Name: 뇌 조각의 수초화 이미징을 위한 일관된 안티-스톡스 라만 분광법(CARS) 애플리케이션 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 8 s
Description: 배우세요 뇌 조직 수초화를 시각화하는 CARS 현미경 기법으로, 면역형광과 결합하여 다발성경화증 및 자폐증 같은 탈수초화 질환 연구에 활용합니다. 이 방법은 전자현미경 대비 비파괴적이고 유연한 이미징을 제공합니다.

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NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) 및 NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 및 FRAXA (McCullagh)에서 지원합니다. CARS 이미징은 NIH P30 NS048154 및 NIH P30 DK116073에 의해 부분적으로 지원되는 콜로라도 대학교 Anschutz Medical Campus의 신경 기술 센터의 Advanced Light Microscopy Core 부분에서 수행되었습니다.

모든 실험은 모든 관련 법률, 국립 보건원 지침을 준수했으며 콜로라도 대학교 Anschutz 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 동물
<ol><li>잭슨 연구소에서 얻은 C57BL/6J(스톡 #000664) 마우스(Mus musculus ) 또는 원래 Charles River에서 얻은 몽골 저빌(Meriones unguiculatus)을 사용하십시오.</li>
</ol>2. 조직 준비
<ol><li>심경 관류의 경우, 펜토 바르비탈 (120 mg / kg 체중)로 관심있는 설치류 종을 과다 복용하고 인산염 완충 식염수 (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.76 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na2HPO 4) 다음에4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 24.<ol><li>특히 가위를 사용하여 복부와 흉곽을 열고 켈리 지혈 집게로 흉곽을 제자리에 고정하여 심장을 노출시킵니다.</li>
		<li>관류 펌프에 연결된 23GA 바늘을 좌심실에 삽입하고 가위를 사용하여 우심방을 빠르게 자릅니다.</li>
		<li>관류 펌프와 심장의 바늘을 통해 PBS를 10 분 동안 투여하여 뇌와 혈액을 깨끗이합니다.</li>
		<li>관류 펌프를 4분 동안 10% PFA로 전환하고 팔다리와 꼬리의 강성을 확인하여 성공적인 관류를 확인합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>관류 후 동물의 목을 베고 두개골에서 뇌를 제거하십시오. PBS로 옮기기 전에 뇌를 4 % PFA로 밤새 유지하십시오. 뇌간을 4% 아가로오스(PBS 포함)에 삽입하고 200μm 두께의 비브라톰을 사용하여 관상으로 자릅니다.</li>
</ol>3. 염색
<ol><li>Nissl용 얼룩 없는 부유 절편을 항체 배지(AB 배지:0.1 M 인산염 완충액(PB: 50 mM KH2PO4, 150 mM Na2HPO4),150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, 1% 소 혈청 알부민(BSA))에서 표준 실험실 쉐이커(25)에서 실온에서 30분 동안 시각화하기 위해.<ol><li>알루미늄 호일 및/또는 덮개를 사용하여 빛으로부터 섹션을 보호합니다. 550nm 이하의 파장은 CARS 이미징과 호환됩니다(그림 1). 참고: Triton-X 또는 기타 시약이 지질의 CARS 이미징에 영향을 미칠 것으로 예상하지는 않지만 특정 항체 배지를 사용한 추가 제어가 필요할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>일시 중지 지점: 이미징할 때까지 자유 부동 섹션(빛으로부터 보호되는 동안)을 PBS에 저장합니다. 절편화되면 2주 이내에 뇌 절편을 이미지화합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64013/64013fig01.jpg"> 그림 1: CARS 이미징은 면역형광 이미징과 결합할 수 있습니다. 그래프는 CARS 이미징이 660/640nm 적색 신호 스펙트럼26에서 발생한다는 것을 보여줍니다. 이 파장은 녹색, 파란색 또는 UV 범위에서 충분히 멀리 떨어져 있어 CARS 신호와 이러한 범위의 면역형광법을 조합할 수 있습니다. 구체적으로, 그래프는 또한 청색 형광단으로 태그된 Nissl에 대한 여기 및 방출을 나타내며, 이는 본 간행물에 대한 대표적인 결과를 수집하는 동안 CARS와 결합되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64013/64013fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
4. 이미징
참고: CARS 레이저 설정에는 80MHz 클럭을 제공하는 파이버 레이저와 CARS 신호를 수집하는 데 필요한 Stokes 빔이 1031nm로 고정된 770-990nm의 조정 가능한 범위를 가진 OPO(광학 파라메트릭 발진기) 레이저가 포함되어 있습니다. 두 빔 모두에 대해 하나의 조리개가 있습니다.
<ol><li>샘플을 현미경으로 가져오기 전에 CARS 레이저를 켜고 최소 1시간 동안 예열하고 CARS 레이저를 정렬하고 Koehler는 전방 CARS 이미징을 위해 콘덴서 광학 장치와 현미경의 다이어프램을 정렬합니다. 참고: 이 단계는 CARS 현미경의 적절한 기능에 매우 중요합니다.<ol><li>두 레이저 빔(펌프 및 스토크)의 공간 정렬을 위해 CARS 레이저 GUI를 통해 두 개의 내부 PSD(위치 감지 감지기)에 액세스합니다.</li>
		<li>파장이 다르기 때문에 분산이 다른 두 레이저(펌프 및 스토크)의 펄스를 겹치는 데 도움이 될 수 있는 CARS 레이저 GUI의 지연 기능을 사용하여 시간 정렬을 달성합니다. 따라서, 펌프 및 스톡스 빔의 시간적 및 공간적 중첩은 모두 GUI를 통한 사용자 입력으로 수행된다.</li>
		<li>외부 잠망경(설정의 마지막 두 거울)을 조정하여 공간적으로 겹쳐진 두 개의 레이저를 현미경의 스캐닝 헤드 미러에 중앙에 놓습니다.</li>
		<li>최상의 전방 CARS 비스캔 감지를 위해 콘덴서가 Koehler-ed인지 확인하십시오(즉, 콘덴서가 중앙에 있고 균일한 조명을 얻기 위해 다이어프램에 초점을 맞춥니다).</li>
	</ol></li>
	<li>면역형광 컨포칼 이미징 및 CARS 이미징의 경우 형광 이미징을 위한 가시광선 레이저가 장착된 컨포칼 현미경을 통합하여 CARS 레이저를 전방 및 에피 CARS 비스캔 검출기(NDD)와 함께 장착합니다(그림 2).</li>
	<li>커버 슬립 (도립 현미경 용), 조직 건조를 방지하기 위해 PBS, 조직을 커버 슬립 근처에 유지하기위한 유리 무게가있는 배양 접시에 섹션을 놓습니다.</li>
	<li>사다리꼴 몸체(MNTB)의 내핵과 같은 뇌 영역을 이미징하기 위해 에피 방향으로 CARS 신호를 수집하고 정방향으로 0.55NA 콘덴서를 통해 CARS 신호를 수집하는 역할을 하는 60X, 1.2NA 적외선 보정 물 대물렌즈로 z-스택 또는 단일 이미지를 촬영합니다.<ol><li>CARS 레이저 GUI를 사용하여 약 600mW 펌프/프로브 및 300mW 스톡스에서 CARS 이미지를 촬영합니다. 이러한 레이저 출력 값은 시스템에 의해 내부적으로 측정됩니다. 샘플 위치에서 두 레이저의 출력은 25mW 미만이며 조직 샘플에 안전합니다.</li>
		<li>펌프와 Stokes 빔을 공간적으로나 시간적으로 겹칩니다. OPO를 797.2nm로 조정합니다. 이것은 650 nm의 CARS 파장을 산출한다. 에너지 수준이 높기 때문에 결과적으로 바닥 상태로의 복귀는 여기로 안티 스토크 (파란색 이동)됩니다.</li>
		<li>대역통과 필터(640-680nm)를 사용하여 epi 또는 전방 비스캔 검출기에서 CARS 신호를 캡처한 다음 면역형광 라벨(이 경우 형광 라벨이 Nissl로 표시됨)을 순차적으로 검출합니다. 참고: Nissl 뉴런 소마 마커는 CARS 640-680nm 대역통과 필터에 포착되지 않으므로 아래 제시된 이미지에서 형광과 CARS 이미징을 조합할 수 있습니다.</li>
		<li>CARS와 형광은 PMT를 공유하지 않습니다. 최적의 지질 신호에 이러한 설정을 사용하여 뇌 영역의 수초화를 선택적으로 이미지화합니다. 주의: 레이저 빔으로부터 사용자를 보호</li>
	</ol></li>
	<li>이미지를 .oib 파일로 저장하면 추가 정량화를 위해 이미지 분석 프로그램으로 가져올 수 있습니다(그림 3).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64013/64013fig02.jpg"> 그림 2: 레이저 스캐닝 컨포칼에 통합된 CARS 레이저(빨간색 화살표) 및 비스캔(NDD) 에피 및 전방 감지를 보여주는 CARS 기기 다이어그램. 순방향 NDD에서는 515nm(주황색 화살표)에서 CH 결합(진한 빨간색 화살표) 및 SHG(두 번째 고조파 생성)에 대한 CARS를 획득합니다. epi NDD에서는 C-H 결합(진한 빨간색 화살표) 및 2PE(이광자 방출) 자가형광(하늘색 화살표)에 대한 CARS를 획득합니다. 순차적으로 형광 공초점 이미지를 획득할 수 있습니다(가시광선 레이저의 경우 녹색 화살표, 공초점 검출의 경우 파란색 화살표). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64013/64013fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64013/64013fig03v2.jpg"> 그림 3: CARS는 뇌 조직(뇌간)의 미엘린(자홍색)을 밝히는 동시에 Nissl(청록색) 또는 형광 마커를 이미징할 수 있습니다. 두 패널은 몽골 저빌 (단일 이미지 M. unguiculatus, 그림 3A, C, E)과 마우스 (z- 스택 최대 투영 M. musculus, 그림 2B, D, F) 뇌의 대표적인 결과를 보여 주며,이 기술이 여러 종에 걸쳐 사용될 수 있음을 나타냅니다. 그림 3A, B는 Nissl을 시안으로, C,D는 CARS 신호를 마젠타색으로 보여주고, E, F는 Nissl 및 CARS 신호를 각각 저빌 또는 마우스용 패널과 결합합니다. 두 이미지 세트 모두 뇌간에서 사다리꼴 몸체 (MNTB)의 내측 핵 부분을 보여줍니다. MNTB의 뉴런은 심하게 수초화된 축삭으로부터 입력을 받는데, 축삭은 거대한 시냅스27의 일종인 헬드의 꽃받침에서 끝납니다. 스케일 바는 20 μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64013/64013fig03largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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<li>Bégin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+method+for+the+segmentation+and+morphometry+of+nerve+fibers+in+large-scale+CARS+images+of+spinal+cord+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Automated method for the segmentation and morphometry of nerve fibers in large-scale CARS images of spinal cord tissue.</a> Biomedical Optics Express. 5 (12), 4145-4161 (2014).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

점점 더 많은 문헌이 뇌 기능에서 미엘린의 역할을 강조합니다 13,16,21,28. 또한, 우리는 수초 두께와 수초 패턴이 다발성 경화증 (29 년 검토), 노화 (30 년 검토), 자폐증20,31 및 기타 여러 가지 신경 학적 상태에서 변할 수 있음을 알고 있습니다. 따라서 점점 더 많은 연구자들이 뇌 조직과 동물 모델, 여러 의학적 조건 및 점점 더 많은 실험 상황에서 수초화를 평가해야한다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 뇌 조직에서 수초화를 이미지화하는 전통적인 방법에는 항체 표지, 광학 현미경 및 전자 현미경...

활동 전위는 뇌에서 정보의 기본 단위이며, 축삭을 통한 활동 전위 전파는 정보 처리의 한 기둥을 형성합니다 1,2,3. 뉴런은 전형적으로 다수의 다른 뉴런으로부터 구심성 입력을 수신하고, 주어진 좁은 시간 윈도우 내에 이들 입력을 통합한다(4,5). 따라서 축삭의 활동 전위 전파 메커니즘은 연구자로부터 상당한 관심을 받았습니다.
축삭을 통해 전파 될 때, 활동 전위는 축삭을 따라 반복적으로 재생되어 안정적인 전파를 보장합니다6. 턱이있는 척추 동물 (gnathostomes)의 대부분의 뉴런에서 축삭은 신경교 세포의 유형 인 근처의 희소 돌기 아교 세포 또는 Schwann 세포에서 생성되는 지질이 풍부한 물질 인 미엘린 덮개로 둘러싸여 있습니다 (7,8에서 검토). 이 myelin sheath는 축삭을 전기적으로 절연하여 커패시턴스를 줄이고 활동 전위 전파를 효율적이고 빠르며 낮은 에너지 소비로 허용합니다. Myelin은 축삭을 균일하게 덮지 않지만 Ranvier의 노드라고 하는 축삭 사이에 짧은 간격이 있는 부분으로 축삭을 덮습니다(9,10에서 검토됨). 축삭의 전기 절연 수준을 제어하는 수초화 두께와 축삭을 따라 활동 전위가 재생되는 빈도를 제어하는 Ranvier 노드의 간격은 활동 전위 전파 속도에 영향을 미칩니다 (11에서 검토).
수초화 두께가 축삭12,13,14에서 활동 전위 전파 속도에 영향을 미친다는 것을 시사하는 많은 문헌이 있습니다. 더욱이, 축삭 수초화의 변화는 다수의 CNS 결핍 15,16,17,18,19,20,21을 초래할 수 있다. 따라서 많은 연구 노력의 초점이 축삭 수초화의 측정 및 특성화를 포함한다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 미엘린 두께의 측정은 전자 현미경으로 가장 일반적으로 수행되었으며, 이는 상당한 양의 조직 준비가 필요하고 면역 조직 화학과 함께 사용하기가 어려운 기술입니다. 그러나 코히어런트 안티-스톡스 라만 분광법(CARS)을 기반으로 하는 축삭 수초화를 측정하는 더 빠르고 간단한 기술도 있습니다. CARS 레이저는 다양한 주파수로 튜닝될 수 있고, 지질을 여기시키기에 적합한 주파수로 튜닝될 때, 미엘린은 임의의 추가 라벨(22)에 대한 필요 없이 이미지화될 수 있다. 지질 영상화는 표준 면역조직화학과 조합될 수 있어서, 지질은 몇몇 형광 채널(23)과 함께 영상화될 수 있다. CARS를 사용한 이미징 수초화는 전자 현미경보다 훨씬 빠르며 EM보다 낮지 만 동일한 유형의 축삭에서 수초화의 작은 차이도 감지하기에 충분한 분해능을 가지고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>< 강한 > 마취 : < / 강한 ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>바늘이있는 1 mL 일회용 주사기 27 GA x 0.5 "</td><td>Exel int</td><td>260040</td><td></td></tr><tr><td>치명적인 +</td> <td>Vortech</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 외과 : </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spring 가위 - 8mm 절삭 첨단</td><td>과학 도구</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>표준 핀셋</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Fisher Chemical</td><td>SF994 (CS)</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-11</td><td></td></tr><tr><td>Kelly hemostats</td><td>Fine Science Tools</td><td>13019-14</td><td></td></tr><tr><td>Millipore H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>바늘 끝, 23 GA x 1"</td><td>BD 정밀 글라이드</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td><td>륨 Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 모노베이스</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>펌프(가변 유량 포함) 또는 이와 동등한</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Chemical</td><td>s271-1</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 인산염 이염 기</td><td>성 시그마</td><td>S7907</td><td></td></tr> <tr><td>< 강> 해부 : < / 강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 바이알 4 % PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bochem Chemical Spoon 180mm</td><td>Bochem</td><td>230331000</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-11</td><td></td></tr><tr><td>Noyes 스프링 가위</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>15011-12</td><td></td></tr><tr><td>파인 사이언</td>스 <td>도구</td><td>11050-10 파인 사이언스 도구 11050-10</td><td></td></tr><tr><td>얕은 유리 또는 플라스틱 트레이, 약 10" x 10"</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>표준 핀셋</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위 - 블런트</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14000-20</td><td></td></tr><tr><td>Slicing:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar, plant</td><td>RPI</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000s</td><td></td></tr><tr><td>웰 플레이트</td><td>Alkali Sci.</td><td>TPN1048-NT</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Staining:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AB Media:</td><td></td><td></td><td>1n 1,000 mL의 Millipore H2O</td></tr><tr><td>인산염 완충 (PB):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 모노염기</td><td>시그마</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>BSA (소 혈청 알부민)</td><td>시그마 생명과학</td><td>A2153-100g</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>피셔 화학물질</td><td>s271-1</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>x100-500ml</td><td></td></tr><tr><td>니슬 435/455</td><td>인비트로젠</td><td>N21479</td><td></td></tr><tr><td>CARS:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APE&nbsp; 피코 에메랄드 레이저</td><td>Angewandte Physik & 일렉트로닉&nbsp; </td><td></td><td></td>GmbH</tr><tr><td>대역 통과 필터 (420-520 nm)</td><td>Chroma Technology</td><td>HQ470 / 100m-2P</td><td></td></tr><tr><td>대역 통과 필터 (500-530 nm)</td><td>Chroma Technology</td><td>HQ515 / 30m-2P</td><td></td></tr><tr><td>대역 통과 필터 (640-680 nm)</td><td>Chroma Technology</td><td>HQ660 / 40m-2P</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Cut Transfer</td><td>pipet Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>이색성 롱패스, 565nm</td><td>크로마 기술</td><td>, 565dcxr</td><td></td></tr><tr><td>, 이색성 롱패스, 585nm</td><td>크로마 기술</td><td>, 585dcxr</td><td></td></tr><tr><td>이색성 쇼트패스, 750nm</td><td>크로마 기술</td><td>, T750spxrxt</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 배양 접시</td>, <td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>, 유리 무게(10mm x 10mm 보로 로드)</td><td>Allen Scientific Glass Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>다광자 단역 통과 방출 필터 680nm</td><td>크로마 기술</td><td>ET680sp-2p8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

뇌 조각의 수초화 이미징을 위한 일관된 안티-스톡스 라만 분광법(cars) 애플리케이션

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

일관된 안티 스톡스 라만 분광법(CARS)은 화학자와 물리학자가 분자의 시그니처 진동에 대한 일관된 신호를 생성하기 위해 고전적으로 사용하는 기술입니다. 그러나 이러한 진동 신호는 뇌와 같은 해부학 적 조직 내의 분자의 특성이기도하므로 신경 과학 응용 분야에 점점 더 유용하고 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, CARS는 이러한 분자 내의 화학 결합을 특이적으로 여기시켜 지질을 측정할 수 있으므로 신경 전달에 관여하는 미엘린과 같은 조직의 다양한 측면을 정량화할 수 있습니다. 또한, 미엘린을 정량화하기 위해 전형적으로 사용되는 다른 기술과 비교하여, CARS는 또한 면역형광 기술과 호환되도록 설정될 수 있어서, 나트륨 채널 또는 시냅스 전달의 다른 성분과 같은 다른 마커와의 공동 표지를 허용한다. 수초화 변화는 다발성 경화증과 같은 탈수초성 질환 또는 취약 X 증후군 또는 자폐 스펙트럼 장애와 같은 기타 신경학적 상태에서 본질적으로 중요한 메커니즘이 새로운 연구 분야입니다. 결론적으로, CARS는 신경 과학의 긴급한 질문에 답하고 다양한 신경 학적 상태와 관련된 기본 메커니즘에 대한 증거를 제공하기 위해 혁신적인 방법으로 활용 될 수 있습니다.

다른 기술에 비해 CARS 현미경의 가장 큰 장점 중 하나는 형광 이미징23과의 호환성입니다. 그림 1 은 스펙트럼에서 거의 / 전혀 겹치지 않는 면역 형광 마커로 태그 된 Nissl과 비교하여 CARS 스펙트럼을 보여줍니다. 그림 2 는 컨포칼 현미경과 함께 CARS에 설정된 레이저를 보여줍니다. 그림 3 은 세포체(청록색)와 미엘린 신호(자홍색)를 모두 보여주는 CARS 이미징을 사용하여 얻을 수 있는 gerbil 및 마우스의 단일 스택 및 z-스택 최대 투영으로 두 개의 대표적인 이미지를 보여줍니다.

수초화를 시각화하는 것은 신경계를 연구하는 많은 연구자들에게 중요한 목표입니다. CAS는 미엘린과 같은 특수 구조를 조명하는 뇌와 같은 조직 내에서 지질을 기본적으로 이미지화할 수 있는 면역형광법과 호환되는 기술입니다.

뇌 조각의 수초화 이미징을 위한 일관된 안티-스톡스 라만 분광법(CARS) 애플리케이션

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

이 기술은 뇌 조직 절편에서 미엘린을 이미지화할 수 있습니다. 수초화는 활동 전위의 전도에 중요한 역할을 하며 미엘린을 이해하면 뇌 기능을 이해하는 데 도움이 됩니다. 예를 들어 전자 현미경에 비해 CARS 기술의 주요 이점은 CARS가 광학 현미경 기술이고 면역조직화학에 사용되는 것과 같은 다른 형광 영상과 용이하게 조합될 수 있다는 것입니다.여러 의학적 상태는 수초화의 변화, 예를 들어 다발성 경화증, 노화 및 자폐증으로 인한 것입니다. 이러한 변화를 이해하면 근본적인 의학적 상태를 이해하는 데 도움이됩니다. 이 경우 CARS 레이저는 이미지 지질 또는 특히 CH2 결합에 맞게 조정됩니다.뇌에서 지질의 가장 큰 원천은 수초입니다. 따라서 이것은 뇌 조직에서 미엘린을 이미지화하는 기술입니다. 지질을 이미징하는 것이 관심이있을 때 다른 유형의 조직에 대해 동일한 방법을 사용할 수 있어야합니다.CARS 레이저를 튜닝하고 정렬하려면 상당한 전문 지식이 필요하며 레이저 또는 광학 현미경 전문가가 수행하는 것이 가장 좋습니다. 원고에 기재된 대로 조직을 준비한 후, 세포체를 시각화하기 위해 니젤 및 항체 배지에 대한 얼룩이 없는 부유 절편을 배양한 다음, 표준 실험실 쉐이커에서 실온에서 30분 동안 배양한다. 샘플을 현미경으로 가져 오기 전에 CARS 레이저를 켜고 최소 1 시간 동안 예열 한 다음 펌프와 스톡스 레이저 빔을 공간적으로 겹쳐서 CARS 레이저를 정렬하고 두 레이저 빔 사이의 지연을 조정합니다.전방 CARS 이미징을 위해 콘덴서 광학 장치와 현미경의 다이어프램을 채색 한 다음 외부 잠망경을 조정하여 공간적으로 겹쳐진 두 개의 레이저를 현미경의 스캐닝 헤드 미러에 중앙에 놓습니다. 최상의 전방 CARS 비스캔 감지를 위해. 콘덴서가 유인되었는지 확인하십시오.면역형광, 컨포칼 이미징 및 자동차 이미징의 경우 형광 이미징을 위한 가시광선 레이저가 장착된 컨포칼 현미경을 통합하여 CARS 레이저를 전방 및 에피 CARS 비스캔 검출기에 장착합니다. 이제 덮개 슬립 바닥이 있는 배양 접시에 섹션을 놓고 조직이 건조되지 않도록 PBS를 놓습니다. 또한 유리 추를 사용하여 티슈를 커버 슬립 근처에 두십시오.그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 자동차 및 미사일 형광 컨포칼 이미징에 대한 이미지 획득 파라미터를 설정합니다. 샘플을 현미경 스테이지에 놓고 샘플에 초점을 맞추고 이미지를 캡처합니다. CARS의 스펙트럼 범위

coherent-anti-stokes-raman-spectroscopy-cars-application-for-imaging

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

세 단일 파장 짧은 펄스 레이저의 조합 일관된 안티 - 스톡 래맨 산란 (자동차)과 이중 - 공진 자동차 (DR - 자동차)를 생성하는 데 사용됩니다. 이러한 신호의 차이점은 약한 래맨 scatterers의 이미징을함으로써 일관된 래맨 신호를 감지 않으면 어려운위한 향상된 감도를 제공합니다.

이중 - 공진 코히어런트 반 스톡스 래맨 산란 (자동차)와 생물 학적 구조의 차동 영상

출처: Espinoza, R., et al. 조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 2색 자극 라만 산란 영상. J. Vis. Exp. (2022).  이 비디오는 쥐의 뇌 조직 절편에 대한 2색 자극 라만 산란(SRS) 이미징을 보여줍니다. 두 개의 동기화된 레이저 빔이 조직 부분으로 향하여 분자 진동을 여기시켜 빔의 상대적인 강도 변화를 초래합니다. 조직의 지질과 단백질은 레이저 빔의 고유한 주파수 쌍을 사용하여 검출됩니다. 그런 다음 결과 신호에 별도의 색상이 할당되어 조직의 단백질과 지질을 식별하는 데 도움이 되는 2색 이미지를 생성합니다.

마우스 뇌 조직의 2색 자극 라만 산란 이미징

출처: McCullagh, E. A., et al. 뇌 절편의 수초화 이미징을 위한 CARS(Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy) 적용. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 설치류 뇌 조직의 신경 구조를 시각화하기 위한 형광 및 CARS(Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy) 이미징을 보여줍니다. Nissl 염색은 리보솜 RNA에 결합하여 세포체를 표지하는 반면, CARS 이미징은 레이저 유도 신호를 통해 지질이 풍부한 미엘린을 표적으로 삼습니다. 형광 및 CARS 이미지를 오버레이하면 세포체와 수초가 있는 축삭에 대한 자세한 보기를 제공합니다.

마우스 뇌 조직에서 수초 뉴런을 시각화하기 위한 Coherent Anti-Stokes Raman 분광법

분자 결합의 고유 진동에 따라 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 현미경 레이블없는 화학적으로 선택적 라이브 세포 이미징을 허용합니다. 사파이어 레이저와 OPO 레이저 본 작업은 펨토초의 Ti에 기초한 표준 광자 레이저 스캐닝 현미경에 상보 현미경 기술의 구현을 제공한다.

사파이어와 OPO 레이저 기반 표준 레이저 스캐닝 현미경 :에 Ti에 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 시스템의 구현

여기 우리 organotypic 슬라이스 문화 마우스 소 뇌 및 myelination와 중앙 신 경계에 remyelination의 메커니즘을 조사 적합 immunohistochemistry에 의해 얼룩 myelin 칼 집에서 준비 하는 방법을 제시.

준비 및 Immunostaining Myelinating Organotypic 소 뇌 조각 문화

자극라만 산란 (SRS) 현미경 검사법은 특정 화학 적 moieties의 선택적, 라벨없는 이미징을 허용하고 효과적으로 생체 내에서 지질 분자를 이미지하기 위해 사용되었습니다. 여기에서, 우리는 SRS 현미경 검사법의 원리에 대한 간략한 소개를 제공하고 Caenorhabditis elegans에있는 지질 저장에 그것의 사용을 위한 방법을 기술합니다.

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자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 강력하고 비파괴적이며 라벨이 없는 이미징 기술입니다. 한 가지 새로운 응용 분야는 자극 라만 조직학이며, 여기서 단백질과 지질 라만 전이에서 두 가지 컬러 SRS 이미징이 의사 헤마톡실린 및 에오신 이미지를 생성하는 데 사용됩니다. 여기에서는 조직 진단을 위한 실시간 이색 SRS 이미징을 위한 프로토콜을 시연합니다.

조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 두 가지 색상 자극 라만 산란 영상

이 논문은 동일한 현미경 플랫폼에 통합 된 자극 된 라만 산란 (SRS)과 일관된 스토크스 라만 산란 (CARS)의 해상도, 감도 및 이미징 대비를 직접 비교합니다. 결과는 CARS가 더 나은 공간 분해능을 가지며, SRS는 더 나은 콘트라스트와 스펙트럼 분해능을 제공하며, 두 방법 모두 비슷한 감도를 가지고 있음을 보여줍니다.

화학 이미징을 위한 하이퍼스펙트럼 자극 라만 산란 및 일관된 안티스토크스 라만 산란 현미경의 직접 비교

우리는 광대역 자극 라만 산란 (SRS) 현미경으로 화학 이미지를 획득하기위한 프로토콜을 제시합니다. 차등 다중 채널 잠금 검출로 작동하는 SRS 현미경을 기반으로 하는 프로토콜은 시료 준비, SRS 장치의 조정 및 화학적으로 이질적인 샘플의 서로 다른 구성 요소를 분리하기 위한 화학측정법을 설명합니다.

광대역 자극 라만 산란 현미경을 기반으로 한 멀티플렉스 화학 이미징

label-free 광학 이미징 방식을 결합한 멀티모달 플랫폼을 활용하여 세포 역학 및 신진대사를 시각화하고 정량화하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 다광자 형광, 2차 고조파 생성 및 유도 라만 산란 현미경을 통한 이미징을 통해 세포 및 분자 환경에 대한 전체적인 개요를 생성할 수 있습니다.

세포 대사 연구를 위한 멀티모달 광학 이미징 플랫폼

배우세요 뇌 조직 수초화를 시각화하는 CARS 현미경 기법으로, 면역형광과 결합하여 다발성경화증 및 자폐증 같은 탈수초화 질환 연구에 활용합니다. 이 방법은 전자현미경 대비 비파괴적이고 유연한 이미징을 제공합니다.

뇌 조각의 수초화 이미징을 위한 일관된 안티-스톡스 라만 분광법(CARS) 애플리케이션

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