구에 사용할 수 있는 괴사성 장염(NEC)의 시험관 내 모델을 설명합니다. 인간 신생아 장, 내피 세포 및 중증 NEC가 있는 신생아의 장내 마이크로바이옴에서 추출한 장내 장내형 칩을 파종한 것이 특징입니다.

인간 신생아 장 장내염과 디스바이오틱 마이크로바이옴을 통합한 괴사성 장염의 미세유체 모델

이 프로토콜은 괴사성 소장결장염(NEC)의 신생아 마우스 모델 및 신생아 쥐 소장에서 고유판 면역 세포의 후속 분리를 설명합니다.

면역 세포 프로파일링을 위한 괴사성 소장결장염 및 Lamina Propria 분리의 신생아 마우스 모델

에서 간세포 이식 체외에서 시뮬레이션 국소 빈혈 / Reperfusion 모델

배우세요 체외 괴사성 장염 연구를 위한 apical-out enteroid 모델링 방법을. 이 기술은 경구 치료제 테스트와 상피 무결성 평가에 활용됩니다.

체외 괴사성 장염의 Apical-Out Enteroid 모델

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