Name: T 세포의 바이러스 형질도입을 위한 건식 거대다공성 알긴산 스캐폴드의 제조 및 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 배우세요 건식 거대다공성 알긴산 스캐폴드(Drydux)를 이용한 T 세포 바이러스 형질도입법. 이 방법은 기존 RetroNectin 코팅 플레이트 대비 비용 효율적이고 간편하며 85% 이상의 형질도입 효율을 달성합니다.

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이 작업은 보조금 수여 번호 R37-CA260223, R21CA246414를 통해 국립 보건원의 지원을 받았습니다. 유세포분석 분석에 대한 교육 및 지침에 대해 NCSU 유세포분석 코어에 감사드립니다. 회로도는 Biorender.com 사용하여 생성되었습니다.

인간 우선 세포 및 레트로 바이러스 벡터와 관련된 모든 절차는 노스 캐롤라이나 주립 대학의 생물학적 안전 지침에 따라 수행되었으며 환경 보건 및 안전 사무소의 승인을 받았습니다. 인간 말초 혈액 단핵 세포는 상업적 공급원으로부터 버피 코트로서 구입하였다. 1차 인간 세포는 인간 버피 코트 분획에서 분리되어야 하며 생물안전 레벨 2 허가와 상세한 표준 운영 절차 및 작업이 수행될 기관의 승인이 필요합니다. 앞서기술한 바와 같이 제조된 형질도입에 사용된 레트로바이러스 벡터 상청액을 포함한 바이러스 벡터는 코딩된 단백질에 따라 생물안전 레벨 1 또는 생물안전성 레벨 2로 분류될 수 있으며 관련 기관 생물안전 위원회의 승인이 필요합니다.
1. 거대다공성 알긴산 스캐폴드 만들기
<ol><li>비이커에서 칼슘 D 글루코네이트에 멸균 여과된 탈이온수를 첨가하여 0.4%(부피당 중량)의 칼슘 D 글루코네이트의 저장 용액을 준비합니다. 글루콘산칼슘이 녹을 때까지(~1.5시간) 중간 속도로 저어주고 필터를 멸균하고 실온에서 보관합니다. 알림: 용액의 pH를 확인할 필요는 없습니다.</li>
	<li>스크류 캡 바이알 또는 비커에 2 % (부피 당 중량) 알긴산 용액을 준비하십시오. 초순수 알긴산염을 용기에 조심스럽게 첨가하고 멸균 여과된 탈이온수를 알긴산염에 첨가합니다. 혼합을 방해하지 않는 가능한 가장 큰 교반 막대를 선택하고 용기에 추가하십시오. 참고: 이 프로토콜에 사용되는 초순수 알긴산염의 유형에 대한 정보는 재료 표 및 Novamatrix 웹사이트20에서 찾을 수 있습니다. 이들 스캐폴드에 대해 상이한 알긴산염은 스캐폴드 9,10,11의 다공성 및 생체적합성에 바람직하지 않은 변화를 초래할 수 있기 때문에 탐색되지 않았다.</li>
	<li>알긴산염이 녹을 때까지 용액을 고속으로 저어줍니다 (~ 1 시간). 용기 측면에 큰 덩어리가 있으면 용기를 기울여 제거하십시오. 측면에 있는 소량의 알긴산염은 교반하는 동안 용해되며 걱정할 필요가 없습니다. 알림: 용액의 pH를 확인할 필요는 없습니다.</li>
	<li>알긴산이 용해되면 교반 속도를 줄이고 가교 덩어리가 형성되는 것을 방지하기 위해 알긴산 용액에 동일한 부피의 0.4 % 칼슘 D 글루 콘산 염을 천천히 첨가하고 15 분 동안 격렬하게 저어줍니다.</li>
	<li>비커 또는 바이알을 옆으로 기울여 형성되었을 수 있는 덩어리를 제거합니다. 알림: 균질화기를 사용하는 것이 좋습니다. 최종 솔루션은 광학적으로 명확해야합니다.</li>
	<li>원하는 부피의 용액을 48웰 플레이트 또는 24웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅합니다. 48웰 플레이트의 경우 300μL/웰을 사용하고 24웰 플레이트의 경우 1mL/웰을 사용합니다. 천천히 캐스팅하고 팁을 자주 교체하면 용액이 점성이 있고 팁에 달라붙습니다.</li>
	<li>플레이트를 뚜껑으로 덮고 -20 ° C에서 밤새 얼립니다.</li>
	<li>뚜껑을 제거하고 물티슈와 고무 밴드로 상단을 고정하여 동결 건조기 용 플레이트를 준비하십시오. 플레이트를 750 mL 내지 2,000 mL 동결건조기 플라스크에 넣고, 동결건조기 위에 72시간 동안 놓는다.</li>
	<li>72시간 후 동결건조기에서 플레이트를 제거하고 뚜껑을 교체합니다. 플레이트를 밀봉하고 4°C에서 보관합니다. 장기간 보관하려면 4°C에서 보관하기 전에 플레이트를 진공 밀봉하십시오. 필요할 때까지 건조한 상태로 유지하십시오. 알림: 부피 오류로 인해 추가 칼슘-알긴산 용액을 만드십시오(일부는 바이알 벽에 달라붙음, 피펫 팁). 예를 들어, 24 웰 플레이트에 4 개의 스캐 폴드를 만들기 위해서는 4mL의 복합 용액 (알긴산 2mL + 글루 콘산 칼슘 2mL)이 필요하지만 2 % 알긴산 용액 2.5mL와 0.4 % 글루 콘산 칼슘 용액 2.5mL를 준비하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>2. 형질 도입
<ol><li>100kDa 필터를 사용한 바이러스 상청액 농도<ol><li>1x 인산염 완충 식염수(PBS) 1mL로 원심 필터에 2분 동안 수분을 공급합니다. PBS를 폐기합니다.</li>
		<li>2mL의 바이러스 현탁액(1 × 106 TU/mL)을 추가하고 스윙 버킷 로터에서 1,500× g 의 원심 필터를 통해 10분 동안 원심분리하여 바이러스 현탁액을 농축합니다. 참고 : 스캐 폴드 당 1-200 마이크로 리터의 농축 바이러스가 필요합니다.</li>
		<li>농축된 바이러스 현탁액 부피가 200μL보다 큰 경우 몇 분 더 회전합니다.</li>
		<li>각 스캐폴드에 대해 2.1.1-2.1.3단계를 반복합니다. 참고: 많은 양의 바이러스를 농축하고 농축된 재고에서 100-200μL 분취량을 섭취하는 것도 허용됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>활성화 된 세포와 바이러스를 함께 시드합니다.<ol><li>각 스캐폴드에 대해, 50 μL의 완전한 세포 배양 배지(250 mL 클릭 배지 + 250 mL RPMI 1640 배지 + 50 mL 태아 소 혈청 + 5 mL 글루타민 대체물 + 5 mL 페니실린/스트렙토마이신)에 1 × 106 개의 활성화된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 현탁시켜 분취량을 준비합니다. 참고: PBMC를 활성화하는 방법에 대한 프로토콜은 보충 파일 1 을 참조하십시오.</li>
		<li>농축된 바이러스 상청액(~2 × 106 TU, MOI 2)을 세포 현탁액에 추가합니다. 세포-바이러스 현탁액의 총 부피는 48웰 스캐폴드의 경우 200μL, 24웰 스캐폴드의 경우 350μL를 초과해서는 안 됩니다.</li>
		<li>세포-바이러스 혼합물을 건조 스캐폴드의 상단에 적가한다. 음성 대조군 실험의 경우 농축된 바이러스 대신 완전한 세포 배양 배지를 사용합니다. 세포 현탁액을 건조 스캐폴드의 상단에 추가합니다.</li>
		<li>각 스캐폴드에 대해 2.2.1-2.2.3단계를 반복합니다.</li>
		<li>스캐폴드를 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 45-60분 동안 배양합니다. 인큐베이터에서 비계를 제거하십시오. 스캐폴드는 이 시간 동안 용액을 완전히 흡수합니다.</li>
		<li>증식을 유도하려면 IL-15(5ng/mL) 및 IL-7(10ng/mL)이 보충된 완전한 세포 배양 배지를 각 웰에 추가합니다. IL-2도 사용할 수 있습니다. 각 48웰 스캐폴드에 500μL를 추가하거나 각 24웰 스캐폴드에 1mL를 추가합니다.</li>
		<li>스캐폴드를 37°C에서 72시간 동안 배양합니다. 세포가 증식함에 따라 배지가 주황색으로 변합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>분석을 위해 스캐폴드에서 세포를 분리합니다.<ol><li>1x PBS에서 0.5M EDTA를 0.25M EDTA로 희석합니다.</li>
		<li>각 웰에서 여분의 배지를 제거하고 별도의 15mL 원심분리 튜브에 수집합니다.</li>
		<li>스캐폴드로부터 세포를 분리하려면 각 스캐폴드에 0.25M EDTA를 추가합니다. 48웰 스캐폴드에 300μL 또는 24웰 스캐폴드에 1mL를 추가합니다. 접시를 그대로 두거나 3-4분 동안 부드럽게 저어줍니다.</li>
		<li>비계가 대부분 용해되면 피펫을 우물 내부에서 부드럽게 안팎으로 넣습니다. 스캐폴드를 완전히 용해시키기 위해 몇 가지 인앤아웃 피펫팅 단계가 필요할 수 있습니다. 10 분 안에 용해되지 않으면 0.25 M EDTA 200 μL를 더 추가하십시오.</li>
		<li>스캐폴드가 완전히 용해되면 용액을 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>각 스캐폴드에 대해 2.3.4 및 2.3.5단계를 반복합니다.</li>
		<li>각 원심분리 튜브에 12mL PBS를 추가하고 400× g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 두 번 세척합니다. 각 튜브의 바닥에 셀 펠릿이 형성됩니다. 상청액을 흡입하고 세척을 반복하십시오. 모든 EDTA를 제거하는 것이 중요하므로 세척할 때마다 상청액을 완전히 흡입하도록 주의하십시오.</li>
		<li>PBS로 두 번째 세척 후, 세포 펠렛은 이제 분석할 준비가 되었습니다. 분석에 필요한 적절한 프로토콜을 따르십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

P.A. 및 Y.B.는 CAR-T 세포 치료제의 생성을 위한 생체재료의 사용과 관련된 특허에 대한 발명가이다. Y.B.는 CAR-T 세포 치료 기술과 관련된 업계 후원 연구 보조금을 받습니다(이 연구와 관련이 없음). 다른 모든 저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

CAR-T 세포 요법은 연구 및 상업적 응용 분야에서 계속해서 관심을 얻고 있습니다. CAR-T 세포 요법이 혈액 암 치료에 성공했음에도 불구하고 절차의 높은 비용으로 인해 사용이 제한됩니다. 여기에 제시된 프로토콜은 레트로넥틴 코팅 플레이트의 스피노클로케이션 없이 T 세포의 바이러스 유전자 전달을 위한 새로운 방법을 소개합니다. 형질도입을 매개하기 위한 건식 거대다공성 알기네이트 스캐폴드의 제조는 비교적 간단하고, 종래의 방법에 대한 적합한 저비용 대체물이다.
때때로 비계 모양은 그림 2에 표시된 것과 다를 수 있으며 대신 흰색과 푹신한 것이 아니라 투명하고 결정적으로 보일 수 있습니다. 이는 냉동실 도어의 반복적 인 개방으로 인해 -20 ° C에서 일관되지 않은 동결로 인해 발생하거나 냉동 할 플레이트가 냉동실의 부피가 큰 품목 옆이나 위에 놓여 절연 된 경우에 발생할 수 있습니다. 외관의 차이에도 불구하고 우리 실험실은 ...

면역 요법은 종양을 특이적으로 표적으로 삼고, 표적을 벗어난 세포 독성을 제한하고, 재발을 방지하는 능력으로 인해 혁신적인 암 치료 패러다임으로 부상했습니다. 특히, 키메라 항원 수용체 T (CAR-T) 세포 요법은 림프종 및 백혈병 치료에 성공하여 인기를 얻고 있습니다. FDA는 2017 년에 최초의 CAR-T 세포 요법을 승인했으며 그 이후로 4 개의 CAR-T 세포 요법 1,2,3,4,5를 추가로 승인했습니다. CAR은 일반적으로 종양 관련 항원 3,4에 특이적인 단일클론 항체의 단일 쇄 가변 단편으로 구성된 항원 인식 도메인을 갖는다. CAR이 종양 관련 항원과 상호 작용할 때 CAR-T 세포가 활성화되어 사이토카인 방출, 세포용해 탈과립, 전사 인자 발현 및 T 세포 증식을 포함하는 항종양 반응을 일으킵니다. CAR-T 세포를 생산하기 위해 환자로부터 혈액을 수집하여 T 세포를 얻습니다. CAR은 바이러스를 사용하여 환자의 T 세포에 유전적으로 추가됩니다. CAR-T 세포는 시험관 내에서 성장하여 환자 2,3,4,6에 다시 주입됩니다. CAR-T 세포의 성공적인 생성은 CAR-T 세포로 유전적으로 변형된 T 세포의 수를 설명하는 형질도입 효율에 의해 결정됩니다.
현재, CAR-T 세포 생성의 황금 표준은 레트로넥틴-코팅된 플레이트 7,8 상의 활성화된 T 세포 및 바이러스의 스핀코테이션이다. 형질 도입은 바이러스 입자가 T 세포의 표면과 결합 할 때 시작됩니다. Retronectin은 바이러스 입자와 세포 사이의 결합 효율을 증가시켜 바이러스와 세포의 공동 국소화를 촉진하고 형질 도입을 향상시킵니다 7,8. 레트로넥틴은 그 자체로는 잘 작동하지 않으며 바이러스 입자를 농축하고 T 세포의 표면 투과성을 증가시켜 바이러스 감염을 더 쉽게 허용함으로써 유전자 전달을 향상시키는 스피노 큘레이션을 동반해야합니다8. 레트로넥틴 코팅 플레이트에서 스피노클로테이션의 성공에도 불구하고 여러 번의 스핀 주기와 값비싼 시약이 필요한 복잡한 공정입니다. 따라서, 더 빠르고 저렴한 바이러스 유전자 전달을 위한 대체 방법이 매우 바람직하다.
알긴산염은 저렴한 비용, 우수한 안전성 프로파일 및 2가 양이온 9,10,11,12와 혼합시 하이드로 겔을 형성하는 능력으로 인해 생물 의학 산업에서 광범위하게 사용되는 천연 음이온 성 다당류입니다. 알긴산은 GMP 준수 폴리머이며 일반적으로 FDA13에 의해 안전 (GRAS)으로 인정됩니다. 양이온과 알긴산염을 가교하면 상처 치유, 작은 화학 약물 및 단백질의 전달, 세포 수송 9,10,11,12,14,15,16에 자주 사용되는 안정적인 하이드로겔이 생성됩니다. 우수한 겔화 특성으로 인해 알긴산염은동결 건조 10,17에 의해 다공성 스캐폴드를 생성하는 데 선호되는 물질입니다. 알긴산염의 이러한 특성은 활성화된 세포의 바이러스 유전자 전달을 매개할 수 있는 스캐폴드를 생산하기 위한 매력적인 후보가 된다.
여기에 설명된 것은 바이러스 유전자 전달에 의해 T 세포를 정적으로 형질도입하는 Drydux 스캐폴드로 알려진 건식 거대다공성 알기네이트 스캐폴드를 제조하기 위한 프로토콜이다(17,18). 이러한 스캐폴드를 만드는 과정은 그림 1에 나와 있습니다. 이러한 스캐폴드는 레트로넥틴 코팅 플레이트의 스핀코클로케이션의 필요성을 제거합니다. 거대다공성 알기네이트 스캐폴드는 바이러스 입자와 T 세포의 상호작용을 촉진하여 조작된 T 세포(17)의 기능 및 생존성에 영향을 미치지 않으면서 단일 단계에서 효율적인 유전자 전달을 가능하게 한다. 올바르게 추적하면 이러한 거대 다공성 알지네이트 스캐폴드는 80% 이상의 형질도입 효율을 가지며, 이는 바이러스 형질도입 공정을 단순화하고 단축시킨다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg"> 그림 1: 프로토콜의 개략도 및 타임라인. (a) 건식 거대 다공성 알긴산 스캐폴드를 제조하기 위한 타임라인. 알긴산염은 칼슘 -D- 글루코 네이트와 가교되어 밤새 동결됩니다. 동결된 스캐폴드는 72시간 동안 동결건조되어 Drydux 스캐폴드를 생성합니다. (B) 활성화된 세포의 바이러스 형질도입을 위한 타임라인. 활성화된 세포 및 바이러스 (MOI2)를 스캐폴드 상부에 시딩하고, IL-7 및 IL-15가 보충된 완전한 배지에서 인큐베이션한다. 스캐폴드는 혼합물을 흡수하고 바이러스 유전자 전달을 촉진합니다. EDTA는 스캐폴드를 용해시키고 형질도입된 세포를 분리하는데 사용된다. PBS로 2회 세척한 후, 세포 펠렛을 분석에 사용할 수 있다. 약어: PBS = 인산염 완충 식염수; PBMC = 말초 혈액 단핵 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>UltraPure, pH 8.0</td></tr><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>염화칼슘 또는 염화마그네슘 없음</td></tr><tr>Methylene Blue <td>Stemcell Technologies Inc</td><td>07060</td><td></td>활성 주위 혈액 단핵 세포<td>를 사용한 3% 아세트산</td></tr> - <tr><td></td><td></td><td></td><td>신선 또는 냉동</td></tr><tr><td>칼슘 -D- 글루 코네이</td>트 <td>Alfa Aesar</td><td>A11649</td><td></td></tr><tr><td>CD28.2 항체</td><td>BD</td><td>555725</td><td>1 mg/mL</td></tr><tr><td>CD3 항체</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-387</td><td>100 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>클릭의 매체</td><td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td><td>9195</td><td></td></tr><tr><td>DI Water</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS</td><td>Cytvia</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 매체</td><td>Cytvia</td><td>SH3009601</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>말초 혈액 단핵 세포</td><td>-</td><td>-</td><td>신선 또는 냉동</td></tr><tr><td>PRONOVA UP MVG</td><td>NovaMatrix</td><td>4200101</td><td>알긴산 나트륨</td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-7</td><td>Peprotech</td><td>200-07</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>레트로바이러스</td><td>-</td><td>-</td><td>1 x 106 TU/ 밀리리터</td></tr></tbody></table>

t 세포의 바이러스 형질도입을 위한 건식 거대다공성 알긴산 스캐폴드의 제조 및 사용

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

CAR-T 세포 치료를 위한 T 세포의 유전 공학은 지난 몇 년 동안 암 치료의 최전선에 왔습니다. CAR-T 세포는 T 세포로의 바이러스 유전자 전달에 의해 생성됩니다. 바이러스 유전자 전달의 현재 황금 표준은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 레트로넥틴 코팅 플레이트의 스피노클로테이션을 포함합니다. CAR-T 세포를 생성하기 위한 효율적이고 비용 효율적인 방법에 대한 상당한 요구가 존재한다. 여기에 설명된 것은 활성화된 T 세포의 바이러스 형질도입을 효율적으로 촉진하는 Drydux 스캐폴드로 알려진 저렴하고 건조한 거대 다공성 알기네이트 스캐폴드를 제조하는 방법입니다. 스캐폴드는 바이러스가 파종된 레트로넥틴 코팅 플레이트의 금 표준 스피노큘레이션 대신 사용하도록 설계되었으며 세포 형질도입 공정을 단순화합니다. 알긴산염은 칼슘 -D- 글루코 네이트와 가교 결합되고 밤새 동결되어 스캐 폴드를 만듭니다. 동결된 스캐폴드는 동결건조기에서 72시간 동안 동결건조되어 건조 거대다공성 스캐폴드의 형성을 완료한다. 스캐폴드는 바이러스 및 활성화된 T 세포가 유전자 변형 세포를 생성하기 위해 스캐폴드 위에 함께 파종될 때 바이러스 유전자 전달을 매개합니다. 스캐폴드는 >85%의 1차 T 세포 형질도입을 생성하며, 이는 레트로넥틴-코팅된 플레이트에서 스피노클로테이션의 형질도입 효율과 유사하다. 이러한 결과는 건식 거대다공성 알긴산 스캐폴드가 종래의 형질도입 방법에 비해 더 저렴하고 편리한 대안으로서 작용한다는 것을 입증한다.

이러한 거대 다공성 알긴산 스캐폴드는 만들기 쉽고 동결건조기에서 다공성, 푹신한 흰색 디스크로 나와야 합니다. 이 실험에서 연구되지는 않았지만, 칼슘-알긴산 용액은 사용자 9,10의 필요에 따라 다양한 형상의 스캐폴드를 생성하기 위해 상이한 주형으로 주조될 수 있다. 비계는 정전기이며 웰 플레이트의 뚜껑이나 장갑을 낀 손가락에 달라붙을 수 있습니다. 그림 2는 완료 시 스캐폴드의 모양을 보여 줍니다. 24웰 및 48웰 스캐폴드의 대략적인 치수도 그림에 나와 있습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig02.jpg"> 그림 2</...

본원은 CAR-T 세포 치료를 위한 T 세포를 포함하는 T 세포의 유전공학에 사용하기 위한 효율적인 바이러스 유전자 전달을 매개하는 건식 거대다공성 알기네이트 스캐폴드를 생성하기 위한 프로토콜이다. 스캐폴드는 활성화된 1차 T 세포를 >85% 형질도입으로 형질도입하는 것으로 나타났다.

T 세포의 바이러스 형질도입을 위한 건식 거대다공성 알긴산 스캐폴드의 제조 및 사용

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

이 비디오에는 활성화된 T 세포의 형질도입을 효율적으로 촉진하는 Drydux로 알려진 건식 거대다공성 알긴산 스캐폴드를 만들고 사용하기 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. Drydux는 바이러스가 파종된 RetroNectin 코팅 플레이트의 금 표준 시분획 대신 사용하도록 설계되었으며 세포 형질도입 공정을 단순화합니다. Drydux는 RetroNectin 코팅 플레이트의 스피노 클로케이션에 필적하는 형질 도입 효율을 가지며 기존 형질 도입 방법에 대한 저렴하고 편리한 대안으로 사용됩니다.먼저 칼슘 -D- 글루 콘산 염의 0.4 % 용액을 준비하십시오. 멸균 여과된 DI 물을 비커의 칼슘-D-글루콘산염에 추가합니다. 칼슘 -D- 글루 콘산염이 녹을 때까지 중간 속도로 저어 주며 약 1 1/2 시간이 걸립니다.일단 용해되면, 칼슘 -D- 글루 콘산 용액을 멸균 여과한다. 이 용액은 실온에서 보관할 수 있습니다. 다음으로 2 % 알긴산 용액을 준비하십시오.이것은 스크류 캡 바이알 또는 비커를 사용하여 수행할 수 있습니다. 둘 다 여기에 표시됩니다. 조심스럽게 초순수 알긴산을 용기에 첨가하십시오.알긴산염에 적절한 양의 DI 물을 첨가하십시오. 혼합을 방해하지 않는 가능한 가장 큰 교반 막대를 선택하고 용기에 추가하십시오. 알긴산염이 녹을 때까지 용액을 센 불에서 저어주면 약 1 시간이 걸립니다.용기 측면에 큰 알긴산 덩어리가 있으면 용기를 옆으로 기울여 제거합니다. 작은 덩어리는 한 시간 동안 녹을 것이며 걱정할 필요가 없습니다. 2 % 알긴산 용액이 용해되면 교반 속도를 줄입니다.알긴산 용액에 같은 부피의 칼슘 -D- 글루 콘산 용액을 천천히 첨가하십시오. 천천히 추가하면 가교 덩어리가 형성되는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 칼슘-글루콘산염 용액을 첨가하면 교반 속도를 높이고 15분 동안 격렬하게 저어줍니다.용기를 옆으로 기울여 형성되었을 수 있는 덩어리를 제거합니다. 15분 동안 격렬하게 저어준 후 용액에 덩어리가 없는지 확인합니다. 용액을 48웰 또는 24웰 플레이트에 피펫팅합니다.48웰 플레이트의 경우 각 웰에 300마이크로리터를 피펫팅합니다. 용액이 점성이 있고 팁에 달라붙을 수 있으므로 천천히 캐스팅하고 팁을 자주 교체하십시오. 24웰 플레이트의 경우 각 웰에 1밀리리터를 피펫팅합니다.다시 천천히 캐스팅하고 피펫 팁을 자주 교체하십시오. 웰 플레이트를 뚜껑으로 덮고 섭씨 영하 20도에서 밤새 얼립니다. 뚜껑을 제거하고 물티슈와 고무 밴드로 상단을 고정하여 동결 건조기 용 플레이트를 준비하십시오.플레이트를 동결 건조기 튜브에 넣고 72 시간 동안 동결 건조기에 올려 놓습니다. 72시간 후, 플레이트를 동결건조기로부터 제거한다. 이제 비계는 형질 도입에 사용할 준비가되었습니다.비계를 즉시 사용하지 않을 경우 Parafilm으로 플레이트를 밀봉하고 필요할 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. 장기간 보관하려면 Parafilm으로 밀봉하는 것 외에도 플레이트를 진공 밀봉하는 것이 좋습니다. 1, 500g의 원심 분리 필터를 통해 2 밀리리터의 바이러스 용액을 10 분 동안 원심 분리하여 바이러스 상청액을 농축시킨다.스캐폴드 당 100 내지 200 마이크로리터의 농축된 바이러스가 필요하다. 농축된 바이러스 용액 부피가 200마이크로리터보다 큰 경우 몇 분 더 회전합니다. 각 스캐폴드에 대해 50마이크로리터의 완전한 세포 배양 배지에 현탁된 100만 개의 활성화된 T 세포의 분취량을 만듭니다.농축된 바이러스를 세포 현탁액에 추가합니다. 세포 바이러스 현탁액의 총 부피는 48-웰 스캐폴드의 경우 200 마이크로리터, 또는 24-웰 스캐폴드의 경우 350 마이크로리터를 초과해서는 안 된다. 세포 바이러스 혼합물을 건조 스캐폴드의 상단에 적가합니다.음성 대조군 실험의 경우 농축된 바이러스 대신 완전한 세포 배양 배지를 사용합니다. 이 세포 현탁액을 건조 스캐폴드의 상단에 추가합니다. 스캐폴드를 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에서 45 내지 60분 동안 배양한다.인큐베이터에서 비계를 제거하십시오. 스캐폴드는 이 시간 동안 용액을 완전히 흡수해야 합니다. 증식을 유도하려면 IL-7 및 IL-15가 보충된 완전한 세포 배양 배지를 각 웰에 추가합니다.IL-2도 사용할 수 있습니다. 24 웰 스캐 폴드의 경우 1 밀리리터를 추가하십시오. 48 웰 스캐 폴드의 경우 500 마이크로 리터를 추가하십시오.섭씨 37도에서 72 시간 동안 배양하십시오. 세포는 72 시간 동안 증식하여 배지를 주황색으로 바꿀 수 있습니다. 각 웰에서 여분의 미디어를 제거하십시오.스캐폴드에서 세포를 분리하려면 각 스캐폴드에 0.25몰 EDTA 용액을 추가합니다. 24웰 스캐폴드의 경우 1밀리리터, 48웰 스캐폴드의 경우 300마이크로리터를 추가합니다. 접시를 그대로 두거나 3-4 분 동안 부드럽게 저어줍니다.대부분 용해되면 피펫을 우물 내부에서 부드럽게 안팎으로 넣습니다. 스캐폴드를 완전히 용해시키기 위해 몇 가지 안팎 피펫팅 단계가 필요할 수 있습니다. 용액을 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮깁니다.세포를 PBS로 두 번 세척한다. 각 원심 분리기 튜브에 12 밀리리터의 PBS를 추가하십시오. 400g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.튜브 바닥에 세포 펠릿이 형성됩니다. 상청액 용액을 흡인하고 세척을 반복하십시오. 모든 EDTA를 제거하는 것이 중요하므로 세척할 때마다 상층액을 완전히 제거하도록 주의하십시오.PBS로 두 번째로 세척한 후, 세포 펠렛은 분석을 위해 준비된다. 각 그룹의 형질도입 효율을 결정하기 위해 유세포분석을 사용하였다. 형질도입되지 않은 세포는 음성 대조군으로서 사용되었고, 형질도입을 나타내지 않았다.GFP 레트로바이러스가 없는 스캐폴드에 시딩된 세포도 형질도입을 나타내지 않았다. 건조 거대 다공성 알긴산 스캐폴드에 세포를 시딩한 활성화된 Drydux 그룹은 RetroNectin 그룹보다 약간 낮은 85%의 형질도입을 보였습니다. 이러한 결과는 Drydux 스캐폴드가 RetroNectin 코팅 플레이트의 시스핀코레이션 없이 레트로바이러스 유전자 전달에 의해 세포를 효과적으로 형질도입했음을 보여줍니다.Drydux 스캐폴드는 RetroNectin에 필적하는 높은 형질도입 효율을 나타내어 T 세포 형질도입을 위한 대체 방법을 제공합니다. Drydux 스캐폴드 제조 비용이 저렴하기 때문에 이 공정은 CAR T 세포 치료 비용을 크게 낮출 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

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마이크로젤 로드의 상호 연결된 거대 다공성 3D 스캐폴드

배우세요 건식 거대다공성 알긴산 스캐폴드(Drydux)를 이용한 T 세포 바이러스 형질도입법. 이 방법은 기존 RetroNectin 코팅 플레이트 대비 비용 효율적이고 간편하며 85% 이상의 형질도입 효율을 달성합니다.

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