단일 분자 연구를 위한 이중 광학 핀셋 및 미세 유체 공학 사용

튜브가 있는 주사기에 결합할 포트를 부착하는 것은 올바르게 수행되면 누출이 없고 플로우 셀에 기포가 없으며 신중하게 사용하여 1년 동안 동일한 플로우 셀을 사용하여 반복적으로 실험을 수행할 수 있기 때문에 중요합니다. 여기에서는 커넥터를 플로우 셀에 부착하는 두 가지 간단한 방법이 제시됩니다. 이는 쉽고 재현 가능하며 조사자가 큰 어려움 없이 플로우 셀을 필요에 맞게 쉽게 조정할 수 있도록 합니다.

이러한 유동 세포의 사용은 단일 분자 실험을 염두에두고 수행되었습니다. 특히, 우리가 시각 생화학이라고 부르는 것, 그러나 미세 유체 공학이 필요한 모든 연구와 층류 유체 흐름이 사용되는 상황에서 사용할 수 있습니다. 따라서 실수를 피하기 위해 귀중한 플로우 셀을 사용하여 기술을 확립하는 대신 먼저 유리 슬라이드나 커버 슬립에서 연습하는 것이 좋습니다.

이를 통해 유리 또는 PDMS 재료에 대한 느낌을 얻어 처리 방법과 튜브를 삽입하거나 커넥터를 접착할 때 얼마나 많은 힘을 가해야 하는지 알 수 있습니다. 이를 위해서는 일부 커넥터를 희생해야하지만 플로우 셀보다 훨씬 저렴합니다. 플로우 셀을 깨끗하고 평평한 표면에 놓는 것으로 시작하십시오.

집게로 자유 끝에서 3mm 떨어진 PTFE 튜브를 잡고 튜브를 포트에 밀어 넣습니다. 나머지 각 포트에 대해 이 절차를 반복합니다. 입구 포트를 주사기 펌프에 연결하고 배출구를 폐병에 연결합니다.

각 유리 주사기에 1 밀리리터의 분광 광도계를 채우고 메탄올을 등급화하고 스위칭 밸브에 부착합니다. 밸브에 배출구가 폐기물로 향하는지 확인하고 50 마이크로 리터의 메탄올로 각 라인을 퍼지하십시오. 출구 위치를 플로우 셀로 전환하고 시간당 100 마이크로리터의 유속으로 플로우 셀을 통해 800 마이크로리터의 메탄올을 펌핑하여 표면을 적시고 기포를 제거합니다.

다음날 800 마이크로 리터의 초순수를 사용하여이 과정을 반복하십시오. 이제 플로우 셀을 사용할 준비가 되었습니다. 압입식 튜브 커넥터를 사용하는 경우 커넥터의 한쪽에서 접착 테이프를 조심스럽게 제거하고 현미경 슬라이드의 구멍 위에 놓습니다.

몇 초 동안 아래로 누릅니다. 나머지 커넥터에 대해 이 과정을 반복합니다. 그런 다음 플로우 셀을 깨끗하고 평평한 표면에 놓습니다.

PTFE 튜브를 자유 끝에서 3mm 떨어진 곳에 잡고 튜브를 포트의 구멍에 밀어 넣습니다. 나머지 각 포트에 대해 이 절차를 반복합니다. 입구에서 스위칭 밸브에 튜브를 부착하십시오.

부착물을 깨끗하고 평평한 표면 또는 맞춤형 매니폴드에 놓아 본딩이 발생하는 동안 플로우 셀과 커넥터를 제자리에 고정합니다. 매니폴드의 오목한 부분에 플로우 셀을 놓은 다음 어셈블리 바닥에 소량의 유리 접착제를 놓고 씰을 삽입합니다. 현미경 슬라이드의 입구 구멍 중 하나에 나노 포트를 놓습니다.

측면 움직임 없이 부드럽게 아래로 누르고 제자리에 고정합니다. 나머지 포트에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 매니폴드에서 건조하거나 제자리에 고정하십시오.

매니폴드에서 플로우 셀을 조심스럽게 제거하고 어셈블리가 플로우 셀의 입구 포트와 잘 정렬되는지 확인합니다. 현미경 스테이지에 플로우 셀을 놓고 손가락으로 조이는 커넥터를 사용하여 튜브를 부착합니다. 각 유리 주사기에 1 밀리리터의 분광 광도 등급 메탄올을 채 웁니다.

각 주사기를 스위칭 밸브에 부착합니다. 밸브에 배출구가 폐기물로 향하는지 확인하고 50 마이크로 리터의 메탄올로 각 라인을 퍼지하십시오. 출구 위치를 유동 셀로 전환하고 시간당 100 마이크로리터의 유속으로 유동 전지를 통해 800 마이크로리터의 메탄올을 펌핑합니다.

다음날 800 마이크로 리터의 초순수를 사용하여이 과정을 반복하십시오. 전력 출력 측정은 여기에 표시됩니다. 레이저의 출력은 레이저 헤드를 광학 레이아웃에 설치하기 전에 측정됩니다.

트랩 정렬이 완료되면 빔 파워는 각 트랩에 대한 100 x 대물렌즈 후에 측정됩니다. 이미지는 1마이크로미터 형광 비드의 안정적인 광학 트래핑을 보여줍니다. 여기서 F는 고정 트랩이고 M은 모바일 트랩입니다.

스캐닝 모드의 모바일 트랩이 30헤르츠에서 작거나 큰 원을 통해 이동합니다. 유동 셀 내의 유체 흐름은 층류입니다. 개략도는 채널 간 확산이 인접한 유체 스트림 간의 혼합의 주요 소스임을 보여주기 위해 상단에서 플로우 셀을 보여줍니다.

파란색 화살표는 흐름 방향을 나타내며 개별 스트림은 흰색, 밝은 회색 및 흰색으로 표시됩니다. 채널 간 횡 방향 확산의 확대 영역은 빨간색으로 표시됩니다. 삽입물은 하부 스트림에 형광 표지된 DNA 비드 복합체와 상부 스트림에만 완충제가 있는 10배 배율로 인접한 유체 스트림의 형광 이미지를 보여줍니다.

상류의 흰색 반점은 CCD 카메라의 샷 노이즈입니다. 유동 프로파일과 층류 셀은 포물선입니다. 플로우 셀은 측면에서 볼 수 있으며 플로우 방향은 각 셀 위에 표시됩니다.

선형 비드 속도는 펌프 속도와 자당 농도의 영향을 받습니다. 비드에 가해지는 반대 힘은 용액 점도의 영향을 받습니다. 비드 직경은 흐름 중인 비드에 가해지는 힘에 영향을 미칩니다.

이 절차를 시도 할 때 작업중인 영역이 깨끗하고 분광 등급 메탄올 또는 아세톤으로 유리 표면을 청소했는지 확인하십시오. 이 단계에서는 주사기 펌프로 연결되는 플로우 셀이 있어야 하며 이제 솔루션을 도입하고 광학 핀셋 실험을 시작할 준비가 되었습니다. 장기간 사용할 수 있는 플로우 셀을 사용하여 연구자들은 두 가지 힘 중 하나를 측정하고 형광 또는 이 둘의 조합으로 반응을 시각화하는 다양한 단일 분자 반응을 조사할 수 있었습니다.