Name: 새로운 항생제 테스트를 위한 새로운 고처리량 생체 외 난소 피부 상처 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 학습하세요 Staphylococcus aureus 감염된 양 피부 상처 모델을 이용한 새로운 항생제 효능 평가 방법입니다. 이 생체 외 모델은 전임상 단계에서 신속하고 재현 가능한 결과를 제공하며 동물 실험 의존도를 줄입니다.

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저자는 자금 지원에 대해 EPSRC(EP/R513313/1)에 감사드립니다. 저자는 또한 체스터필드 칼로우에 있는 R.B Elliot과 Son Abattoir에게 어린 양의 머리를 제공하고 프로젝트 초기 단계에서 매우 수용적인 것에 대해 감사하고, 이 프로토콜의 개발 전반에 걸쳐 그녀의 지원에 대해 Kasia Emery, 조직학 샘플을 처리하고 이 프로젝트 전반에 걸쳐 매우 도움이 된 셰필드 대학의 감염, 면역 및 심혈관 질환 부서의 Fiona Wright에게 감사드립니다.

R.B Elliott와 Son Abattoir의 어린 양 머리는 이 프로젝트에서 피부 샘플의 소스로 사용되었습니다. 모든 어린 양은 음식으로 소비하기 위해 도살되었습니다. 머리를 버리는 대신 연구를 위해 용도가 변경되었습니다. 조직이 도축장에서 버려진 폐기물에서 공급되었기 때문에 윤리 승인이 필요하지 않았습니다.
1. 살균
<ol><li>머리를 모으기 전에 깨끗한 집게를 취하고 200 ° C의 오븐에서 1 시간 동안 건열 살균을 수행하여 집게를 소독하십시오. 사용하기 전에 모든 유리 제품을 121 ° C에서 15 분 동안 오토 클레이브하십시오.</li>
	<li>미생물학 클래스 2 캐비닛 내에서 설명 된 모든 작업을 수행하십시오. 제조업체의 지침에 따라 모든 시약을 준비하십시오.</li>
</ol>2. 샘플 수집
<ol><li>도살장에서 Swaledale 양들은 전기나 포로 볼트 권총을 사용하여 기절시켜 도살하고 멸종되었습니다. 도축 후 4 시간 이내에 양고기 머리를 수집하십시오.</li>
</ol>3. 머리 준비
<ol><li>시료 부위에 약 100mL의 이산화염소 용액 200mL를 부어 양고기의 이마 부분을 소독합니다. 전기 클리퍼를 사용하여 머리의 이마 부분을 면도하고 200ppm 이산화 염소 용액 200mL로 해당 부위를 씻습니다.</li>
	<li>에탄올과 블루 롤로 해당 부위를 닦고 샘플 부위를 제모 크림으로 35분 동안 덮습니다. 긁는 도구를 사용하여 제모 크림을 부드럽게 긁어내고 샘플 영역을 평가합니다. 상당한 양의 머리카락이 남아 있으면 제모 과정을 반복하십시오.</li>
	<li>이산화염소 용액 200mL를 추가로 사용하여 해당 부위를 헹군 다음 에탄올로 헹구고 파란색 롤로 닦습니다.</li>
	<li>멸균 된 8mm 생검 펀치를 사용하여 준비된 영역에서 8mm 피부 샘플을 잘라냅니다. 멸균 집게와 15 날 메스를 사용하여 샘플을 제거하여 모든 피부 지방이 제거되도록합니다.</li>
	<li>멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 채워진 멸균 0.5L 병에 샘플을 넣은 다음 200ppm 이산화염소 용액 50mL가 포함된 멸균 50mL 튜브로 옮기고 두 번 뒤집은 다음 30분 동안 멸균되도록 둡니다.</li>
	<li>이산화염소 용액에서 샘플을 제거하고 40mL의 멸균 PBS로 채워진 50mL 튜브에 넣어 세척합니다. 세척이 완료되면 각 개별 피부 샘플을 24웰 플레이트의 별도의 웰에 놓습니다.</li>
	<li>공기-액체 계면에서 샘플을 유지하면서 예열된 배지 350μL를 추가합니다. 배지의 조성은 다음과 같습니다 : MK 배지 (행크스 염, L- 글루타메이트 및 1.75 mg / mL 중탄산 나트륨이 포함 된 배지 199) 및 햄의 F12는 FBS (10 % v / v), EGF (10 ng / mL), 인슐린 (5 μg / mL), 페니실린-스트렙토 마이신 (100 U / mL) 및 암포 테리 신 B (2.5 μg / mL)가 첨가 된 1 : 1 비율입니다.</li>
	<li>24웰 플레이트를 가스 투과성 플레이트 씰로 밀봉하고 가습된 5%CO2 조직 인큐베이터에서 최대 24시간 동안 37°C에서 배양합니다.</li>
</ol>4. 피부 샘플의 유지 관리
<ol><li>배양 후, 배양 배지를 제거하고, 샘플을 500 μL의 멸균 PBS로 헹구었다. 각 샘플에 무항생제 배지를 추가하고 가습된 5%CO2 조직 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 배양하여 샘플의 잔류 항생제를 제거합니다.</li>
	<li>24 시간 후에 항생제가없는 배지에서 탁도 또는 곰팡이 감염이 발생하면 샘플을 폐기하십시오.</li>
</ol>5. 접종물의 제조
<ol><li>멸균 트립신 콩 브로스 10mL가 포함된 50mL 튜브를 준비합니다. S. aureus 의 신선한 한천 접시를 가지고 면봉을 사용하여 여러 식민지를 국물에 옮깁니다. 150 rpm에서 37°C에서 18시간 동안 배양한다.</li>
	<li>4,000 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 멸균 PBS 10mL에 재현탁시킨다. 세포를 적절하게 세척하기 위해 두 번 반복하십시오.</li>
	<li>접종물을 멸균 PBS에서 0.6OD600 으로 조정한다. 수동 실행 가능한 플레이트 수를 수행하여 접종 부하를 확인합니다.</li>
</ol>6. 피부 샘플의 감염
<ol><li>400μL의 사전 예열된 무항생제 배지로 새로운 24웰 플레이트를 준비하고 멸균 집게를 사용하여 24웰 인서트를 추가합니다.</li>
	<li>피부 샘플로부터 배지를 제거하고, 500 μL의 멸균 PBS로 세척하고, 세척물을 제거한다. 멸균 집게를 사용하여 샘플을 우물 바닥에 부드럽게 고정하십시오.</li>
	<li>4mm 펀치 생검을 사용하여 중앙 상처 플랩을 만들고 1-2mm의 거친 깊이까지 관통합니다. 그런 다음 15날 메스와 멸균 톱니 앨리스 조직 집게를 사용하여 상처 플랩의 최상층을 제거합니다. 상처 치수의 가변성은 감염 및 종점 콜로니 형성 단위(CFU)의 결과에 영향을 미칠 수 있다.</li>
	<li>모든 샘플이 감겨지면 멸균 집게를 사용하여 24웰 인서트로 옮깁니다. 15 μL의 박테리아 접종물을 상처 베드에 피펫팅합니다. 이어서, 가습된 5%CO2 조직 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>더 긴 잠복기가 필요한 경우 배지를 제거하고 24시간마다 새 배지로 교체하고 동일한 조건에서 배양합니다.</li>
</ol>7. 박테리아 부하의 결정
<ol><li>우물 바닥에서 미디어를 제거하십시오. 멸균 집게를 사용하여 각 샘플을 멸균 PBS 1mL로 채워진 별도의 50mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>미세한 팁 균질화를 사용하여 샘플 표면을 균질화하십시오. 상처 베드가 균질화기의 팁과 직접 접촉하도록주의하십시오.</li>
	<li>중간/높음에서 35초 동안 각 샘플을 균질화합니다. 균질화기는 박테리아 부하의 열거를 허용하기 위해 상처 베드의 표면에서 박테리아를 분리합니다.</li>
	<li>모든 샘플이 처리되면 피펫팅 전에 각 샘플을 차례로 와동시킵니다. 이것은 박테리아 균질액이 혼합되도록 하기 위한 것입니다.</li>
	<li>20 μL의 볼텍싱된 균질액을 180 μL의 멸균 PBS를 함유하는 96-웰 플레이트의 상응하는 웰 내로 피펫팅한다.</li>
	<li>각 샘플 균질액을 1 x 10-7 로 연속 희석하고 희석된 균질액 10 μL를 트립신 대두 한천 플레이트에 3배로 피펫팅합니다.</li>
	<li>한천 플레이트를 37°C에서 18시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 콜로니 수를 계산하여 각 샘플에 대한 CFU를 결정합니다.</li>
</ol>

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<li>Olkowska, E., Gržinić, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+models+for+dermal+exposure+assessment+of+phthalates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Skin models for dermal exposure assessment of phthalates.</a> Chemosphere. 295, 133909(2022).</li>
<li>Couto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+proteomics+and+substrate-based+mass+spectrometry+imaging+of+xenobiotic+metabolizing+enzymes+in+ex+vivo+human+skin+and+a+human+living+skin+equivalent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model.</a> Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).</li>
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항균제 개발은 중요하지만 비용이 많이 드는 벤처로 약 10억 달러의 비용이 들고 완료하는 데 약 15년이 걸릴 것으로 추정됩니다. 항균제 발견 및 항균제 효능에 대한 전임상 연구의 90% 이상이 학술 연구자 및일반적으로 직원이 50명 미만인 중소기업에 의해 수행됩니다22. 이 팀은 재정적으로 매우 제한되어 있어 번역 연구의 후기 단계에서 납 분자의 실패를 재앙으로 만듭니다. 항생제 내성의 증가는 새로운 항균제의 개발을 앞지르고 있으며, 이는 항균 연구에 대한 이미 제한된 투자를 책임감 있게 관리해야 할 필요성을 더욱 강화합니다.23.
생체 내 및 시험관 내 실험실 배양 간의 박테리아 생리학의 불균형은 리드 식별 단계에서 히트의 항균 효능을 과대 평가하는 경향이 있습니다. 이러한 과대 평가는 번역의 후속 단계에서 볼 수 있는 높은 이직률에 기여합니다. 생체 ...

피부 감염은 전 세계적으로 중요한 문제이며 전 세계 의료 서비스 제공자에게 막대한 경제적 비용이 발생합니다. 병원균에 의한 다제 내성 및 생물막 형성의 발달은 치유되지 않는 상처 1,2,3,4의 유병률에 중요한 역할을합니다. 그 결과, 피부 및 연조직 감염은 장기 입원 및 후속재입원의 가장 일반적인 이유 중 하나입니다5. 상처 치유의 지연은 환자와 의료 제공자 모두에게 비용이 많이 들며, 일부 추정치는 미국에서 매년 약 650 만 명의 환자가 영향을 받는다고 제안합니다. 영국에서는 피부 감염 및 관련 합병증으로 인해 매년 약 75,000 명이 사망합니다 2,4,6.
황색포도상구균(S. aureus)은 환자의 상처 2,7에서 자주 분리되는 강력한 상처 병원체입니다. 다제 내성의 출현률은 2000 년대에 급격히 증가했습니다. 이 기간 동안 급성 세균성 피부 및 피부 구조 감염의 약 60%가 메티실린 내성 S. 아우레우스1에 대해 배양 양성이었습니다. 지난 2 년 동안 포도상 구균 및 실제로 다른 병원균 중 다제 내성 균주의 수가 증가함에 따라 내성을 극복 할 수있는 새로운 작용 방식을 가진 항생제의 신속한 개발이 시급히 필요함을 나타냅니다.
그러나 2000년대 초반부터 항생제 발견 프로그램은 개발 시간이 길어지고 성공률이 낮아져 미국에서 임상 시험에 진입한 새로운 항생제의 17%만이시장 승인을 획득했습니다8. 이는 신종 항생제의 시험관 내 테스트 결과와 임상 결과 간의 차이를 시사합니다. 이러한 불균형은 주로 생체 내 감염 중 및 시험관 내 전임상 단계에서 항생제의 효능을 테스트 할 때 기존의 미생물 학적 방법 동안 박테리아 생리학의 차이 때문이라고 주장 할 수 있습니다. 따라서 항생제 발견 프로그램의 성공률을 높이기 위해 감염 중 박테리아 생리학을보다 잘 대표하는 새로운 실험실 방법이 필요합니다.
피부 감염을 연구하기 위한 현재의 방법은 살아있는 동물(예를 들어, 마우스), 생체외 피부 모델(예를 들어, 돼지), 및 3D 조직-조작된 피부 모델(예를 들어, 인간)에 대한 연구를 포함한다9,10,11,12. 살아있는 동물에 대한 연구는 엄격하게 규제되며 처리량이 상대적으로 낮습니다. 동물 모델에서 상처와 감염은 동물에게 심각한 고통을 유발하고 윤리적 문제를 제기합니다. 생체 외 또는 조직 공학적 인간 피부 모델은 윤리적 승인, 지역 및 글로벌 법률 (인체 조직법, 헬싱키 선언) 준수가 필요하며 조직 획득에 어려움이 있으며 일부 요청은13,14를 이행하는 데 수년이 걸립니다. 두 모델 유형 모두 노동 집약적이며 실험적 성공을 보장하기 위해 상당한 전문 지식이 필요합니다. 일부 현재의 생체 외 피부 감염 모델은 감염을 가능하게 하기 위해 상처 베드에 사전 접종된 디스크와 첨가제가 필요합니다. 이러한 모델은 매우 유용하지만 첨가제가 영양 공급원으로서 상처 침대의 활용을 제한하기 때문에 감염 과정에 한계가 있습니다10,15,16,17. 이 연구에서 설명된 모델은 상처 베드에 첨가제를 사용하지 않으므로 감염 병리 및 생존 가능한 세포 수가 상처 베드를 유일한 영양 공급원으로 직접 활용한 결과입니다.
새로운 실험실 방법의 필요성을 감안할 때, 새로운 항생제의 효능을 평가하는 데 사용하기 위한 피부 감염의 새로운 고처리량 생체 외 난소 모델이 개발되었습니다. 피부 감염 연구는 높은 비용, 윤리적 문제 및 전체 그림을 보여주지 않는 모델20,21과 같은 많은 문제에 직면해 있습니다. 생체 외 모델과 3D 체외이식편 모델을 사용하면 질병 과정을 더 잘 시각화할 수 있으며 치료가 임상적으로 더 관련성이 높은 모델에서 미칠 수 있는 영향을 확인할 수 있습니다. 여기에서, 신규한 양 피부 모델의 설정이 설명되며, 이는 간단하고 재현 가능하며 임상적으로 관련이 있고 높은 처리량을 갖는다. 난소 피부는 생체내에서 감염에 대한 반응을 모델링하기 위해 일반적으로 사용되는 대형 포유동물 중 하나인 양으로 선택되었다. 또한 도축장에서 쉽게 구할 수 있어 연구를 위한 피부를 안정적으로 공급할 수 있으며 시체에 화상이 없어 좋은 조직 품질을 보장합니다. 이 연구는 S. 아우 레 우스를 모범 병원체로 사용했습니다. 그러나이 모델은 다른 미생물과 잘 작동합니다.

<table><tbody><tr><td>24 웰 컴패니언 플레이트</td><td>SLS&nbsp;</td><td></td><td></td>353504</tr><tr><td>4mm 생검 펀치</td><td>윌리엄스 메디컬</td><td>D7484</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10788561</tr><tr><td>8mm 생검 펀치</td><td>윌리엄스 메디컬</td><td>D7488</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신 B 솔루션, 멸균</td><td>시그마&nbsp;</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>컬러 프로 스타일 무선 이발기</td><td>Wahl</td><td>9639-2117X</td><td>이발기</td></tr><tr><td>듀얼 오븐 인큐베이터</td><td>SLS</td><td>OVe1020</td><td>살균 오븐</td></tr><tr><td>표피 성장 인자&nbsp;</td><td>SLS</td><td>E5036-200UG</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Honeywell</td><td>458600-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>F12 HAM</td><td>시그마</td><td>N4888</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청&nbsp;</td><td>Labtech International</td><td>CA-115/500</td><td></td></tr><tr><td>펜치</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>15307805</td><td></td></tr><tr><td>제모 크림</td><td>Veet</td><td>적용되지</td><td></td>않음</tr><tr><td>Heracell VIOS 160i</td><td>Thermo Scientific</td><td>15373212&nbsp;</td><td>조직 배양 인큐베이터</td></tr><tr><td>헤레우스 메가푸지 16R</td><td>VWR</td><td>521-2242</td><td>원심분리기</td></tr><tr><td>균질화기 220, 휴대용</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>15575809</td><td></td></tr><tr><td>균질화기 220, 플라스틱 블렌딩 콘</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td></td><td></td>15585819</tr><tr><td>삽입 개별 24 웰 0.4um 멤브레인</td><td>VWR International</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>인슐린, 재조합 인간</td><td>SLS</td><td>91077C-1G</td><td></td></tr><tr><td>매체 199 (MK 매체)</td><td>시그마</td><td>M0393</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 플레이트, 세포 배양 Costar 96 웰</td><td>Fisher Scientific</td><td>10687551</td><td></td></tr><tr><td>Multitron</td><td>Infors</td><td>해당 사항</td> 없음<td>박테리아 인큐베이터</td></tr><tr><td>PBS 정제</td><td>시그마&nbsp;</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>SLS&nbsp;</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 씰</td><td>Fisher Scientific</td><td>ESI-B-100</td><td></td></tr><tr><td>Safe 2020</td><td>Fisher Scientific</td><td>1284804</td><td>Class II 미생물학 안전 캐비닛</td></tr><tr><td>메스 블레이드 번호 15</td><td>Fisher Scientific</td><td>O305</td><td></td></tr><tr><td>메스 Swann Morton</td><td>Fisher Scientific</td><td>11849002</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>이가 있는 Allis 조직 겸</td>자 <td>Rocialle</td><td>RSPU500-322</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Agar</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>14432-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>41298-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Vimoba 정제</td><td>Quip Labs</td><td>VMTAB75BX</td><td></td></tr></tbody></table>

새로운 항생제 테스트를 위한 새로운 고처리량 생체 외 난소 피부 상처 모델

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

항균제의 개발은 성공률이 점점 낮아지는 값비싼 과정이므로 항균 발견 연구에 대한 추가 투자가 덜 매력적입니다. 항균 약물 발견 및 후속 상용화는 연구자가 약물 설계 및 제형을 더 잘 제어할 수 있는 리드 최적화 단계 내에서 페일패스트 앤 페일-싸게 접근 방식을 구현할 수 있다면 더 수익성이 높아질 수 있습니다. 이 기사에서는 황색포도상구균에 감염된 생체외 난소 상처 피부 모델의 설정에 대해 설명하며, 이는 간단하고 비용 효율적이며 처리량이 높고 재현 가능합니다. 모델의 박테리아 생리학은 박테리아 증식이 조직을 손상시키는 병원체의 능력에 의존하기 때문에 감염 동안 모방합니다. 상처 감염의 확립은 접종 원에 비해 생존 가능한 박테리아 수의 증가에 의해 확인됩니다. 이 모델은 리드 최적화 단계에서 새로운 항균제의 효능을 테스트하기 위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다. 이 모델의 가용성은 항균제를 개발하는 연구자들에게 실패-빠른-실패-값싼 모델을 제공하여 후속 동물 실험에서 성공률을 높이는 데 도움이 될 것이라고 주장할 수 있습니다. 이 모델은 또한 연구를 위한 동물 사용의 감소 및 개선을 촉진하고 궁극적으로 피부 및 연조직 감염에 대한 새로운 항균제를 클리닉으로 더 빠르고 비용 효율적으로 번역할 수 있도록 합니다.

상처 감염 모델을 설정하기 전에 피부를 살균하는 경로를 식별하는 것은 어려웠습니다. 문제는 다른 피부층을 손상시키지 않고 피부를 살균하는 데 있었으며, 이는 감염의 결과에 의도하지 않은 결과를 초래할 수 있습니다. 적절한 멸균 요법을 확인하기 위해, 표 1에 요약된 바와 같이, 다양한 기간 동안 상이한 처리가 시도되었다. 오염은 피부 샘플을 유지하기 위해 사용된 MK 배지에서 48시간 후의 탁도의 발달로서 기록되었다. 조직 무결성은 조직학에 의해 모니터링되었고, 치료 직후 헤마톡실린 및 에오신 (H &amp; E)으로 염색되었습니다 (그림 1). 이산화염소로 30분 동안 처리하면 조직 무결성을 유지하면서 피부 조직을 재현 가능하게 살균하는 데 가장 효과적인 것으로 입증되었습니다.
실험 설정에서 상처 입은 멸균 조직은 공기-액체 계면에 있는 24웰 삽입물의 정점 챔버에 배치됩니다(<strong cl...

이 프로토콜은 황색포도상구균에 감염된 생체외 난소 상처 피부 모델을 설정하는 단계별 방법을 설명합니다. 이 고처리량 모델은 기존 미생물학 기술에 비해 생체 내 감염을 더 잘 시뮬레이션하고 연구자에게 새로운 항균제의 효능을 테스트할 수 있는 생리학적으로 관련된 플랫폼을 제공합니다.

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...

이 모델을 통해 중요한 전임상 단계의 연구자는 새로운 제형의 항균 효능을보다 정확하게 결정할 수 있으며 연구자는 약물 설계 및 제형을보다 잘 제어 할 수 있습니다. 이 모델은 대표적인 상처 환경에서 신속하게 재현 가능한 결과를 가능하게 합니다. 그것은 목적으로 사육 된 동물의 필요성을 줄이고 상처 감염에 대한 국소 항균제를 클리닉으로 더 빨리 번역 할 수 있도록합니다.주요 과제는 오염과 손재주입니다. 엄격한 무균 기술과 조직 처리에 대한 인내심이 필수적이며,이 방법의 성공을 위해서는 정확하고 목적이있는 플랩 제거가 필요합니다. 집게를 섭씨 200도에서 1 시간 동안 건열 살균에 노출시켜 소독부터 시작하십시오.사용하기 전에 모든 유리 제품을 섭씨 121도에서 15분 동안 오토클레이브하십시오. 약 100ml의 200PPM 이산화염소 용액을 샘플 영역에 부어 램프의 이마 부분을 소독합니다. 전기 클리퍼를 사용하여 이마 부분을 면도 한 다음 200PPM 이산화 염소 용액 200ml로 세척하십시오.에탄올과 파란색 롤을 사용하여 해당 부위를 닦고 샘플 부위를 제모 크림으로 덮습니다. 35분 후, 스크래핑 도구를 사용하여 제모 크림을 부드럽게 긁어내고 샘플 영역을 평가합니다. 상당한 양의 머리카락이 남아 있으면 제모 과정을 반복하십시오.깨끗한 샘플 영역을 200ml의 이산화 염소 용액으로 헹구고 에탄올과 파란색 롤로 헹굽니다. 멸균 된 8mm 생검 펀치를 사용하여 준비된 영역에서 8mm 피부 샘플을 잘라냅니다. 그런 다음 멸균 집게와 15 번 블레이드 메스를 사용하여 샘플을 제거하여 모든 피부 지방이 제거되도록합니다.멸균 PBS로 채워진 멸균 0.5리터 병에 샘플을 넣습니다. 그런 다음 50 PPM 이산화 염소 용액 50 밀리리터로 채워진 멸균 된 200 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브를 두 번 뒤집어 30 분 동안 멸균하십시오.샘플을 40 밀리리터의 멸균 PBS로 채워진 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. PBS 세척 후, 각각의 피부 샘플을 24-웰 플레이트의 별개의 웰에 둔다. 공기-액체 계면에서 샘플을 유지하면서 웰에 350 마이크로 리터의 예열 된 배지를 추가합니다.24 웰 플레이트를 가스 투과성 플레이트 씰로 밀봉 한 후 배양 할 플레이트를 5 % 이산화탄소 및 섭씨 37 도의 가습 조직 인큐베이터에 24 시간 동안 놓습니다. 배양 후, 배양 배지를 제거하고 샘플을 500 마이크로리터의 멸균 PBS로 헹구었다. 무항생제 배지로 처리하여 샘플에서 잔류 항생제를 제거합니다.이산화탄소 및 섭씨 37도에서 24시간 동안 처리합니다.무항생제 배지에서 탁도 또는 곰팡이 감염이 발생하면 샘플을 폐기하십시오. 다음으로, 10 밀리리터의 멸균 트립신 간장 국물로 50 밀리리터 튜브를 준비하십시오. 그런 다음 S.aureus의 신선한 한천 플레이트에서 여러 개의 황색 포도상 구균 콜로니를 국물로 옮기고 튜브를 섭씨 37도 및 150RPM에서 18 시간 동안 배양합니다.튜브를 4, 000 G에서 3분 동안 원심분리한 후, 상청액을 제거하고 세포 펠렛을 멸균 PBS 10ml에 재현탁시켰다. 멸균 PBS를 사용하여 접종물을 600나노미터 파장에서 0.6 광학 밀도로 조정하기 전에 PBS 세척을 두 번 반복합니다. 수동 실행 가능한 플레이트 수로 접종 부하를 확인합니다.피부 샘플을 감염시키려면 400마이크로리터의 사전 예열된 무항생제 배지가 있는 새로운 24웰 플레이트를 준비하고 멸균 집게를 사용하여 24웰 삽입물을 추가합니다. 피부 샘플에서 배지를 제거합니다. 500 마이크로리터의 멸균 PBS로 세척하고 세척물을 제거한다.멸균 집게를 사용하여 샘플을 우물 바닥에 부드럽게 고정하십시오. 4mm 펀치 생검을 사용하여 피부 샘플을 1-2mm의 거친 깊이로 뚫고 중앙 상처 플랩을 만듭니다. 그런 다음 15 번 블레이드 메스와 멸균 치아 Allis 조직 집게를 사용하여 상처 플랩의 최상층을 제거합니다.모든 샘플이 감겨지면 멸균 포셉을 사용하여 24 웰 인서트로 옮깁니다. 15 마이크로리터의 박테리아 접종물을 상처 층에 피펫팅한 후 가습된 조직 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 더 긴 배양 기간의 경우, 배지를 제거하고, 24 시간마다 신선한 배지로 교체하고, 동일한 조건에서 플레이트를 배양하십시오.박테리아 부하를 결정하려면 우물 바닥에서 매체를 제거하십시오. 그리고 멸균 집게를 사용하여 각 샘플을 1 밀리리터의 멸균 PBS로 채워진 별도의 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 미세한 팁 균질화기로 샘플 표면을 균질화하여 상처 침대 표면에서 박테리아를 분리합니다.상처 베드가 균질화기의 팁과 직접 접촉하는지 확인하십시오. 모든 샘플이 처리되면, 20 마이크로리터의 균질액을 180 마이크로리터의 멸균 PBS를 함유하는 96-웰 플레이트의 상응하는 웰로 옮기기 전에 각 샘플을 와동시킨다. 각 샘플 균질액을 1회 10 내지 7음수로 연속 희석하고, 10 마이크로리터의 피펫으로 희석된 균질액을 트립틱 대두 한천 플레이트 상에 삼중으로 삼중으로 희석한다.트립신 대두 한천 플레이트를 섭씨 37도에서 배양하고, 18시간 후에 콜로니의 수를 세어 각 샘플에 대한 콜로니 형성 단위 또는 CFU를 결정한다. 다양한 기간 동안 다른 치료법을 사용하여 적절한 피부 살균 요법을 확인했습니다. 조직 무결성을 조직학에 의해 모니터링하고, 치료 직후에 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다.이산화염소로 30분간 처리하는 것이 가장 효과적인 치료법이었으며, 조직 무결성을 유지하면서 피부 조직을 재현 가능한 살균했습니다. 상처 침대의 흰색 필름은 감염 48 시간 후 조직에서 분명했습니다. 스크래치 모델은 24시간 후 더 높은 평균 CFU 수를 나타내었지만 플랩 제거 상처 기술은 보다 일관된 결과를 생성했습니다.48 시간 후, 접종 물에 비해 상처 조직에서 약 100 배 더 많은 박테리아 CFU가 회수되어 성공적인 감염을 나타냅니다. 감염된 조직의 그람 염색 된 조직학 섹션은 감염되지 않은 조직의 섹션에는없는 상처 층에 S.aureus 세포의 존재를 나타냅니다. 이 절차에 따라 면역 조직 화학을 수행하여 조직 반응을 연구하고, 박테리아 위치를 시각화하기 위해 변형 된 그람 염색 및 항균 노출 후 생존 가능한 플레이트 수를 수행하여 항균 효능을 테스트 할 수 있습니다.새로운 항균제를 개발하는 연구원들에게 이 모델은 납 최적화에 대한 더 큰 제어를 제공하고, 비싸고 엄격하게 규제되는 동물 실험에 대한 의존도를 줄이며, 항균제를 클리닉으로 신속하게 번역할 수 있도록 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: 드 브리스, C. R., et.al. 만성 Pseudomonas aeruginosa 상처 감염의 지연 접종 모델. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 투명 필름 드레싱으로 덮인 두 개의 전층 등 피부 상처를 가진 쥐에 발광성 Pseudomonas aeruginosa 를 지연 접종하는 과정을 보여줍니다. 이로 인해 바이오필름 형성과 만성 감염 형성이 촉진됩니다. 정기적인 생물발광 모니터링을 통해 박테리아 부담을 정량화하고 감염 진행 상황을 시간에 따라 추적할 수 있습니다.

만성 Pseudomonas aeruginosa 피부 상처 감염의 마우스 모델 개발 

이 비디오는 돼지의 눈에서 절개한 각막 단추를 사용하여 세균성 각막염에 대한 체외 모델을 설정하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 접종된 박테리아는 각막 상피 절개 부위를 통과하여 기저 기질에 침입하고 각막 조직 내에서 생체 내 감염을 모방하는 감염을 일으킵니다.

세균성 각막염의 Porcine Ex vivo 각막 모델: 각막 상피 세포에서 세균 감염을 확립하는 기술

이 비디오는 피부 상처 감염의 쥐 모델을 생성하는 기술을 보여줍니다. 호중구에서 형광 단백질을 발현하도록 조작된 쥐를 유전자 변형 생물 발광 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 감염시키면 병원성 박테리아가 발생합니다. 감염 부위의 박테리아 부담과 호중구 동원 역학은 전체 동물 이미징을 사용하여 연구할 수 있습니다.

박테리아 병원체에 대한 면역 반응을 연구하기 위한 쥐 피부 상처 감염 모델

이 비디오는 황색포도상구균에 감염된 생체 외 양피부 모델의 생성을 보여줍니다. 여기에는 양의 이마 피부 생검 부위를 항생제로 치료하고, 상처 부위를 확립하고, 무항생제 배지가 있는 멀티웰 플레이트의 투과성 멤브레인에 배치하고, 피부 상처에 박테리아 감염을 확립하는 것이 포함됩니다.

박테리아 병원체에 감염된 Ex vivo Ovine Wounded Skin 모델 생성

여기는 실시간, 비-침략 적, 발광 녹 농 균의 biofilm 상처 감염의 모니터링을 위한 털 쥐를 활용 하 여 새로운 당뇨병 murine 모델에 설명 합니다. 이 메서드는 다른 세균성 종 및 다 종 biofilms를 포함 하 여 유전자 변형된 미생물의 감염을 평가 하 고 antibiofilm 전략의 효능 테스트에 적용할 수 있습니다.

라이트 사이드에와 서: Vivo에서 당뇨병 털 Murine 모델에 만성 상처에서 녹 농 균 Biofilm 감염의 모니터링

전직에 대 한 프로토콜 vivo 막 기관 문화 모델 부상 치료 연구는 설명 하는 유용한. 이 모델 시스템 재생 치유를 촉진 하는 에이전트 또는 조직된 3D 다세포 환경에서 약물 독성의 효과 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Ex Vivo 막 기관 문화 모델에 대 한 상처 치유 연구

여기서, 2개의 뮤린 상처 치유 모델이 기술되고, 하나는 세포 및 사이토카인 상처 치유 반응을 평가하기 위해 고안되고 다른 하나는 상처 폐쇄의 속도를 정량화하도록 설계된다. 이 방법은 가난한 상처 치유의 각종 양상에 의하여 기계장치를 결정하기 위하여 당뇨병과 같은 복잡한 질병 모형으로 이용될 수 있습니다.

등지성 폴리비닐 알코올 스폰지 이식 및 절제 꼬리 피부 상처 모델을 사용하여 급성 상처 치유의 평가.

이 문서에서는 세균 성 각질염의 전 생체 돼지 모델을 설정하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 슈도모나스 아에루기노사는 대생 유기체로 사용된다. 이 혁신적인 모델은 세균성 증식이 각막 조직을 손상시키는 박테리아의 능력에 달려 있기 때문에 생체 내 감염을 모방합니다.

세균성 각막염에 대하여 약 처리를 공부하기 위한 돼지 Ex Vivo Cornea 모형 을 설치합니다

여기서는 전형염색 접근법과 결합된 전 생체 내 인간의 피부를 사용하여 상처 수리를 평가하기 위한 최적화된 기술을 시연합니다. 이 방법론은 잠재적인 상처 치료의 평가를 위한 전임상 플랫폼을 제공합니다.

인간 Ex 생체 내 상처 모델 및 피부 수리를 정확하게 평가하기 위한 전산 염색 접근법

항생제에 내성이 있는 만성 상처는 의료 시스템에 큰 위협이 됩니다. 생물막 감염은 완고하고 적대적이며 기능적 상처 봉합 부족을 유발할 수 있습니다. 우리는 생물막에 감염된 전층 만성 상처의 임상적으로 관련된 돼지 모델을 보고합니다. 이 모델은 기계론적 연구뿐만 아니라 중재 테스트에도 강력합니다.

생물막 감염 및 보이지 않는 상처의 돼지 모델

405nm 청색광 LED 장치는 콜라겐 기반 합성 피부 모델에서 다양한 상처 병원체에 대해 항균 효능을 입증합니다. 이 간소화된 시험관 내 접근법은 빛 기반 항균 치료의 초기 단계 평가에 있어 재현 가능하고 윤리적으로 실현 가능한 대안을 제공합니다.

콜라겐 기반 합성 피부 모델을 이용한 상처 병원체를 억제하는 청색광 LED 장치 연구

학습하세요 Staphylococcus aureus 감염된 양 피부 상처 모델을 이용한 새로운 항생제 효능 평가 방법입니다. 이 생체 외 모델은 전임상 단계에서 신속하고 재현 가능한 결과를 제공하며 동물 실험 의존도를 줄입니다.

새로운 항생제 테스트를 위한 새로운 고처리량 생체 외 난소 피부 상처 모델

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