Name: 이온화 조사에 대한 반응으로 장 상피 재생 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 배우세요 감마선 조사 후 장 상피 재생 과정을 마우스 모델과 계통 추적 기법을 활용하여 연구하는 방법을. 이 프로토콜은 방사선 손상 후 세포 활성화와 증식을 분석하여 대장암 치료의 장기 회복 메커니즘을 이해하는 데 기여합니다.

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저자는 조직 표본 준비에 대한 전문가의 도움을 받은 Stony Brook Cancer Center Histology Research Core와 동물 관리 및 취급에 대한 지원을 제공한 Stony Brook University의 실험실 동물 자원 부서에 감사를 표하고자 합니다. 이 연구는 Agnieszka B. Bialkowska와 Vincent W. Yang 박사에게 수여된 DK052230에 수여된 국립 보건원 DK124342의 보조금으로 지원되었습니다.

저자는 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜은 강력하고 재현 가능한 방사선 손상 모델을 설명합니다. 이를 통해 손상 후 7일 동안 장 상피의 변화를 정확하게 분석할 수 있습니다. 중요하게도, 선택된 시점은 손상의 중요한 단계를 반영하며 장의 뚜렷한 변화(손상, 세포자멸사, 재생 및 정상화 단계)를 특징으로 합니다60. 이 방사선 조사 모델은 확립되고 신중하게 평가되어 방사선 요법을 받는 환자가 경험하는 것을 모방할 수 있는 적절한 손상 징후를 보여줍니다61. 대장 암 및 부인과 암 환자의 절반 이상이 복부 방사선 치료를받습니다 40,62,63. 표적 방사선 요법을 위한 진보된 방법에도 불구하고, 환자들은 건강한 장 조직의 방사선 조사를 경험하며, 이는 여기에 제시된 전신 방사선 조사 모델에서 관찰된 것과 매우 ...

인간의 장 상피는 완전히 평평하게 놓으면 배드민턴 코트의 절반 표면을 덮을 것입니다1. 대신, 인간의 내장 내용물을 분리하는 이 단일 세포층은 일련의 손가락 모양의 돌기, 융모 및 움푹 들어간 곳, 장의 표면적을 최대화하는 선와로 압축됩니다. 상피의 세포는 crypt-villus 축을 따라 분화합니다. 융모는 주로 영양소를 흡수하는 장세포, 점액을 분비하는 잔 세포, 호르몬을 생성하는 장내분비 세포로 구성되며, 선와(crypt)는 주로 디펜신 생성 파네스 세포, 활성 및 예비 줄기 세포, 전구 세포 2,3,4,5로 구성됩니다. 또한, 이들 세포가 밑에 있는 중간엽 구획의 기질 및 면역 세포 및 내강의 미생물군과 갖는 양방향 통신은 장 항상성을 유지하고 손상 후 회복에 중요한 복잡한 상호 작용 네트워크를 생성합니다 6,7,8.
장 상피는 인체에서 가장 빠르게자가 재생되는 조직이며 회전율은 2-6 일 9,10,11입니다. 항상성 동안, 류신이 풍부한 반복 함유 G-단백질 결합 수용체 5(LGR5)의 발현으로 특징지어지는 장 선와(orbit base columnar cells)의 기저부에 있는 활성 줄기 세포는 빠르게 분열하여 다른 모든 장 상피 계통으로 분화하는 전구 세포를 제공합니다. 그러나, 이들의 높은 유사분열 속도 때문에, 활성 줄기 세포 및 이들의 직계 전구체는 감마선 손상에 특히 민감하며, 방사선 조사후 세포자멸사를 겪는다 5,12,13,14. 소실되면 장내 선와(異聓) 내의 예비 줄기세포와 비줄기세포(전구체 및 일부 말기 분화된 세포의 소집단)가 활성화되어 기저음와구획(basal crypt compartment)을 보충하여 융모의 세포군을 재구성하여 장 상피(intestinal epithelium)를 재생시킨다15. 혈통 추적 기술을 사용하여 여러 연구 그룹은 예비 (정지) 줄기 세포가 활성 줄기 세포 13,16,17,18,19,20,21,22의 손실시 재생을 지원할 수 있음을 입증했습니다. 이 세포는 폴리콤 복합 단백질 1 종양 유전자(Bmi1), 마우스 텔로머라제 역전사 효소 유전자(mTert), 홉 호메오박스(Hopx) 및 류신이 풍부한 반복 단백질 1 유전자(Lrig1)의 존재를 특징으로 합니다. 또한, 비 줄기 세포는 손상 23,24,25,26,27,28,29,30,31시 장 선와를 보충 할 수 있음이 밝혀졌습니다. 특히, 분비 세포 및 장 세포의 전구 세포는 손상시 탈분화를 겪고, 줄기 유사 세포로 되돌아 가며, 장 상피의 재생을 지원하는 것으로 나타났다. 최근 연구에서는 손상 시 줄기와 유사한 특성을 획득할 수 있는 능력을 가진 여러 마커(예: DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)를 발현하는 세포를 확인했습니다.32,33,34,35,36. 놀랍게도, Yu et al. 성숙한 파네스 세포(LYZ+)도 장 재생에 기여할 수 있음을 보여주었다37. 또한, 방사선 조사는 장 상피 세포의 세포 사멸을 유발하고 상피 장벽 기능을 방해하는 것 외에도 장내 세균총의 dysbiosis, 면역 세포 활성화 및 전 염증 반응의 시작, 중간 엽 및 기질 세포의 활성화를 초래합니다38,39.
감마선은 암 치료, 특히 결장직장 종양의 경우 귀중한 치료 도구이다40. 그러나 방사선 조사는 세포 손상을 유도하여 장 항상성에 큰 영향을 미치고, 이는 세포 사멸을 유발합니다. 방사선 노출은 환자의 회복을 늦추는 다중 섭동을 유발하며 급성기의 점막 손상 및 염증과 장기간의 설사, 요실금, 출혈 및 복통으로 표시됩니다. 이러한 증상의 파노라마를 위장 방사선 독성이라고 합니다. 또한, 경벽 섬유증 및/또는 혈관 경화증의 방사선 유발 진행은 치료 후 몇 년 후에 나타날 수 있습니다38,41. 손상 자체와 동시에, 방사선은 재생을 시작하고 조율하는 신호 전달 경로를 활성화하는 장 세포에서 복구 반응을 유도합니다42. 방사선 유발 소장 질환은 다른 장기 (예 : 자궁 경부, 전립선, 췌장, 직장)에 제공되는 골반 또는 복부 방사선 요법으로 인해 발생할 수 있습니다 41,43,44,45,46. 따라서 장 방사선 조사 손상은 중요한 임상적 문제이며 결과적인 병태생리학에 대한 더 나은 이해는 방사선 요법과 관련된 위장 합병증을 완화하기 위한 중재의 개발을 진전시킬 가능성이 있습니다. 방사선 외에 장 상피의 재생 목적을 조사할 수 있는 다른 기술이 있습니다. 염증 및 그 후의 재생을 연구하기 위한 형질전환 및 화학적 쥐 모델이 개발되었다47. 덱스트란 황산나트륨(DSS)은 장에서 염증을 유발하고 염증성 장 질환과 유사한 특성을 발달시킨다48. DSS 치료와 발암 성 화합물 인 아족시 메탄 (AOM)의 조합은 대장염 관련 암의 발병을 초래할 수 있습니다48,49. 허혈 재관류 유발 손상은 장 상피의 재생 가능성을 연구하는 데 사용되는 또 다른 방법입니다. 이 기술은 경험과 외과 지식이 필요합니다50. 또한, 앞서 언급 한 기술은 방사선과 다른 유형의 부상을 유발하고 다른 재생 메커니즘의 개입으로 이어질 수 있습니다. 또한 이러한 모델은 시간이 많이 걸리고 방사선 기술은 상당히 간단합니다. 최근, 장 재생의 기전을 연구하기 위해 장과 결장에서 생성된 엔테로이드와 콜로노이드를 방사선 손상과 병용하여 사용하는 시험관 내 방법이 사용되고 있다51,52. 그러나 이러한 기술은 그들이 모델링하는 기관을 완전히 요약하지 않습니다53,54.
제시된 프로토콜에는 타목시펜 치료 후 예비 줄기 세포 집단(Bmi1-CreER; Rosa26eYFP입니다. 이 모델은 12 Gy 전신 방사선 조사를 이용하는데, 이는 예비 줄기 세포를 활성화시키기에 충분히 상당한 장 손상을 유도하는 동시에 손상 후 7일 이내에 장 재생 능력의 후속 조사를 허용한다55.

<table><tbody><tr><td>1mL 주사기</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>309659-16G 재사용 가능한 소형 동물 먹이 바늘: 스트레이트</td><td>VWR</td><td>20068-630-27G</td><td></td></tr> <tr><td>x 1/2" 바늘</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>305109-28G x 1/2" Monoject 1mL 인슐린 주사기</td><td>Covidien</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1188128012-5-Ethynyl-2&prime;-deoxyuridine (EdU)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc284628A</td><td>멸균 DMSO:물(1:4 v/v)에 10mg/mL, 분취 및 -20°C에 보관; C</td></tr><tr><td>아제르 사이언티픽&nbsp; 10% 중성 완충 포르말린</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-213-B6.129X1-GT</td><td></td></tr><tr><td>(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td><td>잭슨 실험실</td><td>균주 #:006148</td><td></td></tr><tr><td>B6; 129-BMI1TM1(CRE/ERT)Mrc/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain #:010531</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 분획 V, 열 충격</td><td>Millipore-Sigma</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 이미징 키트, Invitrogen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10638</td><td>-</td></tr><tr><td>옥수수 기름</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C8267-Decloaking</td><td></td></tr> <tr><td>Chamber</td><td>Biocare Medical</td><td>DC2012-Dimethyl</td><td></td></tr> <tr><td>sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-100</td><td>감광성</td></tr><tr><td>DNase-free proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>C10618H</td> DPBS <td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 닭 AF647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-605-155</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td> Fisher에서 25배 희석 <td> Scientific</td><td>21-031-CV-Eosin</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>S176</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경 Nikon Eclipse 90i 밝고 형광, 대물렌즈: 10X, 20X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount 수성 장착 매체</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>감마 셀 40</td><td>Exactor Best Theratronics Ltd.</td><td>-</td><td>0.759 Gy min-1</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit AF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-545-144</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td><td>Millipore-Sigma</td><td>GHS332</td><td></td></tr><tr><td>HM 325 Rotary Microtome from</td><td>Thermo Scientific Fisher Scientific</td><td>23-900-668</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3569</td><td>희석 1:1000</td></tr><tr><td>과산화수소 용액, ACS, 29-32%, 스펙트럼 케미</td><td>컬 Fisher Scientific</td><td>18-603-252</td><td>-</td></tr><tr><td>현장 세포 사멸 검출 키트, 플루오레세인(로슈)</td><td>밀리포어-시그마</td><td>11684795910</td><td></td></tr><tr><td>액체 차단제 Super PAP PEN, Mini</td><td>Fisher Scientific</td><td>DAI-PAP-S-M</td><td></td></tr><tr><td>탄산리튬(분말/인증 ACS), 피셔 케미컬</td><td>Fisher Scientific</td><td>L119-500</td><td>0.5g/1L dH2O</td></tr><tr><td>Luer-Lok 주사기 멸균, 일회용, 10 mL</td><td>VWR</td><td>89215-218</td><td>-</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Pharmco 제품&nbsp; 에틸 알코올, 200 PROOF</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT 아세트산 ACS 등급</td><td>Capitol Scientific</td><td>AAP-281000ACSCSLT-Rabbit</td><td></td></tr> <tr><td>anti-Ki67</td><td>BioCare Medical</td><td>CRM325</td><td></td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL 장착 매체</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-262</td><td></td></tr><tr><td>과학 산업 인큐베이터-65도에서 슬라이드를 굽는 지니</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-728-103</td><td></td></tr><tr><td>시트르산 나트륨 디하이드레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 해부 키트</td><td>VWR</td><td>25640-002</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 마이크로 슬라이드 [크기: 25 x 75 x 1 mm]</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T5648</td><td>멸균 옥수수 기름에 30 mg/mL, -20°C에서 신선 또는 단기 보관이 바람직합니다. C, 빛에 민감한</td></tr><tr><td>Tissue-Tek 24-Slide 홀더와 탈착 가능한 핸들</td><td>Sakura</td><td>4465</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek&nbsp; 아큐엣지&nbsp; 로우 프로파일 블레이드</td><td>Sakura</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>티슈-텍&nbsp; 수동 슬라이드 염색 세트</td><td>Sakura</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek 염색 접시, 뚜껑이 있는 녹색</td><td>Sakura</td><td>4456</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek 염색 접시, 뚜껑이 있는 흰색</td><td>Sakura</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Unisette 처리 카세트</td><td>VWR</td><td>87002-292-VWR</td><td></td></tr> <tr><td>마이크로 커버 안경</td><td>VWR</td><td>48393-081</td><td></td></tr><tr><td>크실렌</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

이온화 조사에 대한 반응으로 장 상피 재생

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

장 상피는 단일 층의 세포로 구성되어 있지만 장 선와(intestinal crypt)의 바닥에 위치한 장 줄기 세포의 활성 증식에 의해 생성되는 여러 유형의 말기 분화 세포를 포함합니다. 그러나 급성 장 손상이 발생하는 동안 이러한 활성 장 줄기 세포는 세포 사멸을 겪습니다. 감마선 조사는 널리 사용되는 대장암 치료제로, 치료적으로는 효과적이지만 활성 줄기 세포 풀을 고갈시키는 부작용이 있습니다. 실제로 환자들은 방사선 치료를 받는 동안 부분적으로 활성 줄기 세포 고갈로 인해 위장 방사선 증후군을 자주 경험합니다. 장 선와에서 활성 장 줄기 세포의 손실은 일반적으로 정지 상태의 예비 장 줄기 세포 풀을 활성화하고 분비 및 장 세포 전구체 세포의 탈분화를 유도합니다. 이러한 세포가 아니라면 장 상피는 방사선 요법 및 기타 주요 조직 손상으로부터 회복하는 능력이 부족할 것입니다. 계통 추적 기술의 새로운 발전은 재생 중 세포의 활성화, 분화 및 이동을 추적할 수 있게 해주며, 장에서 이를 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 본 연구는 방사선 손상 후 마우스 장 상피 내 세포를 분석하는 방법을 제시하는 것을 목적으로 한다.

쥐의 유전적 혈통 추적과 함께 12Gy 전신 방사선 조사(TBI)를 사용하면 장내 방사선 손상의 결과를 철저히 분석할 수 있습니다. 시작하려면 Bmi1-CreER; Rosa26eYFP 마우스는 Bmi1+ 예비 줄기 세포 집단 내에서 향상된 황색 형광 단백질(EYFP) 발현을 유도하는 단일 타목시펜 주사를 받았습니다. 타목시펜 주사 이틀 후, 마우스는 방사선 조사 또는 가짜 방사선 조사를 받았다. 안락사 3 시간 전에 생쥐에게 EdU를 주사했습니다. 안락사 후, 방사선 조사 후 0시간, 3시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 7일에 분석을 위해 소장 표본을 수집했습니다. 앞서 언급한 시간 경과의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신(H&amp;E) 이미지(그림 1)는 손상에 대한 장 상피 반응을 보여줍니다. 0h 시점은 항상성 장 상피를 예시합니다(그...

위장관은 방사선 치료 암 치료 시 손상에 가장 민감한 기관 중 하나입니다. 그것은 동시에 그러한 모욕에 이어 가장 높은 재생 능력 중 하나를 가진 장기 시스템입니다. 제시된 프로토콜은 장 상피의 재생 능력을 연구하는 효율적인 방법을 설명합니다.

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

감마선 조사는 대장암에 널리 사용되는 치료법입니다. 그리고 치료적으로 효과적이지만 위장관에 부정적인 영향을 미칩니다. 제시된 프로토콜은 방사선 손상 후 재생 동안 세포의 활성화, 분화 및 이동을 연구하는 효율적인 방법을 설명합니다.이 프로토콜은 강력하고 재현 가능한 방사선 손상 모델을 설명합니다. 중요한 것은 이 모델을 통해 손상 후 장 세포의 운명을 추적할 수 있으므로 특정 세포 하위 집단의 재생 능력에 대한 더 나은 이해를 제공할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 뚜렷한 혈통 추적 동물 모델을 사용하여 손상 후 세포의 다양한 하위 집단의 실시간 행동과 상호 작용을 연구할 수 있습니다.이 프로토콜에 대한 약간의 수정은 방사선 손상 시 미생물군과 다른 상피, 기질 및 면역 세포 집단 사이의 관계를 조사할 수 있도록 해야 합니다. 시작하려면 멸균 옥수수 기름에 타목시펜 분말을 마이크로 리터당 30 마이크로 그램의 농도로 재현 탁하십시오. 60 % 진폭으로 30 초 온-오프 사이클에서 3 분 동안 초음파 처리하십시오.실온에서 1시간 동안 어둠 속에서 회전시켜 혼합한다. 그런 다음 EdU 분말에 멸균 DMSO를 첨가하여 EdU를 준비합니다. 총 부피의 1/5을 더하고 멸균 초순수의 나머지 부피를 천천히 첨가하십시오.완전히 용해되면 분취하여 섭씨 20도에서 보관하십시오. 물 70% 에탄올, 섭씨 4도로 냉각된 DPBS, Bouin의 고정 완충액, 10% 완충 포르말린과 같은 조직 수집 및 고정용 시약을 준비합니다. 다음으로, 마우스 해부 키트, 페트리 접시, 10 밀리리터 주사기에 부착 된 16 게이지 위 관법 바늘 및 조직 학적 카세트와 같은 필요한 장비를 준비하십시오.감마선 방사선 조사 노출 이틀 전에, 타목시펜 주사를 위해 실험동물을 준비한다. 각 동물의 무게를 측정하고 필요한 복용량을 계산하십시오. 복부를 70 % 에탄올로 소독하십시오.그런 다음 1밀리리터 주사기에 부착된 27게이지 바늘을 사용하여 단일 용량의 타목시펜을 복강 내 투여하여 Cre 매개 재조합을 유도합니다. 잠재적인 타목시펜 독성을 배제하기 위해 다음 48시간 동안 동물을 관찰합니다. 48 시간 후, 동물을 방사선 조사실로 옮깁니다.감마선 조사기의 샘플 챔버를 70% 에탄올 용액으로 소독합니다. 흡수 매트와 동물을 샘플 챔버 내부에 놓습니다. 뚜껑을 덮고 챔버를 닫습니다.감마선 조사기를 프로그래밍하여 동물을 12개의 회색 전신 조사에 노출시킵니다. 그런 다음 키를 시작 위치로 돌리고 시작을 눌러 노출을 시작합니다. 활성 노출 시간 동안 방을 나가십시오.미리 설정된 시간이 경과하면 기기가 자동으로 멈추고 신호음이 울리기 시작합니다. 키를 정지 위치로 돌려 기계를 끕니다. 샘플 챔버를 열고 뚜껑을 제거합니다.동물을 케이지로 옮기고 샘플 챔버를 70% 에탄올로 소독합니다. 동물을 기존의 주거실로 다시 옮기고 치료 후 상태를 관찰합니다. 매일 동물의 체중을 모니터링하십시오.계획된 안락사 3시간 전에 복부를 소독하고 28게이지 인슐린 주사기를 사용하여 100마이크로리터의 EdU 원액을 마우스에 복강 주사합니다. 동물을 안락사시킨 후, 방사선 조사 후 다른 시점에서 근위 내장을 수집하십시오. 소장의 근위 부분을 해부하고 부착 된 조직을 제거하십시오.10밀리리터 주사기에 부착된 16게이지 직선 공급 바늘을 사용하여 차가운 DPBS로 조직을 세척하고 Bouin의 고정 완충액으로 조직을 고정합니다. 창자를 세로로 자르고 Swiss-roll 기술을 사용하여 근위 장을 굴립니다. 조직을 10% 완충된 포르말린이 있는 용기에 있는 조직학적 카세트에 넣고 실온에서 24-48시간 동안 배양합니다.배양 후 조직학적 카세트를 70% 에탄올로 옮기고 조직을 파라핀에 삽입합니다. 포매 후 조직학적 카세트를 얼음 위에 최소 1시간 동안 놓습니다. 그런 다음 마이크로톰을 사용하여 5미크론 두께의 수평 단면을 자릅니다.조직 절편을 섭씨 45도까지 예열 된 수조로 옮기고 절편을 충전 된 슬라이드에 놓습니다. 슬라이드를 실온에서 밤새 랙에 두어 건조시킵니다. 소장 표본의 헤마톡실린 및 에오신 이미지는 0시간에 항상성 장 상피를 보여주었고, 그 후 세포자멸사 단계 동안 지하실 구획 내의 세포가 손실되었습니다.그 다음에는 증식성이 높은 세포가 선와를 채우는 재생 단계가 이어졌고, 7일째까지 정상화 단계로 이어졌습니다. EYFP에 의한 계통 추적은 항상성 동안 Bmi1 양성 예비 줄기 세포에서 유래 한 세포가 선와 내에서 플러스 4에서 플러스 6 위치로 제한되었음을 보여주었습니다. EdU 및 Ki-67 염색은 가짜 방사선 조사 마우스에서 정상적인 장 항상성을 보여주었으며, 활성 줄기 세포에서 통과 증폭 영역을 통해 확장되었습니다.세포 사멸 단계에서 EYFP 양성 세포의 수가 감소하고 방사선 손상으로 인한 증식 세포의 손실이 동반되었습니다. 재생 단계에서는 예비 줄기 세포의 활성화와 Bmi1 양성 세포의 빠른 증식이 관찰되었습니다. 추가 증식과 이동은 장 상피 무결성을 회복했습니다.TUNEL 염색은 항상성 동안 세포사멸 세포가 존재하지 않는다는 것을 보여주었다. TUNEL 염색의 증가는 세포사멸 단계 후반에 관찰되었다. 재생 단계에서 TUNEL 염색은 재생 크립트 내에서 꾸준히 감소했으며 크립트가 정상화되었을 때 거의 없었습니다.이 기술은 RNA 염기서열 분석, 단일 세포 RNA 염기서열 분석, 형광 활성화 세포 분류 또는 단백질체 분석과 결합하여 손상 후 장 재생 중 특정 세포 계통의 역할에 대한 보다 심층적인 지식을 수집할 수 있습니다. 연구자들은 장 재생에서 미생물군과 상피, 기질 및 면역 세포 집단 간의 상호 작용을 조사하여 장 상피의 재생 능력에 대한 이해를 넓힐 수 있습니다.

intestinal-epithelial-regeneration-in-response-to-ionizing-irradiation

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

인간의 급성 신장 상해 (아키)는 신장 nephrons을 구성하는 상피 세포 손상으로 인한 일반적인 임상 문제, 그리고 아키는 50~70% 1 높은 사망률 속도와 연결되어 있습니다. 이 현상을 안내하는 메커니즘과 한계가 제대로 이해 남아 있지만 상피 세포의 파괴에 따라 nephrons은 재생에 제한 기능이 있습니다. 이 비디오를 문서에서, 우리는 타겟 레이저 zebrafish 배아 신장의 신장 nephron 세포의 박리 또는 pronephros위한 기술을 설명합니다. 새로운 방법은 아키의 nephrotoxicity 유도된 모델을 보완하고 신장 nephron의 상피 조직이 재생된과 관련된 세포 및 분자 변경의 고해상도 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

Zebrafish의 Pronephros의 레이저 절제는 신장 상피 조직이 재생된를 공부

planaria 사이에 정의하고 일관성있는 크기의 조직을 접목을위한 효과적인 방법이 설명되어 있습니다. 또한 이식에 사용되는 고정 기법이 살아있는 동물의 부분 조사를위한 리드 방패와 함께, 적응하는 방법에 대한 설명이 포함되어 있습니다.

Planarian의 부동화, 부분 조사 및 조직 이식

우리는 X 레이 방사선 Caco-2와 주변 혈액 단 세포 (PBMC) 사이 누화를 조사 하는 프로토콜을 제시. 프로토콜은 Caco-2 조사와 PBMC; 공동 문화권의 시작 그 후, 트랜스 상피 전기 저항 48 h 및 서양 오 점 Caco-2에 PBMC 수행을 통해 정기적으로 측정 됩니다.

X-선 사이 누화를 조사 하는 공동 문화 방법을 반구 Caco-2 셀 및 PBMC

여기에서, 우리는 화학요법 유도한 점막염의 모형을 사용하여 소장 상해 및 보상 과증식의 중요한 종점 그리고 증식 마커를 설치하는 프로토콜을 제시합니다. 우리는 세포 주기 특정 마커를 사용하여 작은 장 무게, 토굴 깊이 및 융모 높이를 엔드포인트로 사용하여 증식 세포의 검출을 입증합니다.

화학요법 유도점막염의 마우스 모형을 사용하여 작은 장 상해 그리고 적응을 평가하기 위하여 중요한 종점 및 증식 마커

마우스 유 방 땀 샘에서 개발 된 소기관을 조사 하 고 면역 세포와의 상피 특성과 상호 작용을 평가 하는 것을 특징으로 한다. 조사 된 유기 체는 조사 된 정상 조직에서 종양 세포 모집을 유도할 수 있는 세포-세포 상호작용을 더 잘 평가 하기 위해 사용 될 수 있다.

유 방 땀 샘에서 조사 된 유기 체의 성장과 특성화

3 차원 유기 typic 문화권을 사용 하 여 타 액 선의 형태학 및 기능적인 마커를 시각화 하는 것은 방사선을 따르는 조직 손상의 기계 장치에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에서 설명 하는 프로토콜은 이온화 방사선에 노출 되기 전에 섹션, 문화, 방사선, 얼룩 및 이미지 50-90 μ m 두께의 타 액 선 섹션에 관한 것 이다.

하 악 및 파 타 액 땀 샘에서 유기 유형 배양의 방사선 치료는 생체 내 특성의 핵심

붕소 중성자 포획 요법(BNCT)에 사용되는 중성자 혼합빔에 의해 활성화된 방사선 유도 DNA 손상 반응은 완전히 확립되지 않았다. 이 프로토콜은 중성자 혼합 빔으로 조사 한 후 인간 대장암 세포주에서 면역 형광 염색에 의해 수리 단백질의 방사선 유도 포시 (RIF)를 검출하는 단계별 절차를 제공합니다.

인간 결장 암 세포에 있는 DNA 손상 및 복구 Foci의 면역 형광 화상 진찰

여기에서는 레이저로 인한 상처 시 장의 이미지를 얻는 방법을 제시합니다. 마우스 장을 다광자 레이저에 노출시킴으로써, 단일 또는 다중 crypt(들)의 손실이 국소적으로 유도된다. 수개월에 걸쳐 손상된 부위를 반복적으로 이미징하여 장 회복의 실시간 역학을 캡처합니다.

장 리모델링을 연구하기 위한 레이저 절제 및 생체 내 현미경 검사

우리는 3차원 결장류의 발달을 위한 쥐 결장 선와(miline colonic crypt)의 분리를 자세히 설명하는 프로토콜을 설명합니다. 확립된 콜로노이드는 염증성 챌린지를 받거나 상피 단층을 형성하도록 지시되기 전에 숙주 상피의 세포 구성을 반영하도록 최종적으로 분화될 수 있습니다.

확립된 쥐 콜로노이드에 대한 시험관 내 장 염증의 상피 효과 연구

면역형광 이미징은 복잡하고 시간에 따라 달라지는 생물학적 과정을 단 한 번의 스냅샷으로 관찰할 수 있는 능력에 제약을 받습니다. 이 연구는 정밀하게 절단된 쥐의 턱밑샘 절편에 대해 수행된 실시간 이미징 접근 방식을 간략하게 설명합니다. 이 접근법을 통해 항상성 중 세포-세포 상호 작용과 재생 및 복구 과정을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

Ex vivo Live Cell Imaging을 통한 타액선의 세포 간 상호 작용 조사

배우세요 감마선 조사 후 장 상피 재생 과정을 마우스 모델과 계통 추적 기법을 활용하여 연구하는 방법을. 이 프로토콜은 방사선 손상 후 세포 활성화와 증식을 분석하여 대장암 치료의 장기 회복 메커니즘을 이해하는 데 기여합니다.

이온화 조사에 대한 반응으로 장 상피 재생

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