기능적 연구를 위한 인간 시냅틱 수용체를 재활성화하기 위한 시냅틱 멤브레인의 미세이식

신경 퇴행성 및 정신 건강 장애는 시냅스 통신의 변화로 인해 발생합니다. 다인자 사건은 우리가 완전히 이해하지 못하는 방식으로 시냅스 수용체를 변화시킵니다. 시냅스 막의 미세 이식은 이러한 변화에 대한 통찰력을 제공합니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 인간의 뇌에서 작동하는 토착 뇌 수용체의 활동을 기록 할 수 있다는 것이므로 우리가 연구하고있는 질병을 나타냅니다. 시냅스 수용체는 뇌의 전기 활동을 조절하는 의학의 주요 표적이지만, 이러한 수용체가 어떻게 변하는지 이해하면 기능을 회복시키는 더 나은 치료법이 개발 될 수 있습니다. 이 방법은 곤충, 물고기, 포유류에서 다른 종에 성공적으로 적용되었지만 뇌 외부의 막 수용체, 예를 들어 근육 및 종양에도 적용될 수 있습니다.

가능성은 넓습니다. 주사 바늘을 트리밍하는 것은 까다 롭습니다. 너무 작으면 단백질 주입을 막을 수 있으며 두 개의 큰 세포가 세포를 죽일 수 있습니다.

면도날의 가장자리와 같은 일관된 측정을 사용하는 데 도움이됩니다. 관심있는 인간 뇌 영역에서 준비된 선택된 샘플을 떠 다니는 젖은 얼음이있는 욕조에서 세 번 초음파 처리하여 시작하십시오. 매번 다섯 번째 사이클을 사용하고 사이클 사이에 젖은 얼음 위에서 한 분 동안 기다리십시오.

샘플의 한 마이크로리터를 열가소성 플라스틱 위에 놓고, 필요한 경우 샘플의 이동을 방지하기 위해 샘플 배치 전에 표면에 압입하십시오. 나노 인젝터를 고정하는 조작기의 손잡이를 사용하여 바늘을 배치하고 채울 샘플 쪽으로 이동하십시오. 바늘 팁이 샘플에 있으면 충분한 샘플이 채취될 때까지 채우기 버튼을 길게 누릅니다.

10 난모세포에 대해 약 0.5 마이크로리터 샘플이 필요하다. 손잡이를 사용하여 나노 인젝터의 바늘을 다시 가장 높은 위치로 옮깁니다. 바늘로 표면 바로 아래의 난모세포를 더 깊지 않게 침투시키고 발 페달을 사용하여 샘플을 주입하십시오.

두세 초 정도 기다립니다. 성공적인 주사 후, 세포는 확장 될 것입니다. 조작기의 손잡이를 사용하여 셀을 종료합니다.

페트리 접시를 움직여 다음 난모세포가 바늘과 정렬되도록하십시오. 접시에 원하는 수의 난모세포가 주입 될 때까지 과정을 반복 한 다음 나노 인젝터를 원래 위치로 후퇴시키고 바늘을 제거하십시오. 난모세포의 한 웰이 주사되지 않은 채로 남아 대조군으로 사용되도록 하십시오.

이온 전류 기록에 사용되는 모든 장비를 켠 다음 데스크톱 컴퓨터를 켜고 WinEDR 버전 3.9.1에 로그인합니다. 프로그램이 실행 중이고 레코드가 디스크로 설정되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 녹화 기간을 설정하고 시뮬레이터 옵션을 지우십시오.

전압 전극 섹션의 경우 음극 용량 보정을 끕니다. 배스 전극 섹션의 경우 이득 선택기 스위치를 10으로 설정한 다음, 이득 승수를 선택하는 세 위치 토글 스위치를 x1로 설정합니다. LED 표시등은 게인 승수 선택을 나타냅니다.

클램프 모드 선택기를 끄고 DC 이득 제어를 안으로 전환한 다음 이득 제어를 전체 대역폭 개방 루프의 약 절반으로 설정합니다. 명령을 40밀리볼트로, 보류 컨트롤을 음수로, 배율 승수를 x2로 설정합니다. 전류 전극의 경우, 난모세포를 함축시키기 전에 VE 오프셋을 사용하여 제로 참조를 설정하십시오.

그런 다음 WinEDR 버전 3.9.1 소프트웨어를 열고 상단 메뉴로 이동하여 파일, 새로 만들기를 차례로 선택합니다. 자신의 폴더를 만들고 파일을 저장하십시오. 주 메뉴에서 레코드, 디스크에 기록을 차례로 선택합니다.

한천 브리지를 기록 챔버 뒤의 각 원형 구멍에 놓고 기록 챔버에서 접지 참조로 사용되는 전극의 웰을 연결합니다. 1x 링거의 작동 솔루션을 해당 관류 밸브에 추가하십시오. 녹음 챔버가 링거의 솔루션으로 채워질 때까지 밸브를 엽니다.

전극을 고정하는 좌우 조작기를 사용하여 전극 바늘을 링거 솔루션으로 채워진 녹음 챔버로 안내합니다. VM 및 VE 오프셋 노브를 제로아웃한 다음 전극 테스트 버튼을 눌러 각 전극의 저항을 확인합니다. 저항은 0.5 ~ 3 메가 옴 사이이어야합니다.

저항이 범위를 벗어나면 새로운 미세 전극을 사용하여 교체하십시오. 그런 다음 녹음 챔버를 신선한 링거 솔루션으로 채 웁니다. 유리 피펫을 사용하여 주입되지 않은 난자 또는 미세 이식된 난모세포를 기록 챔버의 중앙에 배치한다.

난모세포가 동물 옆면을 위로 향하게하여 현미경으로 명확하게 볼 수 있는지 확인하십시오. 전극이 난모세포막에 닿을 때까지 링거 용액으로 전극을 안내하십시오. 양쪽 전극으로 동물 측의 난모세포막을 부드럽게 관통하고, 휴지막 전위를 기록한다.

링거의 솔루션 흐름을 켭니다. 난모세포 클램프 증폭기를 사용하여 모드를 전압 클램프 저속으로 변경하고 유지 전압을 80 밀리볼트로 설정하십시오. 모니터의 전류는 음수여야 하며, 일반적으로 0~0.4마이크로암페어여야 합니다.

파일, 새로 만들기로 이동 한 다음 소프트웨어에 녹음을 저장하여 새 파일을 만들고 녹음을 저장하십시오. 녹음을 누른 다음 디스크에 녹음을 눌러 녹음을 시작합니다. 차트 표시 대화 상자를 사용하여 파일에 관련 정보를 추가합니다.

밸브를 열고 15초 동안 기록 챔버 내로 관류시킴으로써 화학적 자극을 위한 작용제를 적용한다. 녹음이 완료되면 전압 클램프를 꺼짐 위치로 돌리고 링거의 솔루션 밸브를 끕니다. 난모세포를 제거하고 인간의 뇌 샘플에 대한 제도적 정책을 폐기 한 다음 기록을 중지하고 파일을 저장하십시오.

녹음 사본을 USB 드라이브에 저장합니다. 거기에서 분석 할 파일을 엽니 다. AMPA 최대 응답 및 GABA A 피크 응답을 측정하려면 먼저 빨간색 선을 찾아 0 수준 또는 기준선을 설정한 다음 Ringer 응용 프로그램 또는 기준선에서 생성된 전류로 드래그합니다.

0 레벨이 설정되면 녹색 수직 판독 커서를 그래프 트레이서의 원하는 부분으로 드래그하여 응답 측정값을 결정합니다. 인간 시냅스 수용체로부터의 막과 함께 주입된 난모세포로부터의 이온 전류가 기록되었다. AMPA 수용체는 100 마이크로몰 카이네이트 및 1밀리몰 GABA를 갖는 GABA A 수용체로 활성화되었다.

아세틸콜린 수용체가 풍부한 어뢰의 전기 기관으로부터 여과된 막을 공동-주입하고, GABA 행 하나의 수용체를 암호화하는 cDNA를 동물 극으로 주입하여 그들의 반응에 기초하여 주로 두 그룹의 난모세포를 생성하였다. 난모세포의 한 그룹은 아세틸 콜린에 큰 반응을 보였지만 하나의 마이크로 몰 GABA에 대한 반응은 없었습니다. 다른 그룹의 난모세포는 아세틸 콜린에 대한 null 또는 낮은 반응을 보였지만 GABA에 대한 반응은 컸습니다.

그래픽 이미지는 그룹 하나와 그룹 두 개의 피크 전류 평균의 평균 더하기 표준 오차를 뺀 값을 보여줍니다. 두 그룹의 한 난모세포는 큰 GABA와 아세틸콜린 반응을 보였으며, 이는 핵의 파열을 암시한다. 결과적으로, 반응의 분포는 막 전류의 분포의 평균과 중앙값 사이의 차이에 의해 주목되는 바와 같이 낮은 값으로 치우쳐졌다.

낮은 반응 난모세포의 원인 중 하나는 막이 주입되고 난모세포의 핵에 갇혀 있다는 것입니다. GABA 및 카이네이트 난모세포의 반응은 AD가 아닌 뇌로부터 수득된 여과되지 않은 막으로 동물 또는 식물 극에 주입되고, AD 뇌는 여기에 도시되어 있다. 핵을 표적화하지 않고 동물 극 근처에 주사된 난모세포는 식물 극에 주입된 난모세포보다 더 큰 반응을 보였고, 따라서 매우 적은 수의 수용체를 갖는 조직 샘플의 연구를 가능하게 하였다.

이 절차를 시도하는 동안 항상 링거 레벨을 모니터링하십시오. 중요한 녹음 중에 항상 소진 될 것이고, 그 다음 결과와 난모세포의 죽음 및 매우 귀중한 데이터의 손실을 사용합니다. 이 절차에 따라, 우리는 시냅스 수용체 또는 관심있는 단백질의 존재를 검증하기 위해 서양 부하를 수행 할 수 있습니다.

그것은 다른 뇌 영역과 다른 뇌 장애에서 시냅스 비율을 억제하기 위해 전 세계적인 흥분을 측정 할 수있어 질병의 원인에 대한 이론적 예측에 대한 직접적인 테스트를 할 수 있습니다.