Name: 단일 웜 데이터를 사용하여 예쁜꼬마선충-박테리아 상호작용의 이질성 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-22T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 배우세요 Caenorhabditis elegans에서 세균 부하를 정량화하는 기계적 파괴 방법을 96웰 플레이트 형식으로 적용하는 기술입니다. 이 프로토콜은 개별 웜의 장내 세균 이질성을 효율적으로 분석하여 미생물-숙주 상호작용 연구에 활용됩니다.

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저자들은 H. Schulenberg와 C. LaRock이이 실험에 사용 된 박테리아 균주를 관대하게 공유 한 것을 인정하고 싶습니다. 이 작업은 Emory University와 NSF (PHY2014173)의 기금으로 지원되었습니다.

<ol><li>Armitage, D. W., Jones, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+sample+heterogeneity+can+obscure+the+signal+of+microbial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions.</a> The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).</li>
<li>Stephenson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+heterogeneity+affects+both+parasite+transmission+to+and+fitness+on+subsequent+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093(2017).</li>
<li>VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+pathogen+transmission%3A+mechanisms+and+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Ecology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology.</a> Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).</li>
<li>Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+heterogeneity+in+susceptibility+and+disease+dynamics%3A+tests+of+a+mathematical+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Naturalist%22%5BJournal%5D)">Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model.</a> The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).</li>
<li>Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+hidden+heterogeneity+in+isogenic+populations+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans.</a> Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).</li>
<li>Yashin, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+changes+the+heterogeneity+distribution+in+populations+of+Caenorhabditis+elegans+does+it+tell+us+anything+about+the+biological+mechanism+of+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response.</a> The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+death+in+ageing+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).</li>
<li>Eckley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+transition+to+mid-life+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22AGE%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans.</a> AGE. 35 (3), 689-703 (2012).</li>
<li>Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stress-sensitive+reporter+predicts+longevity+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).</li>
<li>Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+cell+non-autonomous+gene+regulation+drives+individual+lifespan+among+isogenic+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans.</a> eLife. , (2021).</li>
<li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652(2017).</li>
<li>Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+age+generates+phenotypic+variation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).</li>
<li>Baeriswyl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+aging+profiles+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans+by+bacteria+causing+different+extrinsic+mortality+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates.</a> Biogerontology. 11 (1), 53(2009).</li>
<li>Taylor, M., Vega, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+immunity+alters+community+ecology+and+stability+of+the+microbiome+in+a+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model.</a> mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).</li>
<li>Diaz, S. A., Restif, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spread+and+transmission+of+bacterial+pathogens+in+experimental+populations+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).</li>
<li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090(2014).</li>
<li>Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+bacterial+competition+regulates+community+assembly+in+the+C.+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine.</a> The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).</li>
<li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF%CE%B2%2FBMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 604(2019).</li>
<li>Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+and+resilience+between+founder+and+introduced+bacteria+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).</li>
<li>Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra+strain+variation+of+the+effects+of+gram-negative+ESKAPE+pathogens+on+intestinal+colonization%2C+host+viability%2C+and+host+response+in+the+model+organism+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 3113(2020).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2001).</li>
<li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+gateway+to+a+new+host-microbiome+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14, 38(2016).</li>
<li>Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+intercepts+Escherichia+coli+signaling+to+enhance+antibiotic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).</li>
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<li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput%2C+high-content%2C+liquid-based+C.+elegans+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068(2018).</li>
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<li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromones+modulate+learning+by+regulating+the+balanced+signals+of+two+insulin-like+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides.</a> Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).</li>
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<li>Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+bacterial+loads+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).</li>
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<li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+C.+elegans+daf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921(2003).</li>
<li>Thutupalli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Farming+and+public+goods+production+in+Caenorhabditis+elegans+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).</li>
<li>Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+RNA+analysis+of+individual+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans.</a> MethodsX. 2, 59-63 (2015).</li>
<li>Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+assembly+of+the+native+C.+elegans+microbiome+is+influenced+by+time%2C+substrate%2C+and+individual+bacterial+taxa%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa.</a> Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).</li>
<li>Vega, N. M., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+assembly+produces+heterogeneous+communities+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine.</a> PLOS Biology. 15 (3), 2000633(2017).</li>
<li>Gulyas, L., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+shock+induces+a+terminal+investment+reproductive+response+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1338(2022).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+program+mediates+cold-warming+response+and+promotes+stress-induced+phenoptosis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans.</a> eLife. 7, 35037(2018).</li>
<li>Robinson, J. D., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+recovery+from+acute+cold+shock+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Cell Biology. 17 (1), 2(2016).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

여기서 데이터는 C. elegans의 박테리아 부하의 단일 웜 정량화의 이점과 96-well 파괴 프로토콜에 대해 제시되어 이러한 유형의 대규모 데이터 세트를 신속하고 일관되게 수집 할 수 있습니다. 기존의 방법(33)과 비교하여, 이들 프로토콜은 웜 내의 장내 미생물 군집의 더 높은 처리량 측정을 허용한다.
이 접근법은 도금을 속도 제한 단계로 가지며 진정한 "높은 처리량"이 아닙니다. 대개체 유세포 분석기(도 3C,D)는 개별 웜(16)에서 형광 표지된 박테리아를 정량화하는 데 유용한 고처리량 방법이지만, 동시 형광단의 수는 다종 군집에서는 한계가 있다. 다중 웰 플레이트 중단을 커뮤니티 시퀀싱과 연결하는 것은 처리량을 늘리는 또 다른 방법입니다. 그러나, 여기에 기술된 96-웰 파괴 절차는 ...

숙주-미생물 연관성에서의 이질성은 유비쿼터스적으로 관찰되며, 개인들 사이의 변이는 경쟁과 공 존1에서 질병 전달 2,3,4에 이르는 집단 수준 과정에 기여하는 요인으로 점점 더 인식되고 있다. C. elegans에서, isogenic 집단 내의 "숨겨진 이질성"이 반복적으로 관찰되었으며, 열 충격 반응 5,6, 노화 및 수명 7,8,9,10,11 및 생리학 및 발달의 많은 다른 측면에서 뚜렷한 표현형을 보이는 개인의 하위 집단 12 . 하위 집단 구조를 확인하려는 대부분의 분석은 동종 동기화 된 웜5,7,8의 실험 집단에서 두 개의 하위 집단에 대한 증거를 제공하지만, 다른 데이터는 별개의 그룹보다는 형질의 인구 내 분포의 가능성을 시사합니다 7,12,13 . 여기서와 관련성이 있는 경우, 미생물 13,14,15,16의 공유 공급원으로부터 콜로니화된 웜의 isogenic 집단 내에서도 장 집단에서의 실질적인 이질성이 관찰되며, 이러한 이질성은 웜의 박테리아 정량화를 위해 널리 사용되는 배치 다이제스트 측정치(17,18,19,20)에 의해 은폐될 수 있다.
이 연구는 숙주-미생물 연관에서 단일 웜 측정에 대한 의존도가 높아질 필요성을 시사하는 데이터와 단일 웜 중단에서 정확도와 처리량을 높이기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜은 생존 가능한 박테리아 부하의 정량화를 위해 많은 수의 개별 C. elegans 의 기계적 파괴를 촉진하도록 설계되었으며, 개별 웜의 유역 기반 파괴보다 샘플 당 더 나은 반복성과 낮은 노력을 제공합니다. 벌레가 파괴를 준비하기 전에 열로 죽인 대장균 을 먹일 수 있도록 허용하는 권장 장 정화 단계가 포함되어 최근에 섭취 한 박테리아 및 기타 일시적 (부착되지 않은) 박테리아의 기여를 최소화합니다. 이들 프로토콜은 저농도 표면 표백제 처리로 큐티클을 세척하기 위한 냉 마비 방법; 표면 표백은 단일 웜 파괴의 준비 단계 또는 살아있는 외부 세균이없는 웜을 준비하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 이러한 표면-표백 방법은 광범위한 외부 미생물을 제거하기에 충분하며, 냉간 처리는 종래의 레바미솔-기반 마비에 대한 대안을 제공한다; 레바미솔은 감기에 민감한 실험에 선호되는 반면, 냉간 마비는 위험한 폐기물 흐름에 대한 기여를 최소화하고 정상적인 활동을 신속하게 재개 할 수있게합니다. 전체 프로토콜은 웜이 알려진 박테리아로 식민지화되는 실험실 실험을 설명하지만, 웜 및 단일 웜 파괴를 청소하는 절차는 야생 샘플에서 분리되거나 소우주 실험에서 식민지화 된 웜에 쉽게 적용될 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 웜 장에서 추출 된 살아있는 박테리아를 생산하며, 개별 웜에서 콜로니 형성 단위 (CFU)의 도금 및 정량화에 적합합니다. 시퀀싱 기반 장 군집 분석을 위해, 후속 세포 용해 및 핵산 추출 단계가 이들 프로토콜에 추가되어야 한다.

<table><tbody><tr><td>96웰 평면 바닥 폴리프로필렌 플레이트, 300uL</td><td>Evergreen Labware</td><td>290-8350-03F</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트 밀봉 매트, 실리콘, 사각 웰(AxyMat)</td><td>Axygen</td><td>AM-2ML-SQ</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트, 2mL, 사각 웰</td><td>Axygen</td><td>P-2ML-SQ-C-S</td><td></td></tr><tr><td>96웰 폴리프로필렌 플레이트 뚜껑</td><td>Evergreen Labware</td><td>290-8020-03L</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>Fisher Scientific</td><td>443570050</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트용 비드 밀 어댑터 세트</td>, <td>QIAGEN</td><td>119900</td><td>TissueLyser II에서 2개의 96웰 플레이트와 함께 사용하기 위한 어댑터 플레이트</td></tr><tr><td>, 비드 밀 조직 균질화기(TissueLyser II)</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td>, <td>중간에서 고처리량 시료 파괴를 위한 기계적 균질기</td></tr>, <tr><td>BioSorter</td><td>Union, Biometrica</td><td>견적</td><td>에 의해C. elegans</td></tr><tr><td>Bleach, 상업용, 8.25% 차아염소산나트륨</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Breathe-Easy 96웰 가스 투과성 밀봉 멤브레인</td>을 위한 250미크론 초점이 장착된 대형 물체 분류기 <td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td>Multiwell 플레이트 가스 투과성 폴리우레탄 멤브레인. 얇은 밀봉 필름은 O2, CO2 및 수증기를 투과할 수 있으며 300nm까지 UV 투과성이 있습니다. 멸균, 100/상자.</td></tr><tr><td>칼슘 클로라이드 디하이드레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423525000</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>VWR</td><td>AAA11470-30</td><td></td></tr><tr><td>시트르산 모노하이드레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC124910010</td><td></td></tr><tr><td>구리 (II) 황산염 펜타하이드레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC197722500</td><td></td></tr><tr><td>Corning 6765 LSE 미니 마이크로 원심분리기</td><td>Corning</td><td>&nbsp; COR-6765</td><td></td></tr><tr><td>디소듐 EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>409971000</td><td></td></tr><tr><td>DL 1,4 디티오트레이톨, 99+%, mol 생물학, DNAse, RNAse 및 프로테아제 무함유, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>327190010</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424R microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5406000640</td><td>24홀 냉장 실험대용 마이크로 원심분리기</td></tr>, <tr><td>Eppendorf 5810R 원심분리기, 로터 S-4-104</td><td>포함, Eppendorf</td><td>22627040</td><td>3L 실험대용 원심분리기, 15-50 mL 튜브 및 플레이트용 어댑터,</td></tr><tr><td>Eppendorf plate bucket (x2), Rotor S-4-104</td>, <td>Eppendorf</td><td>22638930</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>용Fisher Scientific</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>유리 구슬, 2.7 mm</td><td>생명 과학 제품</td><td>LS-79127</td><td></td></tr><tr><td>유리 구슬, 산 세척, 425-600 &마이크로; m</td><td>Sigma</td><td>G877-500G</td><td></td></tr><tr><td>유리 도금 구슬</td><td>VWR</td><td>76005-124</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>VWR</td><td>BDH7204-1</td><td></td></tr><tr><td>철(II) 황산염 헵타하이드레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>423731000</td><td></td></tr><tr><td>Kimble Kontes 펠릿 유봉 모터</td><td>DWK Life Sciences</td><td>749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>Kimble Kontes 폴리프로필렌 펠릿 유봉 및 마이크로튜브, 0.5 mL</td><td>DWK Life Sciences</td><td>749520-0590</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8 전동 도립 현미경(전동 스테이지 포함</td>) <td>Leica</td><td>11889113</td><td></td></tr><tr><td>Leica LAS X Premium 소프트웨어</td><td>Leica</td><td>11640687</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC124900010</td><td></td></tr><tr><td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td><td>VWR</td><td>470301-706</td><td></td></tr><tr><td>PARAFILM M 유연한 실험실 밀봉 필름</td><td>Amcor</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>펩톤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 원형, 10cm</td><td>VWR</td><td>25384-094</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 원형, 6cm</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 사각형, 10 x 10cm</td><td>VWR</td><td>10799-140</td><td></td></tr><tr><td>인광 완충 식염수(1X PBS)</td><td>Gold Bio</td><td>P-271-200</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 오토클레이브 트레이, 얕은</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-361-10</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼</td>륨 <td>Fisher Scientific</td><td>AC134062500</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td><td>성 Fisher Scientific</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443</td><td>R Foundation</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>스쿠프형 실험실 주걱, 금속</td><td>VWR</td><td>470149-438</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 카바이드 36</td>방 <td>MJR 텀블러</td><td>n/a</td><td>검은색 엑스트라 굵�은 실리콘 카바이드 그릿. 이 공급업체에서 0.5-5lb 크기로 제공됩니다.</td></tr><tr><td>황산나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>VWR</td><td>BDH7247-1</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 무수</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC419760010</td><td></td></tr><tr><td>삼중 칼륨 구연산염 일수화물</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC611755000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>황산아연 헵타하이드레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC205982500</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 웜 데이터를 사용하여 예쁜꼬마선충-박테리아 상호작용의 이질성 정량화

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

선충류 Caenorhabditis elegans 는 숙주 - 미생물 및 숙주 - 미생물 상호 작용을위한 모델 시스템입니다. 현재까지 많은 연구는이 유기체의 박테리아 부하를 정량화하기 위해 개별 웜 샘플보다는 배치 다이제스트를 사용합니다. 여기서 C. elegans 장의 박테리아 식민지화에서 볼 수있는 큰 개인 간 변동성은 유익하며, 배치 소화 방법은 조건 간 정확한 비교에 중요한 정보를 폐기한다고 주장합니다. 이러한 샘플에 내재 된 변형을 설명하는 것은 많은 수의 개인을 필요로하기 때문에 개별 웜의 파괴 및 콜로니 도금을위한 편리한 96 웰 플레이트 프로토콜이 확립됩니다.

살아있는 벌레의 표백제 살균 표면 표백 된 웜은 운동성이 회복되고 배설이 재개 될 때까지 외부 박테리아가 효과적으로 없습니다. 여기에 사용된 조건 하에서, 냉마비 웜에서 장-관련 박테리아를 방해하지 않으면서 완충액 내의 박테리아의 급속한 멸종이 관찰된다(도 1A-C, 보충 그림 2, 비디오 1). 이러한 데이터는 표면 표백이 장 내용물을 손상시키지 않고 외부에서 웜을 살균하는 데 효과적으로 사용될 수 있음을 나타냅니다 (표면 표백 된 웜과 표백되지 않은 웜 관련 CFU 카운트의 비교는 중요하지 않습니다, Wilcoxon 랭크 합계 테스트 p &gt; 0.05).
다중 샘플 기계적 중단에 대한 변형</str...

이 프로토콜은 외부 박테리아를 제거하기 위해 감기 마비 및 표면 표백에 이어 박테리아 식민지화 된 Caenorhabditis elegans의 96-well 파괴를 설명합니다. 생성 된 현탁액은 한천 플레이트에 도금되어 많은 수의 개별 웜에서 박테리아 부하의 정확하고 중간 처리량 정량화를 허용합니다.

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

이 프로토콜은 바다 엘레 간스의 기계적 파괴를 보여줍니다. 96 웰 형식으로 개별 웜에서 박테리아 부하의 중간 처리량 정량화가 가능합니다. 이 기술은 Pasel 기반 방법에 비해 기계적 파괴의 속도와 균일성을 높여 연구원이 고품질 단일 웜 측정의 더 큰 데이터 세트를 쉽게 생성할 수 있도록 합니다.이 기술은 많은 움직이는 부품을 포함하며 자리를 잃기 쉽습니다. 시작하기 전에 모든 재료, 라벨이 붙은 튜브, 버퍼 및 플레이트가 설정되어 있는지 확인하십시오. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 전문가 인 Megan Taylor가 될 것입니다.웜 샘플을 마이크로 원심분리 튜브에서 M9TX제로 1의 1 밀리리터에 재현탁시키는 것으로 시작한다. 원심분리에 의해 성충을 수집하고 상청액을 버린다. 동일한 원심분리 파라미터 사용.외부 박테리아를 최소화하기 위해 1 밀리리터의 M9TX01로 웜을 두 번, M9 웜 버퍼 1 밀리리터로 한 번 헹굽니다. 그런 다음 각 샘플을 1 밀리리터의 S 배지에 2 x 열 사멸 OP50을 배양 튜브에 다시 현탁시킵니다. 튜브를 섭씨 25도에서 20-30 분 동안 배양하여 부착되지 않은 박테리아를 장에서 통과시킵니다.배양 후, 퍼지 된 웜을 차가운 M9TX01 1 밀리리터로 두 번 헹구고 상아 액을 버립니다. 튜브를 얼음 위에 10 분 동안 올려 벌레를 마비시킵니다. 그런 다음 무향 표백제가 함유 된 얼음처럼 차가운 M 9 웜 버퍼 1 밀리리터를 각 튜브에 첨가하십시오.외부 박테리아를 죽이기 위해 튜브를 얼음 위에 최소 10분 동안 배양합니다. 표백제 버퍼를 버리고 튜브를 얼음으로 되돌려 벌레가 펌핑되는 것을 방지합니다. 다음으로 차가운 M9TX01 1 밀리리터를 각 튜브에 넣고 5 초 동안 원심 분리합니다.미니 원심 분리기에서. 튜브를 얼음으로 되돌리고 상층액을 제거하십시오. 이 단계를 한 번 반복합니다.웜 큐티클의 화학 투과용. 20 마이크로 리터의 버퍼에 웜이 들어있는 튜브를 실온 튜브 랙으로 옮깁니다. 그런 다음 각 따뜻한 샘플에 100마이크로리터의 SDS/DTT 용액을 추가합니다.튜브를 벤치에서 최대 8 분 동안 배양하여 성인 벌레의 표피를 부분적으로 분해하십시오. 이 시점에서 웜은 죽어 튜브 바닥에 정착합니다. 배양 후 SDS/DTT 상청액을 조심스럽게 폐기합니다.그런 다음 각 튜브에 M9TX01 1밀리리터를 추가하고 잠시 원심분리하여 웜을 펠릿으로 만듭니다. 상청액을 버리고 0.1% Triton x-100으로 1밀리리터 M 9 웜 완충액에 웜을 다시 현탁시킨다. 웜의 기계적 파괴에 대비하려면 멸균 2 밀리리터 깊은 우물 96 웰 플레이트와 실리콘 플레이트 덮개를 확보하십시오.멸균 스쿱 주걱을 사용하여 그리드가 우물 바닥을 거의 덮지 않도록 소량의 멸균 36 그리드 실리콘 카바이드를 각 웰에 첨가하십시오. 180 마이크로리터의 M 나인 웜 버퍼를 각 웰에 추가합니다. 기둥과 행에 레이블을 지정한 다음 실리콘 플레이트 덮개로 플레이트를 느슨하게 덮습니다.다음으로, 투과 된 웜을 M9TX01이 1cm 깊이까지 채워진 작은 페트리 접시로 옮깁니다. 해부 현미경 피펫을 사용하여 20 마이크로 리터 부피의 개별 웜을 제거하고 96 웰 플레이트의 개별 웰로 옮겨 피펫에 붙어있는 웜을 꺼내고 페트리 접시의 깨끗한 영역에서 20 마이크로 리터의 M9TX01을 흡인하여 접시에 다시 놓습니다. 모든 웜이 옮겨지면 96 웰 플레이트를 유연한 천장 필름 시트로 덮고 종이를 받쳐서 샘플 웰을 아래로 향하게합니다.덮개를 우물에 누르지 않고 유연한 천장 필름 위에 실리콘 천장 매트를 가볍게 놓습니다. 중단 중 과열을 방지하기 위해 플레이트를 섭씨 4도에서 30-60분 동안 두십시오. 플레이트를 식힌 후 실리콘 천장 매트를 우물에 단단히 눌러 밀봉합니다.그런 다음 조직 파괴 물질에 플레이트를 고정하십시오. 플레이트를 30헤르츠에서 1분 동안 흔듭니다. 그런 다음 플레이트를 180도 회전하고 1 분 동안 흔들기를 반복하십시오.벤치의 판을 두세 번 세게 두드려 유연한 천장 필름에서 모래를 제거합니다. 플레이트를 2분 동안 2, 400회 G로 원심분리하여 웰의 바닥에서 샘플을 수집한다. 그런 다음 실리콘 뚜껑을 제거하고 천장 필름을 잡아 당깁니다.웜 다이제스트의 10배 연속 희석을 준비하려면 180마이크로리터의 1X PBS를 96웰 플레이트의 행 B에서 D로 채웁니다. 200 마이크로리터로 설정된 멀티웰 피펫터를 사용하여, 웜 다이제스트를 피펫팅으로 천천히 혼합한다. 액체의 최대량을 PBS를 함유하는 96 웰 플레이트의 행 A로 옮긴다.다중 채널 피펫을 사용하여 맨 위 줄에서 20 마이크로 리터를 제거하고 B 열에 분주합니다. 행 B에서 C까지, 다음 행 C에서 D에 대해 이 단계를 반복하여 모노 식민지 웜의 박테리아 정량화를 위한 1000배 희석을 얻습니다. 각 희석액 10 내지 20 마이크로리터를 고체 한천 플레이트 상에 플레이트한다.다종 집락화의 경우, 10 센티미터 한천 플레이트에 각 희석액 100 마이크로 리터를 플레이트합니다. 이 프로토콜을 사용하여 완충액에서 외부 박테리아의 감소로 볼 수 있듯이 차가운 마비 된 벌레의 표면 표백 후 효과적인 외부 살균이 관찰되었습니다. 장내 관련 박테리아에 영향을 미치지 않고.웜의 수동 중단은 더 많은 이질성을 초래했습니다. 실리콘 카바이드 그릿은 Tri Andex의 유무에 관계없이 중단에 이상적이었습니다. 96 웰 방법에서 큰 유리 구슬은 96 웰 기술에 적합하지 않았습니다.작은 유리 구슬은 일관된 결과를 생성했지만 끝 부분에서 파이프를 막았습니다. 동일한 박테리아 풀에 서식하는 벌레는 개별 박테리아와 다종 박테리아 군집에 대해 관찰되었을 때 장 부하의 높은 변화를 보였습니다. GFP를 발현하는 박테리아로 식민지화 된 웜은 개별 웜 측정에서 이질성을 보였습니다.이러한 GFP 발현 박테리아 균주의 경우 야생형 브리스톨렌 2웜의 집락화를 비교하였다. DAF에 2개의 IGF 돌연변이체는 DAF 16 돌연변이체가 더 많은 박테리아 집단을 지원하는 반면, DAF2는 집락화에 내성이 있음을 보여주었다. 이 이질성은 동일한 실험의 다른 실행에서 특징적이고 일관되었습니다.배치 다이제스트를 시뮬레이션하기 위한 데이터의 재샘플링은 개별 웜 데이터와 비교하여 분포를 변경하는 것으로 밝혀졌습니다. 웜 당 배치 외삽 된 CFU는 생물학적 변이의 손실로 이어지는 개별 데이터의 산술 평균을 중심으로 이루어졌습니다. 살아있는 표면 표백제를 소화하는 대신 헹굼 웜을 추가 실험에 사용할 수 있습니다.추위에서 벌레가 제거되면 움직임이 빠르게 재개됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Taylor, MN, et.al. 단일 웜 데이터를 사용하여 Caenorhabditis elegans-박테리아 상호 작용의 이질성을 정량화합니다. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 무균, 연령 일치 Caenorhabditis elegans 벌레가 장 집락화를 위해 박테리아 균주에 노출되는 것을 보여줍니다. 부착되지 않은 외부 박테리아를 선택적으로 제거하여 정량화를 위해 장 상피에 부착된 생존 가능한 박테리아만 남기는 것을 설명합니다.

무균 C . elegans에서 장내 세균 집락화 평가

출처: Taylor, M. N. et al. 단일 웜 데이터를 사용하여 Caenorhabditis elegans-박테리아 상호 작용의 이질성을 정량화합니다. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 기계적 파괴를 통해 개별 Caenorhabditis elegans 의 장내 세균 부하 변동성을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 개별 벌레 간의 장내 박테리아 부하 차이를 평가하기 위한 샘플 준비, 기계적 파괴, 연속 희석 및 콜로니 계수 단계를 간략하게 설명합니다.

숙주-박테리아 상호 작용의 가변성을 평가하기 위한 개별 벌레의 기계적 파괴

wormsorter 형광 기자의 표현에 따라 웜을 정렬하여 예쁜 꼬마 선충의 유전자 화면을 용이하게한다. 여기에서, 우리는 새로운 사용 설명 : GFP - 표현 병원체에 의한 식민지에 따라 정렬을, 우리는 면역 반응을 시작하기에 병원체의 인식의 불완전하게 이해 역할을 조사하기 위해 그것을 사용합니다.

의 자동 분리<em&gt; C. 엘레</em&gt; 가변 세균성 병원체에 의해 식민지

여기, 선물이 미생물 상호 작용을 공부 하는 다양 한 호스트 모델로 선 충 류 꼬마 선 충 .

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

이 문서에서는 단일 또는 벌크 C. elegans 샘플에서 유전자 발현 수준의 빠르고 신뢰할 수 있는 측정을 위한 고처리량 프로토콜이 설명되어 있다. 이 프로토콜은 RNA 절연을 필요로하지 않으며 샘플에서 직접 cDNA를 생성합니다. 고처리량 멀티플렉션 나노유체 실시간 qPCR 플랫폼과 함께 사용할 수 있습니다.

단일 및 벌크 C.의 고처리량 정량적 RT-PCR. 나노 유체 기술을 사용하여 샘플

샤페론-샤페론과 샤페론 기판 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 온화한 돌연변이와 결합된 RNA 간섭을 사용하여 Caenorhabditis elegans에 있는 합성 상호 작용 스크린을 능력을 발휘하고 chaperones의 과잉 발현및 유기체 수준에서 조직 특정 단백질 기능 장애를 감시합니다.

조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 Caenorhabditis elegans를 사용

장내 미생물은 특정 또는 보존 메커니즘을 통해 숙주의 건강에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. Caenorhabditis elegans 는 그러한 미생물을 스크리닝하는 편리한 플랫폼입니다. 본 프로토콜은 웜 건강의 대용으로 사용되는 선충 스트레스 저항성에 미치는 영향에 대한 48개의 박테리아 분리주의 고처리량 스크리닝을 설명합니다.

Caenorhabditis elegans 건강에 영향을 미치는 미생물 분리물의 고처리량 스크리닝

Caenorhabditis elegans 는 생물학의 주요 모델 종 중 하나이지만 거의 모든 연구는 자연적으로 관련된 미생물이없는 상태에서 수행됩니다. 여기에 설명 된 방법은 미래의 기능적 C. elegans 연구의 기초로서 관련 미생물의 다양성에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이 될 것입니다.

모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화

퇴비 소우주는 자연에서 발견되는 미생물 다양성을 실험실로 가져와 Caenorhabditis elegans의 미생물 군집 연구를 용이하게합니다. 여기에는 소우주 실험을 설정하기위한 프로토콜이 제공되며, 실험은 환경 미생물 다양성과 벌레 장내 미생물 구성 간의 관계를 탐구하기 위해 환경 미생물 다양성을 조절하는 능력을 보여줍니다.

Caenorhabditis elegans의 마이크로바이옴 연구를 위한 미생물적으로 다양하고 자연과 유사한 환경으로서의 소우주를 퇴비화

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 은 숙주-마이크로바이옴 상호작용을 유도하는 분자 결정 요인을 조사할 수 있는 강력한 모델입니다. 우리는 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 생리학의 주요 측면과 함께 장내 마이크로바이옴 집락화의 단일 동물 수준을 프로파일링하는 고처리량 파이프라인을 제시합니다.

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 장내 마이크로바이옴의 정량화 및 분석을 위한 유동 지렁이 측정법의 적용

배우세요 Caenorhabditis elegans에서 세균 부하를 정량화하는 기계적 파괴 방법을 96웰 플레이트 형식으로 적용하는 기술입니다. 이 프로토콜은 개별 웜의 장내 세균 이질성을 효율적으로 분석하여 미생물-숙주 상호작용 연구에 활용됩니다.

단일 웜 데이터를 사용하여 예쁜꼬마선충-박테리아 상호작용의 이질성 정량화

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