Name: 생리학적 조건하에서의 알파-시뉴클레인 구조역학 연구를 위한 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 배우세요 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법을 사용하여 생리학적 조건에서 alpha-synuclein의 구조역학을 분석하는 방법을. 이 기술은 본질적으로 무질서한 단백질의 동적 구조 변화를 연구하는 데 활용됩니다.

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NS는 University Council Diamond Jubilee Scholarship의 지원을 받습니다. JJP는 UKRI Future Leaders Fellowship [Grant number : MR / T02223X / 1]의 지원을 받습니다.

1. aSyn의 단백질 발현 및 정제
<ol><li>이전에 게시된 보고서 다음에 aSyn을 준비합니다 9.</li>
	<li>안전한 저장 완충액(예를 들어, 트리스, pH 7.2)으로 투석한다.</li>
	<li>필요한 경우, 샘플을 농축한다 (예를 들어, 약 10-30분 동안 3 kDa MWCO, 14,000 x g 를 사용하는 스핀 필터 마이크로원심분리 튜브, 재료 표 참조). 참고 : 지나치게 집중하지 않는 것이 좋습니다. 단량체 앙상블의 완전성은 25 μM 이상으로 검증되지 않았다.</li>
	<li>분취량 및 -80 °C에서 저장 참고: aSyn 단량체 단백질은 이러한 저장 조건에서 최대 1년 동안 안정합니다.</li>
</ol>2. HDX 버퍼 준비
참고: 트리스는 고온 계수를 갖기 때문에 HDX 반응이 수행되는 온도(이 프로토콜에서 20°C)에 맞게 pH 측정을 조정해야 합니다.
<ol><li>0.002 mol의 트리스를 LC-MS 등급 물 100 mL에 칭량하여 상태 A 및 주 B에 대한 평형 완충액을 준비하십시오. 상태 B의 경우, 29.8 mg의 KCl, 14.2 mg의 MgCl2, 36.8 g의CaCl2 및 836 mg의 NaCl을 트리스 완충액에 첨가한다. pH를 7.40 내지 0.05± 조정한다. 참고: 평형 버퍼에는 aSyn을 연구해야 하는 조건이 포함되어야 합니다. 이 경우, pH 7.4에서 20 mM 트리스 +/- 염이다.</li>
	<li>100 mL의 중수소 물에 0.002 mol의 Tris를 칭량하여 상태 A 및 주 B에 대한 라벨링 완충액을 준비하십시오. 상태 B의 경우, 29.8 mg의 KCl, 14.2 mg의 MgCl2, 36.8 g의CaCl2 및 836 mg의 NaCl을 트리스 표지 완충액에 첨가한다. 표지 완충액의 pD는 평형 완충액의 pH에 상응한다. pH = pD - 0.41이므로 pH 측정기가 6.99 ± 0.0523,24를 읽도록 조정하십시오. 참고: 라벨링 버퍼는 중수소수를 사용하여 준비된다는 점을 제외하고는 평형 버퍼와 동일한 구성 요소를 가져야 합니다.</li>
	<li>0.010 mol의 Tris와 0.050 mol의 요소를 칭량하여 담금질 완충액을 준비하고 LC-MS 등급 물로 100 mL까지 구성하십시오. pH를 0.5°C에서 2.50 ± 0.05로 조정한다. 참고: HDX 실험 전에 담금질 버퍼 스크린을 수행하여 관심 단백질에 가장 적합한 담금질 버퍼를 식별해야 합니다. 변성제 (예를 들어, 우레아 및 구아니디늄 히드로클로라이드) 및 환원제 (예를 들어, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀)의 상이한 농도 및 조합은 포획 부피 및 온도와 같은 물리적 파라미터와 함께, 담금질 단백질을 효과적으로 펼치고 소화하기 위해 스크리닝된다. pH 2.50에서 100 mM 트리스 및 0.5 M 우레아를 포함하는 담금질 완충액이 본 연구에 최적이다.</li>
	<li>0.125 mol의 구아니디늄 염산염을 두란 유리 병에 칭량하여 소화 컬럼 세척 완충액을 준비한다. 메탄올 25 mL와 포름산 250 μL를 첨가한다. LC-MS 등급의 물로 최대 250 mL를 만드십시오. 참고: Enzymate BEH 펩신 컬럼( 물질 표 참조)의 경우, 0.5M 구아니디늄 염산염, 10%(v/v) 메탄올 및 0.1%(v/v) 포름산의 컬럼 세척 버퍼를 사용하십시오.</li>
	<li>0.5 μL의 포름산을 LC-MS 등급 물 249.5 mL에 피펫팅하여 약한 세척 주사기를 준비한다.</li>
	<li>LC-MS 등급의 등가의 물, 메탄올, 아세토니트릴, 및 이소프로판올을 혼합하여 강한 세척 주사기를 제조하였다. 포름산을 최종 2% (v/v) 농도에 첨가하십시오. 참고: 다양한 버퍼와 단백질 사이의 교차 오염을 방지하고 주입구의 세척을 가능하게 하려면 주사기 세척 용액을 준비하고 밸브로의 유로(종종 "세척 라이너"로 명명됨)가 액체로 완전히 프라이밍되는 것이 중요합니다. 포름산은 주사기 약한 세척을 위해 선택적이다.</li>
</ol>3. 펩타이드 매핑 절차
<ol><li>아래 단계에 따라 샘플을 준비합니다.<ol>
<li>-80°C 냉동고로부터 해동된 aSyn 단백질 스톡을 0.22 μm 시린지 필터로 여과한다. 여과된 스톡 단백질의 흡광도를 280 nm에서 측정하여 Beer-Lambert 법칙에 의해 농도를 결정한다. 단백질을 평형 완충액 중에서 5 μM의 농도로 희석한다(단계 2.1.). 참고: Beer-Lambert 법칙: A = εcl, 여기서 A는 흡 광도이고, ε는 M-1 cm-1단위를 갖는 측정된 파장(여기에서 280 nm)에서의 단백질의 흡광 계수이고, c는 M의 단백질 농도이고, l은 경로 길이 cm이다. 야생형 aSyn26의 경우 ε = 5960 M−1 cm−1입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>액체 크로마토그래피 방법을 설정합니다.<ol>
<li>7000-9000 psi의 압력에서 3 분의 로딩 / 포획 시간으로 입구 파일을 만든 다음 7 분 안에 5 % 아세토 니트릴에서 40 % 아세토 니트릴로 구배를 한 다음 10 분 동안 5 % -95 % 아세토 니트릴 물의 세척 단계를 반복하십시오.</li>
		<li>잠금 스프레이 (예를 들어, 류신 엔케팔린, 재료 표 참조)가 2000 psi로 흐르고 질량 분광계의 소스 잠금 스프레이 프로브에 연결되도록하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>질량 분광법 MSE 방법을 설정하십시오. 참고: MSE 는 전구체 질량 격리가 없는 광대역 데이터 독립적 수집 방법입니다. 따라서, 선택된 m/z 범위 내의 모든 이온은 충돌-유도된 해리(CID)27을 사용하여 추가로 단편화된다.<ol>
<li>MS 메소드 파일에서 MSE 연속체 를 선택하고 2-10 분, 전기 분무 소스 및 포지티브 해상도 모드 사이의 수집 시간을 설정하십시오. 50-2000 Da를 통해 MSE 를 획득하여 0.3 초마다 스캔하십시오.</li>
		<li>기능 1(저에너지)의 경우 트랩 및 전달 충돌 에너지를 4V로 설정합니다. 함수 2(고에너지)의 경우, 램프 전달 충돌 에너지를 4V에서 일정하게 설정하고, 트랩 충돌 에너지를 각 매핑 에너지 레벨에 대해 표 1 에 명시된 바와 같이 설정한다. 참고: 이온 이동성 MSE 방법도 사용할 수 있습니다. 대안적인 매핑 방법들(예를 들어, 데이터-의존적 획득 또는 DDA)은 사용자 재량에 따라 사용될 수 있다.</li>
	</ol></li>
	<li>자동 시료 주입기 로봇을 설정합니다( 재료 표 참조).<ol>
<li>50 μL 단백질을 총 회수 바이알에 첨가한다. 바이알을 HDX 우측 챔버의 샘플 위치에 놓습니다. 이 챔버가 0.5°C에 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>평형 완충액의 시약 바이알 하나와 라벨링 버퍼의 시약 바이알 두 개를 HDX 좌측 챔버 내의 시약 위치 하나, 둘, 셋에 첨가한다. 펠티에 온도 제어기를 설정하여 이 챔버가 20°C에 있는지 확인하십시오( 재료 표 참조). 담금질 버퍼의 시약 바이알 하나를 HDX 우측 챔버 내에 시약 위치에 추가하십시오.</li>
		<li>HDX 왼쪽 챔버의 반응 위치에 여덟 개의 총 회수 바이알을 추가하고 HDX 오른쪽 챔버의 반응 위치에 여덟 개의 최대 회수 바이알을 추가합니다. 참고: 분배된 부피의 완전한 세척과 최대한의 재현성을 보장하려면 자동 시료 주입기 주사기에서 주사기 세척 및 프라임 워시를 수행하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 매핑 실험을 시작하기 전에 (1) 약한 세척, (2) 강한 세척, (3) 약한 세척의 시퀀스를 실행하십시오. 이 순서는 광범위하게 반복 될 수 있으며 최대 20x까지 또는 주사기가 완전히 젖을 때까지 수행하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>스케줄링 소프트웨어에서 적절한 LC 및 MS 방법을 사용하여 샘플 목록을 설정하고 스케줄을 시작하십시오. 참고: 본 연구를 위해, 크로노스는 스케줄링 소프트웨어로 사용된다( 재료 표 참조).</li>
	</ol></li>
	<li>매핑 데이터를 처리합니다.<ol>
<li>적절한 소프트웨어를 사용하여 매핑 실험 파일에서 펩티드를 식별 합니다(자료 표 참조).</li>
		<li>다음 펩티드 역치 파라미터를 사용하여 펩티드 식별 데이터를 DynamX로 가져옵니다: 최소 강도 = 5000, 최소 서열 길이 = 0, 최대 서열 길이 = 40, 최소 생성물 = 1, 아미노산당 최소 생성물 = 0.25, 최소 연속 생성물 = 2, 생성물에 대한 최소 합계 강도 = 0, 최소 점수 = 0, 최대 MH+ 오차(ppm) = 0. 참고: 또는 권장 워크플로우(28)에 따라 최적화된 설정을 도출하십시오.</li>
		<li>메뉴에서 데이터를 선택하고 PLGS 결과 가져오기를 클릭합니다. 추가를 클릭하여 스펙트럼 할당에 대한 관련 데이터 파일을 선택합니다. 모두 추가되면 다음을 클릭하고 위의 필터 설정을 입력하십시오. 그런 다음 마침을 클릭하십시오.</li>
		<li>동위원소 할당을 수동으로 큐레이트하여 DynamX에서 aSyn의 최종 펩티드 커버리지 맵을 획득한다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 밀리초 수소/중수소 교환 연구
<ol><li>HDX 실험을 시작하기 전에 FastHDX 프로토타입 장비( 자료표 참조)를 청소하십시오.<ol>
<li>호환되는 HDX 소프트웨어 GUI를 열고 시스템을 초기화할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>샘플 챔버 온도를 20°C로, 담금질 챔버를 0.5°C로 입력합니다. 설정을 클릭하여 새 온도를 적용합니다.</li>
		<li>모든 입구에 LC-MS 등급의 물로 원심 분리 튜브를 설치하십시오.</li>
		<li>적정기 배관 배달 탭에서 왼쪽 및 오른쪽 주사기를 모두 확인하고 프라임을 클릭하여 튜브의 잠복 공기 방울을 제거하십시오. 모든 거품이 사라질 때까지 반복하십시오.</li>
		<li>매크로 탭에서 주사기의 모든 상자를 선택합니다. 주사기 홈 위치 보정을 클릭하십시오. 세척 주사기 로드 루프를 클릭합니다. 모든 믹싱 루프 볼륨 세척을 클릭하십시오.</li>
		<li>4.1.5단계를 반복합니다. 1배 더.</li>
		<li>버퍼 주사기에 기포가 나타나면 주사기를 분리하고 기포를 수직으로 배출하여 기가를 제거합니다. 주사기를 교체하고 제로 위치로 다시 보정하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>HDX 실험을 위한 FastHDX 프로토타입 기기를 설정합니다.<ol>
<li>여과된 500 uL의 여과된 5 μM aSyn을 총 회수 바이알에 첨가하고, 온도-유도된 올리고머화 및 응집을 방지하기 위해 탁상 냉장고 내부에 놓는다.</li>
		<li>50mL의 평형, 라벨링 및 담금질 버퍼를 각 버퍼에 추가합니다(2. HDX 버퍼 준비 단계 1-3) 좌우 챔버 내의 입구.</li>
		<li>컬럼 세척 완충액 50 mL를 첨가한다(2. HDX 완충액 준비 단계 4)를 펩신 세척 유입구로 세척한다.</li>
		<li>단백질과 컬럼 세척 라인을 1x로 프라이밍하려면 적정기 배관 전달 탭에서 왼쪽 및 오른쪽 주사기를 모두 확인하고 프라임을 한 번 클릭하십시오. 참고 : 프라임에 대한 후속 클릭은 프라임 프로세스의 추가 반복을 유발하여 많은 양의 단백질 샘플을 소비합니다. 버튼 클릭을 시도한 후 소프트웨어에 지연이있는 경우에도이를 피하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>4.1.5단계를 반복합니다. 1배.</li>
		<li>수동 담금질 흐름 탭에서 4.2.7.-4.2.10단계에서 설명하는 필수 설정을 입력합니다.</li>
		<li>시간 코스 실험의 경우 기호 점 단추를 사용하여 시간을 밀리초 단위로 입력합니다. 반복실험이 필요한 경우, 동일한 시점을 여러 번 추가합니다(예: 50ms의 삼중의 경우 50,50,50개를 입력해야 함). 질량 분광계 소프트웨어 (MassLynx는 여기에서 사용됩니다. 재료 표 참조)의 샘플 목록은 해당 시점과 정확히 일치해야합니다. 참고: 질량 분석기 샘플 목록 파일 이름 및/또는 샘플 텍스트는 FastHDX 소프트웨어 GUI에 입력된 시간에 해당하는 HDX 라벨링 시간의 영구 기록을 보장하기 위해 사용해야 합니다. 각 샘플 실행에 대한 레이블 지정 시간은 다른 곳에 저장되지 않습니다.</li>
		<li>트랩 시간(분)을 트랩 시간의 길이로 설정합니다. 여기서, 그것은 3.00입니다.</li>
		<li>HPLC 대기 시간(분) = (트랩 시간 + 실행 시간 + 1.5분)을 설정합니다. 참고: 예를 들어 3분 트래핑 및 17분 그라디언트가 있는 실험의 경우 21.50분이 됩니다.</li>
		<li>샘플 실행 사이에 빈 실험을 실행하는 경우에만 빈 실행 상자를 클릭합니다. 그렇다면 각 샘플 실행 후 빈 실행에 대한 소프트웨어의 항목(예: 샘플 목록의 유효한 행)을 확인하십시오.</li>
		<li>소프트웨어에서 샘플 목록이 준비되면 적절한 항목을 강조 표시하고 소프트웨어에서 재생 버튼과 FastHDX 를 클릭하여 소프트웨어에서 실행을 시작하십시오. 참고: 수소/중수소 스크램블링으로 인해 MS 전용 방법 또는 소프트 단편화 기술(전자 전달 해리, 전자 포획 해리 및 자외선 광 해리)은29개만 사용할 수 있습니다. 7.40의 생리학적 pH에서 aSyn의 경우, 50ms에서 300s 사이의 시간점이 가장 적용가능한데, 이는 이들이 전체 중수소 흡수 곡선(8)을 포괄하기 때문이다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 데이터 처리
<ol><li>펩티드 매핑 실험으로부터 분광적으로 할당된 펩티드의 파일을 로드한다. 파일 메뉴를 열고 DynamX 소프트웨어에서 열기 를 클릭하십시오( 자료표 참조).</li>
	<li>원시 파일을 선호하는 질량 측정 소프트웨어(예: DynamX, HDExaminer 등)로 가져옵니다. "데이터"메뉴를 열고 MS 파일을 클릭하십시오. 새 상태를 클릭하여 연구된 각 단백질 상태에 대한 상태를 만듭니다.<ol>
<li>새 노출을 클릭하여 각 HDX 시간대를 추가합니다. 새 RAW를 클릭하여 .raw 파일을 가져옵니다. 각 .raw 파일을 올바른 위치로 끕니다. 완료되면 확인을 클릭하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동위원소를 먼저 자동으로 할당하고(위의 5.2단계에 따라 자동으로 지정됨) 동위원소 할당을 수동으로 큐레이트하여 높은 데이터 품질을 보장합니다.</li>
	<li>클러스터 데이터를 단백질 이름, 서열 시작 번호, 서열 끝 번호, 서열, 변형, 단편, 가능한 최대 섭취량, 단동위원소 종의 질량, 상태 이름, 노출 시간, 파일 이름, 전하, 보존 시간, 강도 및 중심 순서로 열이 있는 .csv 파일로 내보냅니다.</li>
	<li>질량 측정 소프트웨어에서 데이터 메뉴를 열고 클러스터 데이터 내보내기를 클릭하십시오.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>내보낸 클러스터 데이터를 기본 HDX 분석 소프트웨어로 로드합니다. 여기서, HDfleX는30을 사용한다(재료 표 참조).</li>
	<li>모든 펩티드 및 상태에 대한 실험 데이터를 적합시키고, HDX 반응에 대해 관찰된 속도 상수를 얻기 위해 적절한 역교환 보정 방법을 선택한다.</li>
	<li>선호하는 방법(HDfleX는 이에 대한 몇 가지 옵션 지원)으로 전역 유의 임계값을 계산하고 하이브리드 유의 테스트를 수행하여31,32와 비교된 상태 간의 유의한 차이를 확인합니다. 참고: 관찰된 차이가 전역 임계값보다 크고 p-값이 선택한 신뢰 수준(예: 95%)보다 작으면 그 차이는 유의한 것으로 간주됩니다.</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

본 기사에서, 다음의 절차가 기술된다: (1) 가장 높은 서열 커버리지를 얻기 위해 단량체성 aSyn에 대한 펩티드 매핑 실험을 수행하고, (2) 생리학적 조건 하에서 단량체성 aSyn에 대한 밀리초 HDX-MS 데이터를 획득하고, (3) 생성된 HDX-MS 데이터의 데이터 분석 및 해석을 수행한다. 제공된 절차는 일반적으로 실행이 간단하며, 각 라벨링 실험은 일반적으로 세 번의 반복실험과 8개의 시간 지점에 대해 약 8시간 동안 지속되며, 매핑 실험은 약 2시간 동안 지속됩니다. 여기에 사용된 완전 자동화된 계측을 감안할 때 1일 내에 전체 데이터 세트를 획득할 수 있습니다. 그러나 샘플을 취급하고 완충액을 준비 할 때는 측정이 원하는 상태에서 약하게 안정적인 단백질 (또는 단백질 영역)에서 파생되도록 주의해야합니다. 중요하게도, 이전의 연구는 동결 및 동결건조와 같은 상이한 저장 조건이 상이한 aSyn 단량체 순응제를 초래하고, aSyn 단량체 형태 앙상블10에 대한 샘플 취급의 잠...

파킨슨 병 (PD)은 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 신경 퇴행성 질환입니다1. 그것은 뇌의 흑질파 콤팩타 영역에서 Lewy 바디 및 Lewy 뉴라이트로 알려진 세포질 내포물의 형성을 특징으로합니다. 이들 세포질 내포물은 본질적으로 무질서한 단백질 aSyn2의 응집체를 함유하는 것으로 밝혀졌다. PD 및 다른 synucleinopathies에서, aSyn은 가용성 무질서 상태에서 불용성, 고도로 구조화 된 병적 상태로 변형된다. 그것의 본래 형태에서, 단량체성 aSyn은 그것의 N- 및 C-테르미니 사이 장거리 정전기 상호 작용 및 그것의 C-말단 및 비-아밀로이드 베타 성분 (NAC) 영역 3,4,5,6 사이의 소수성 상호작용에 의해 안정화된 광범위한 입체 형태를 채택한다. 돌연변이, 번역 후 변형 및 국소 환경의 변화와 같은 이러한 안정화 상호 작용의 중단은 단량체의 오폴딩으로 이어질 수 있으며, 따라서 응집 과정을 촉발시킬 수 있습니다7.
aSyn 8,9,10,11의 올리고머 및 피브릴라 형태에 대한 방대한 양의 연구가 존재하지만, 단백질의 단량체 형태를 연구하고 어떤 순응자가 기능적인지 (그리고 어떻게) 그리고 어떤 것이 응집되기 쉬운지를 더 잘 이해할 필요가 있습니다8,9,10,11 . 본질적으로 무질서하고, 크기가 14 kDa에 불과하고, 결정화하기 어려우며, aSyn 단량체는 대부분의 구조적 생물학적 기술에 복종할 수 없다. 그러나 단량체 aSyn의 형태 역학을 측정 할 수있는 한 가지 기술은 밀리 초 HDX-MS이며, 이는 최근에12,13,14를 얻는 것이 어렵거나 불가능한 중요한 구조적 관찰을 생성했습니다. 밀리초 HDX-MS는 아미드 수소에서 동위원소 교환을 모니터링하여 단백질 입체 앙상블의 평균을 민감하게 측정하여 밀리초 시간 척도에서 특정 단백질 영역의 용매 접근성 및 수소 결합 네트워크 참여를 나타냅니다. HDX-MS의 밀리 초 측면을 강조 할 필요가 있는데, 이는 기본적으로 펼쳐진 메타 안정 특성으로 인해 aSyn은 기존 HDX-MS 시스템의 하한보다 훨씬 낮은 매우 빠른 수소 교환 동역학을 나타내기 때문입니다. 예를 들어, 대부분의 aSyn 분자는 1 s 미만의 세포 내 조건 하에서 중수소와 완전히 수소를 교환했습니다. 몇몇 실험실은 이제 빠른 혼합 계측기를 구축했습니다. 이 경우 50ms의 데드 타임과 1ms의 시간 분해능으로 HDX-MS를 수행 할 수있는 프로토 타입 고속 혼합 담금질 흐름 기기가15 사용됩니다. 밀리 초 HDX-MS는 최근 aSyn의 연구에서 매우 중요하지만, 본질적으로 무질서한 단백질 / 영역을보다 광범위하게 연구하고 약하게 안정적인 루프 / 영역을 가진 많은 수의 단백질을 연구하는 데 가치가 있습니다. 예를 들어, 펩티드 약물 (예를 들어, 인슐린; GLP-1/글루카곤; tirzepatide) 및 펩티드-융합 단백질 (예를 들어, HIV 억제제 FN3-L35-T1144)은 용액-상 구조 및 안정성 정보가 약물 개발 결정에 중요한 입력이 될 수 있는 주요 약물 포맷이지만, 펩티드 모이어티는 종종 초적 시간 척도16,17,18,19,20에서 HDX-MS에 의해 약하게 안정하고 난치성일 뿐이다. . 초/분 도메인에서 표지를 갖는 창발적 HDX-MS 방법은 DNA G-사분면체에 대한 구조적 정보를 도출하는 것으로 나타났지만, 밀리초 HDX-MS21의 적용에 의해 이를 보다 다양한 올리고뉴클레오티드 구조로 확장할 수 있어야 한다.
HDX-MS 실험은 세 가지 상이한 수준에서 수행될 수 있다: (1) 상향식 (이에 의해 표지된 단백질은 단백질분해적으로 소화됨), (2) 중간-다운 (이에 의해 표지된 단백질은 단백질분해적으로 소화되고, 생성된 펩티드는 연질-단편화 기술에 의해 추가로 단편화됨), 및 (3) 하향식 (이에 의해 소프트-단편화 기술이 표지된 단백질을 직접 단편화함)22 . 따라서, 하위분자 HDX-MS 데이터는 우리가 단백질의 특정 영역에 대한 교환 거동을 국부화할 수 있게 해주므로, 그러한 실험에 대해 적절한 서열 커버리지를 갖는 것이 매우 중요하다. 임의의 HDX-MS 실험의 구조적 분해능은 소화 또는 연질 단편화시 단백질로부터 유래된 단백질 분해 펩티드 또는 단편의 수에 각각 의존한다. 위에서 설명한 세 가지 실험 유형 각각에서, 각 펩티드/단편에서의 아미드 교환의 변화는 단백질의 국부적인 영역의 거동을 나타내기 위해 단백질의 일차 구조에 다시 매핑된다. 가장 높은 구조적 분해능은 소프트 단편화를 통해 달성되지만, 이러한 실험에 대한 설명은 aSyn 단량체 입체 형태의 측정에 초점을 맞춘 현재 연구의 범위를 벗어납니다. 여기에 설명된 일반적으로 적용되는 "상향식" 워크플로를 통해 우수한 결과를 얻을 수 있습니다.
여기서, 절차는 (1) aSyn 샘플 및 HDX-MS 버퍼를 준비하고 처리하는 방법, (2) 상향식 HDX-MS 실험을 위한 펩티드 매핑을 수행하는 방법, (3) 생리학적 조건, 특히 밀리초 시간 영역에서 단량체성 aSyn에 대한 HDX-MS 데이터를 획득하는 방법(맞춤형 장비 사용; 밀리초 라벨링을 위한 대체 기기도 설명됨)에 대해 제공된다. (4) HDX-MS 데이터를 처리하고 분석하는 방법. 두 용액 조건에서 생리학적 pH (7.40)에서 단량체성 aSyn을 사용하는 방법이 여기에 예시된다. aSyn의 연구에 매우 유용하지만, 이러한 절차는 모든 단백질에 적용될 수 있으며 본질적으로 무질서한 단백질에만 국한되지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>1 &times; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 & m C18 열&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>186002346</td><td>분석 컬럼</td></tr><tr><td>Acetonitrile HPLC 등급 >99.9% HiPerSolv</td><td>VWR</td><td>20060.420</td><td>LC 이동상용</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>Salt for HDX buffers</td></tr><tr><td>Chronos</td><td>Axel Semrau(Waters Corporation에서 구매667006090</td><td></td><td>여러 HDX-MS 시료를 자동으로 주입할 수 있는 스케줄링 소프트웨어. HDXDirector 또는 LEAP Shell</td></tr>, <tr><td>염화중수소</td>, <td>Goss Scientific(Cambridge Isotope Laboratories)</td><td>DLM-2-50</td>, <td>HDX 라벨링 완충액:</td></tr><tr><td>산화중수소(99.9%)><sub2O)</td><td>Goss Scientific(Cambridge Isotope Laboratories)</td><td>DLM-4</td>, <td>중수소수</td></tr><tr><td>DynamX 3.0</td>, <td>Waters Corporation</td><td>, 176016027</td><td>동위원소 할당 및 중수소 혼입 계산</td></tr><tr><td>효소 BEH 펩신 컬럼</td><td>Waters Corporation</td><td>186007233</td><td>펩신 분해 컬럼</td></tr><tr><td>포름산, 99.0% LC/MS 등급</td><td>Fisher Scientific</td><td>10596814</td><td>LC 이동상용</td></tr><tr><td>구아니디늄 하이드로클로라이드</td><td>시그마 알드리치</td><td>RDD001-500G</td><td>Chaotrope/Denaturant</td></tr><tr><td>HDfleX</td><td>엑서터 대학교</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982 KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>HDX 버퍼용 염</td></tr><tr><td>LEAP HDX-2 CTC PAL 샘플링 로봇</td><td>Waters Corporation</td><td>725000637</td><td>자동시료주입기 로봇</td></tr><tr><td>Leucine enkephalin</td><td>Waters Corporation</td><td>186006013</td><td>질량 분석 록스프레이 보정용.</td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Waters Corporation</td><td>667004007</td><td>주입 방법 및 질량 분석기를 제어하는 소프트웨어</td></tr>, <tr><td>최대 회수 바이알</td><td>, Waters Corporation</td><td>600000670CV</td>, <td>100 팩, 캡 포함 - LEAP HDX-2</td></tr><tr><td>MgCl2</td>Sigma의 담금질에 사용됨, <td>Aldrich</td><td>M8266</td><td>Salt for HDX buffers</td></tr><tr><td>Millipore 0.22 &micro; m 주사기 필터</td><td>Millipore</td><td>N9CA7069B</td><td>주사기 필터</td></tr><tr><td>ms2min</td><td>Applied Photophysics Ltd</td><td>N/A</td><td>고속 혼합 담금질 흐름 밀리초 HDX 기기</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>HDX 버퍼용 소금</td></tr><tr><td>Peltier 온도 컨트롤러</td><td>LEAP Technologies Inc.</td><td>HP115-COOL/D</td><td>펠티에 컨트롤러는 LEAP 로봇에서 챔버의 정확한 온도를 설정합니다.</td></tr><tr><td>ProteinLynx Global Server 3.0</td><td>Waters Corporation</td><td>715001030</td><td>펩타이드 식별 소프트웨어. 대체 소프트웨어는 다른 공급업체에서 구할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>시약 냄비 뚜껑</td><td>Waters Corporation</td><td>186004632</td><td>100 팩</td></tr><tr><td>LEAP HDX-2 용 시약 냄비</td><td>Waters Corporation</td><td>186001420</td><td>100 팩 (뚜껑 제외) - LEAP HDX-2</td></tr><tr><td>중수소화 나트륨 (D2O에서 99.5 %),</td> <td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td> <td>DLM-57</td><td>HDX 라벨링 버퍼 스핀</td></tr><tr><td>필터 마이크로 원심 분리기 튜브 (3 kDa MWCO)의 완충액</td><td>Amicon (Merck Sigma Aldrich)</td><td>UFC5003</td><td>단백질을 농축하기 위한 마이크로 원심분리기 튜브. 이를 통해 HDX-MS 실험을 위한 버퍼 교환 및 정확한 시료 로딩이 용이합니다.</td></tr><tr><td>Synapt G2-Si 질량 분석기</td><td>Waters Corporation</td><td>176850035</td><td>질량 분석기</td></tr><tr><td>총 회수 바이알</td><td>Waters Corporation</td><td>600000671CV</td><td>100 팩 (캡 포함) - LEAP HDX-2</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253-250G</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T60040-B2005</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378-1KG</td><td>Chaotrope/Denaturant</td></tr><tr><td>VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 컬럼&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>186004623</td><td>트랩 탈염 컬럼</td></tr></tbody></table>

생리학적 조건하에서의 알파-시뉴클레인 구조역학 연구를 위한 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

알파 시누클레인 (aSyn)은 파킨슨 병의 특징 인 Lewy 몸과 신경 고리에 피브릴라 응집체가 풍부한 본질적으로 무질서한 단백질입니다. 그러나, 그의 생물학적 활성의 대부분은, 그것의 응집뿐만 아니라, 중앙적으로는 단백질의 가용성 단량체 형태를 포함한다. aSyn 생물학 및 병태생리학의 분자 메커니즘에 대한 해명은 구조적으로 고도로 분해된 방법을 필요로 하며 생물학적 조건에 민감하다. 그것의 본래 펼쳐진, 메타 안정한 구조는 단량체 aSyn을 많은 구조 생물학 기술에 다루기 어렵게 만든다. 여기에서는 이러한 접근법 중 하나의 적용이 설명됩니다 : aSyn과 같은 열역학적 안정성이 낮고 보호 인자가 약한 단백질을 연구하기 위해 밀리 초 시간 척도의 수소 / 중수소 교환 질량 분광법 (HDX-MS)이 설명됩니다. 밀리초 시간 척도에서 HDX-MS 데이터에는 aSyn의 용매 접근성 및 수소 결합 구조에 대한 정보가 포함되어 있으며, 이는 더 긴 라벨링 시간에 손실되어 궁극적으로 아미노산 수준까지 구조적 분해능을 산출합니다. 따라서 HDX-MS는 형태 역학 및 열역학, 분자 내 및 분자 간 상호 작용, 돌연변이 또는 환경 조건에 대한 변경의 구조적 영향에 대한 높은 구조적 및 시간적 해상도로 정보를 제공 할 수 있습니다. 광범위하게 적용가능하지만, 단량체 aSyn에서 밀리초 HDX-MS 측정을 획득, 분석 및 해석하는 방법이 입증된다.

본질적으로 무질서한 특성으로 인해 생리적 pH에서 aSyn의 복잡한 구조적 변화를 포착하는 것은 어렵습니다. HDX-MS는 백본 아미드 수소에서 동위원소 교환을 모니터링하여 단백질 형태 역학 및 상호 작용을 조사합니다. 높은 구조적 및 시간적 해상도에서이 정보를 얻는 몇 안되는 기술 중 하나입니다. 이 프로토콜은 광범위한 단백질 및 완충액 조건에 광범위하게 적용가능하며, 이는 단계 2.1.-2.2에 정의된 바와 같이 상태 A 및 상태 B8의 두 가지 다른 용액 조건에서 aSyn의 교환 동역학의 측정에 의해 예시된다.
먼저, aSyn에 대한 매핑 실험을 수행하였고, 도 1에 도시된 바와 같이 펩티드 커버리지 맵을 얻었다. 지도는 단백질 서열의 100%를 커버하고 3.79의 평균 중복성을 갖는다. 100% 커버리지 값은 단백질의 모든 아미노산이 단백질 소화물에서 발견되었음을 나타내며 aS...

단량체 알파 시누클레인의 구조적 앙상블은 생리 기능과 물리 화학적 특성에 영향을 미칩니다. 본 프로토콜은 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법 및 후속 데이터 분석을 수행하여 생리학적 조건 하에서 본질적으로 무질서한 단백질의 단량체에 대한 형태 정보를 결정하는 방법을 기술한다.

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

모든 유기체는 프로테옴에 장애가 있으며, 최대 33 %까지 추정됩니다.이 영역은 수소 / 중수소 교환 질량 분광법에 의해 관찰 가능하지만 밀리 초 시간 범위에서만 관찰 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은이 작업을 성공적으로 수행하는 방법을 보여줍니다. 이것은 완전히 자동화 된 분석 기술입니다.모든 것을 설정하고, 원하는 시간 측정을 프로그래밍하고, 가서 떠나십시오. 이 기술은 알파 시누클레인과 같은 본질적으로 무질서한 단백질의 특정 확인을 안정화시키는 화합물을 스크리닝하는 흥미로운 기회를 열어줍니다. 펩티드 매핑을 위한 샘플 준비를 시작하려면, 먼저 영하 80도 냉동고에서 저장된 알파-시누클레인 단백질 스톡의 바이알을 취한다.그리고 일단 해동되면, 0.22 마이크로미터 시린지 필터를 사용하여 여과한다. 그런 다음 Beer-Lambert의 법칙을 사용하여 단백질 농도를 결정하기 위해 218 나노 미터에서 용액의 흡광도를 측정하고 평형 버퍼로 단백질을 다섯 마이크로 몰의 최종 농도로 희석하십시오. 다음으로, 자동 시료 주입기 로봇을 설정하려면 5 마이크로 몰 단백질 용액 50 마이크로 리터를 총 회수 바이알에 추가하고 질량 분광계에 따라 수소 / 중수소 교환 또는 HDX 로봇 공학의 오른쪽 챔버의 샘플 위치에 바이알을 놓습니다.그런 다음 평형 버퍼 한 바이알과 펩신 세척 버퍼 두 바이알을 시약 위치에 넣고 좌측 챔버의 하나, 네 개, 다섯 개와 담금질 버퍼의 바이알 하나를 HDX 우측 챔버 내에 시약 위치에 놓고 펠티에 온도 조절기를 사용하여 섭씨 20도로 온도를 설정한다. 그런 다음 동일한 수의 총 회수 바이알 및 최대 회수 바이알을 각각 HDX 좌측 챔버 및 HDX 우측 챔버의 동일한 반응 위치에 첨가한다. 다음으로, 스케줄링 소프트웨어에서 적절한 LC 및 MS 방법을 사용하여 샘플 리스트를 설정하고 스케줄을 시작한다.최종 펩티드 커버리지 맵을 얻으려면 DynamX HDX 데이터 분석 소프트웨어에서 동위원소 할당을 수동으로 큐레이트하십시오. 고속 HDX 프로토타입 장비를 청소한 후 호환되는 HDX 소프트웨어의 그래픽 사용자 인터페이스를 열어 시스템을 초기화합니다. 샘플 챔버 및 담금질 챔버 온도로 각각 섭씨 20도, 섭씨 0.5도를 입력한 다음 세트를 클릭하여 새 온도를 적용합니다.장비를 청소하고 준비하려면 모든 입구에 LC/MS 등급의 물로 원심분리 튜브를 설치한 다음 적정기 배관 전달 탭에서 왼쪽 및 오른쪽 주사기를 모두 확인하고 튜브의 모든 잠복 기포가 사라질 때까지 프라임을 계속 클릭합니다. 주사기의 모든 상자를 확인하려면 먼저 매크로 탭으로 이동하여 주사기 홈 위치 보정을 클릭 한 다음 먼저 주사기 로드 루프 세척을 클릭 한 다음 모든 혼합 루프 볼륨을 씻으십시오. 버퍼 주사기에 거품이 있으면 주사기를 분리하고 수직으로 거품을 배출하여 가스를 제거합니다.제로 위치로 재보정하기 전에 주사기를 교체하십시오. HDX 실험을 위한 Fast HDX 프로토타입 장비를 설정하려면 먼저 왼쪽 적정 유입 튜브를 전체 회수 바이알에 삽입하십시오. 온도로 인한 올리고머화 및 응집을 방지하려면 튜브를 탁상 냉장고에 보관하십시오.다음으로, 50 밀리리터의 평형, 라벨링, 담금질 및 펩신 세척 버퍼를 기기의 오른쪽 및 왼쪽 챔버의 각 버퍼 입구에 첨가 한 다음 50 밀리리터의 컬럼 세척 버퍼를 펩신 세척 입구에 첨가하십시오. 단백질 및 컬럼 세척 라인을 프라이밍하려면 적정기 배관 전달 탭에서 오른쪽 및 왼쪽 주사기를 확인하고 프라임을 한 번 클릭합니다. 앞에서 설명한 대로 주사기의 모든 상자를 확인한 후 수동 담금질 흐름 탭으로 이동하여 필요한 설정을 입력합니다.시간 코스 실험의 경우 기호 점 단추를 사용하여 시간을 밀리초 단위로 입력합니다. 그런 다음 트랩 시간을 3으로 설정하고 HPLC가 트랩 시간과 실행 시간을 더한 1.5 분을 기다립니다. 샘플 실행 사이에 빈 실험이 실행되는 경우 각 샘플 실행 후 빈 실행에 대한 획득 소프트웨어에 항목을 확인한 후 빈 실행 상자를 클릭합니다.샘플 목록이 준비되고 적절한 항목이 강조 표시되면 소프트웨어에서 재생 및 빠른 HDX를 클릭하여 실행을 시작합니다. 데이터 처리를 위해 펩티드 매핑 실험에서 스펙트럼으로 할당된 펩티드 파일의 파일 메뉴를 열고 DynamX 소프트웨어에서 열기를 클릭한 다음 원시 파일을 DynamX 소프트웨어로 가져옵니다. 데이터 메뉴를 연 후 MS 파일을 클릭하십시오.연구되는 각 단백질 조건에 대한 상태를 만들려면 새 상태를 클릭하십시오. 각 HDX 시점을 추가하려면 새 노출을 클릭한 다음 새 원시를 클릭합니다. 원시 파일을 가져오려면 각 파일을 올바른 위치로 드래그하고 완료되면 확인을 클릭합니다.동위원소를 자동으로 할당한 후 동위원소 할당을 수동으로 큐레이트하여 높은 데이터 품질을 보장합니다. 원고에 설명된 대로 열 순서를 사용하여 csv 파일에서 클러스터 데이터를 내보냅니다. 질량 측정 소프트웨어에서 데이터 메뉴를 열고 클러스터 데이터 내보내기를 클릭하십시오.데이터 분석을 위해 먼저 내보낸 클러스터된 데이터를 HDX 분석 소프트웨어 HDfleX에 로드합니다. 모든 실험 및 상태에 대한 실험 데이터를 적합하게하려면 적절한 역 교환 보정 방법을 선택하여 HDX 반응에 대해 관찰 된 속도 상수를 얻으십시오. 그런 다음 HDfleX에서 선호되는 방법을 사용하여 전역 유의 임계값을 계산하고 하이브리드 유의 테스트를 수행하여 비교된 상태 간의 유의한 차이를 확인합니다.알파-시누클레인에 대한 매핑 실험은 3.79의 평균 중복성으로 단백질 서열의 100%를 커버하는 펩티드 커버리지 맵을 생성하였다. 더욱이, 이 프로토콜은 알파-시누클레인의 상이한 펩티드에 대한 중수소 흡수 곡선의 생성을 가능하게 하였고, 이는 그 후 적합 및 역교환 보정된 그래프로 표현되었다. 알파 시누클레인의 대부분의 수소 / 중수소 교환이 일초에 의해 이루어졌다는 것이 분명했습니다.알파-시누클레인의 상태 A와 B 사이의 형태적 차이는 또한 펩티드 및 아미노산 수준 둘 다에서 상태 B에 의한 더 높은 중수소 흡수로부터 명백하였다. 이러한 민감한 기술의 경우 데이터를 비교할 때 강력한 통계적 유의성 검정을 사용하는 것이 중요합니다. 여기에서는 소프트웨어 HDfleX를 사용했습니다.

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연구

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Neuroscience

신경과학

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