Name: 유전자 치료 애플리케이션을 위한 조혈 줄기 및 전구 세포의 CRISPR/Cas9 유전자 편집 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 학습하세요 조혈 줄기 및 전구 세포의 CRISPR/Cas9 유전자 편집 프로토콜을 통해 체외 배양 중 줄기세포 특성을 보존하고 유전자 수정 세포의 이식 효율을 향상시키는 방법을. 이 기술은 단일 유전자 질환 및 HIV와 같은 감염성 질환 치료에 활용됩니다.

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저자는 CSCR의 유세포 분석 시설 및 동물 시설의 직원을 인정하고자합니다. A. C.는 ICMR-SRF 펠로우십, K. V. K.는 DST-INSPIRE 펠로우십, PB는 CSIR-JRF 펠로우십에서 자금을 지원합니다. 이 작업은 인도 정부 생명공학부(보조금 번호 BT/PR26901/MED/31/377/2017 및 BT/PR31616/MED/31/408/2019)에서 자금을 지원했습니다.

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<li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonirradiated+NOD%2CB6.SCID+Il2r%CE%B3-%2F-+Kit%28W41%2FW41%29+%28NBSGW%29+mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li>
<li>Leonard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+busulfan+reduces+human+CD34%2B+cell+doses+required+for+engraftment+in+c-kit+mutant+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).</li>
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<li>Audigé, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+leukocyte+reconstitution+in+NSG+mice+transplanted+with+human+cord+blood+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells.</a> BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).</li>
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<li>Ngom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UM171+enhances+lentiviral+gene+transfer+and+recovery+of+primitive+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).</li>
<li>Park, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+proliferation+of+human+umbilical+cord+blood-derived+CD34%2B+hematopoietic+stem+cells+by+a+combination+of+hyper-interleukin-6+and+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214(2022).</li>
<li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-based+gene+therapy+of+hematopoietic+stem+cells+in+Wiskott-Aldrich+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151(2013).</li>
<li>Rai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cell+culture+conditions+promote+ex-vivo+manipulation+and+expansion+of+primitive+hematopoietic+stem+cells+for+therapeutic+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 존재하지 않는다고 선언합니다.

HSPC 유전자 치료의 성공적인 결과는 주로 이식편에서 생착 가능한 HSC의 품질과 양에 달려 있습니다. 그러나 HSC의 기능적 특성은 체외 배양 및 유전자 조작 절차와 관련된 독성을 포함하여 유전자 치료 제품의 준비 단계에서 크게 영향을받습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 우리는 생체 외 배양에서 CD34+CD133+CD90+ HSC의 줄기를 유지하는 이상적인 HSPC 배양 조건을 확인했습니다. 많은 연구 그룹은 시험관 내23,24에서 제대혈(UCB) HSPC를 확장하기 위해 SR1 또는 UM171 또는 기타 분자를 독립형 분자로 사용했습니다. 이전 연구에서는 SR1과 UM17125의 조합을 사용했습니다. 배양 배지의 소분자 및 사이토카인은 동원된 성인 HSPC 및 자가 유...

동종 이식 환경에서 인간 백혈구 항원(HLA)과 일치하는 기증자에 접근할 수 없고 매우 다재다능하고 안전한 유전 공학 도구의 급속한 개발로 인해 자가 조혈모세포 이식(HSCT)은 유전성혈액 질환에 대한 치료 전략이 되었습니다1,2. 자가 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 유전자 치료는 환자의 HSPC 수집, 유전자 조작, 질병 유발 돌연변이의 교정 및 유전자 교정 된 HSPC를 환자에게 이식하는 것을 포함합니다 3,4. 그러나 유전자 치료의 성공적인 결과는 이식 가능한 유전자 변형 이식편의 품질에 달려 있습니다. HSPC의 유전자 조작 단계 및 생체 외 배양은 장기 조혈 줄기 세포 (LT-HSC)의 빈도를 감소시켜 이식편의 품질에 영향을 미치므로 유전자 조작 HSPC 2,5,6을 다량 주입해야합니다.
SR1 및 UM171을 포함한 여러 소분자가 현재 제대혈 HSPC를 강력하게 확장하기 위해 사용되고 있습니다 7,8. 성인 HSPC의 경우, 동원시 얻은 더 높은 세포 수율로 인해 강력한 확장이 필요하지 않습니다. 그러나 생체 외 배양에서 분리된 HSPC의 줄기를 유지하는 것은 유전자 치료 응용 분야에 매우 중요합니다. 따라서 조혈모세포(HSC)의 배양 농축에 초점을 맞춘 접근법은 레스베라트롤, UM729 및 SR1(RUS)7과 같은 소분자의 조합을 사용하여 개발됩니다. 최적화된 HSPC 배양 조건은 HSC의 농축을 촉진하여 생체 내에서 유전자 변형 HSC의 빈도를 증가시키고 다량의 HSPC를 조작하는 유전자의 필요성을 줄여 비용 효율적인 유전자치료 접근법을 용이하게 합니다8.
여기에서는 생체 내에서 유전자 편집 세포의 주입 및 분석과 함께 HSPC 배양을 위한 포괄적인 프로토콜이 설명됩니다.

<table><tbody><tr><td>4D-핵세포&reg; X 유닛</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>AAF-1003X</td><td></td></tr><tr><td>4D-핵융합기&거래; X Kit ( 16-well Nucleocuvette&trade; 스트립)</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD45 APC</td><td>BD BIOSCIENCE&nbsp;</td><td>555485&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>반인간 CD13 PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 555394 <tr><td>반인간 CD19 PerCP</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 340421 <tr><td>반인간 CD3 PE-Cy7</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>557749</td><td></td></tr><tr><td>반인간 CD90 APC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 561971 <tr><td>반인간 CD133/1&nbsp;</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-113-673</td><td></td></tr><tr><td>안티-휴먼 CD34 PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 348057 <tr><td>안티-마우스 CD45.1 PerCP-Cy5</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>560580</td><td></td></tr><tr><td>혈액 방사선기-2000</td><td>&nbsp; BRIT (인도 생명공학과)</td><td>BI 2000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시 (델타 표면 처리 6웰 플레이트)</td><td>NUNC (THERMO SCIENTIFIC)</td><td></td><td></td></tr>140675 <tr><td>CrysoStor CS10</td><td>BioLife solutions</td><td>#07952</td><td></td></tr><tr><td>Busulfan</td><td>CELON LABS (60mg/10mL)</td><td>-&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Guide-it 재조합 Cas9</td><td>TAKARA BIO</td><td>632640</td><td></td></tr><tr><td>Cas9-eGFP</td><td>SIGMA</td><td>C120040&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 원심분리기 튜브-15ml</td><td>코닝</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 원심분리기 튜브-50ml</td><td>NUNC (THERMO SCIENTIFIC)</td><td></td><td></td></tr>339652 <tr><td>DMSO</td><td>MPBIO</td><td>219605590</td><td></td></tr><tr><td>DNAase</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>6469</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s 인산염 완충 식염수- 1X</td><td>HYCLONE</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; Human CD34 Positive Selection Kit II</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>17856</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 자석</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>전기영동 유닛</td><td>ORANGE INDIA</td><td>HDS0036</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td></td><td></td></tr> 10270106 <tr><td>유세포 분석기 &ndash; ARIA III</td><td>BD 바이오사이언스</td><td>-&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>플로우조&nbsp;</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>Flt3-L</td><td>PEPROTECH</td><td>300-19-1000</td><td></td></tr><tr><td>겔 이미징 시스템</td><td>CELL BIOSCIENCES</td><td>11630453</td><td></td></tr><tr><td>HighPrep DTR 시약</td><td>MAGBIOGENOMICS</td><td>DT-70005</td><td></td></tr><tr><td>Human BD Fc Block</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>PEPROTECH</td><td>200-06-50</td><td></td></tr><tr><td>IMDM 매체</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>적외선 램프</td><td>MURPHY-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기 6mm 31G</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 324903 <tr><td>케타민</td><td>KETMIN 50</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>로딩 염료 6X</td><td>TAKARA BIO</td><td>9156</td><td></td></tr><tr><td>림프렙</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>7851</td><td></td></tr><tr><td>마우스 레스트레이너</td><td>AVANTOR</td><td>TV-150</td><td></td></tr><tr><td>나노 드롭 분광 광도계</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 세포 계수 챔버</td><td>ROHEM INSTRUMENTS</td><td>CC-3073</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-PRKDCSCID IL2RGTM1Wjl/SzJ (NSG)</td><td>잭슨 연구소</td><td>RRID:IMSR_JAX:005557</td><td></td></tr><tr><td>NOD,B6. SCID Il2r&gamma; &빼기;/&빼기; KitW41/W41 (NBSGW)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID:IMSR_JAX:026622</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 델타 6웰 플레이트</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 라운드 바텀 튜브</td><td>BD</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>P3 일차 세포 핵 절제 용액</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>PBP3-02250</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>FISHER SCIENTIFIC</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>PCR 클린업 키트</td><td>TAKARA BIO</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>마우스 파이 케이지</td><td>FISCHER SCIENTIFIC</td><td>50-195-5140</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 둥근 바닥 튜브 (12 x 75 mm)</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>38007</td><td></td></tr><tr><td>Primer3</td><td>Whitehead Institute for Biomedical Research</td><td><a href="https://primer3.ut.ee/">https://primer3.ut.ee/</a></td><td></td></tr><tr><td>퀵추출&트레이드; DNA 추출 솔루션</td><td>Lucigen</td><td>QE09050</td><td></td></tr><tr><td>Reserveratrol</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72862</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>300-07-1000</td><td></td></tr><tr><td>SFEM-II</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>9655</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA</td><td>SYNTHEGO</td><td>-&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SPINWIN</td><td>TARSON</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StemReginin 1</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72342</td><td></td></tr><tr><td>ICE 분석 도구</td><td>SYNTHEGO</td><<td>a href="https://ice.synthego.com/">https://ice.synthego.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA 버퍼 용액 (TE) 1X</td><td>SYNTHEGO</td><td>gRNA와 함께 제공&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>APPLIED BIOSYSTEMS</td><td>4375305</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PEPROTECH</td><td>300-18-1000</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>HIMEDIA LABS</td><td>TCL046</td><td></td></tr><tr><td>UM171</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72914</td><td></td></tr><tr><td>UM729</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72332</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>XYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

유전자 치료 애플리케이션을 위한 조혈 줄기 및 전구 세포의 crispr/cas9 유전자 편집

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9는 다양한 유전적 돌연변이를 교정하기 위해 널리 채택된 매우 다재다능하고 효율적인 유전자 편집 도구입니다. 시험관 내에서 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 유전자 조작의 타당성은 HSPC를 유전자 치료를위한 이상적인 표적 세포로 만듭니다. 그러나 HSPC는 생체 외 배양에서 생착 및 다중 계통 재 집단 잠재력을 적당히 잃습니다. 본 연구에서, HSPC 생착을 개선하고 생체내에서 증가된 수의 유전자-변형 세포를 생성하는 이상적인 배양 조건이 기술된다. 현재 보고서는 배양 배지 유형, 고유한 저분자 칵테일 보충제, 사이토카인 농도, 세포 배양 플레이트 및 배양 밀도를 포함하여 최적화된 체외 배양 조건을 표시합니다. 그 외에도 유전자 편집 이벤트의 검증과 함께 최적화된 HSPC 유전자 편집 절차가 제공됩니다. 생체내 검증을 위해, 마우스 수용자에서의 유전자 편집된 HSPC 주입 및 생착 후 분석이 표시된다. 결과는 배양 시스템이 시험관 내에서 기능성 HSC의 빈도를 증가시켜 생체 내에서 유전자 편집 세포의 강력한 생착을 초래한다는 것을 입증했습니다.

본 연구는 생체 외 배양에서 CD34+CD133+CD90+ HSC의 보유를 용이하게 하는 이상적인 HSPC 배양 조건을 식별합니다. 유전자 변형 HSC의 향상된 생성과 함께 HSC의 배양 농축을 입증하기 위해 PBMNC 분리, CD34+ 세포 정제, 배양, 유전자 편집, 이식, 생착 특성화 및 생체 내 유전자 변형 세포를 위한 최적화된 절차가 제공됩니다(그림 1). 정제 후, HSPC 마커를 확인하기 위해 유세포 분석 평가를 수행하고, HSPC를 72시간 동안 배양하였다. 배양 72시간 후, HSPC를 Cas9 RNP로 핵핵화하고 추가로 2일 동안 배양하였다. RUS 칵테일을 함유한 최적화된 배양 조건은 CD34+CD133+CD90+ HSC의 생존력 증가와 더 높은 빈도 및 유전자 편집 빈도 증가를 보여주었습...

본 프로토콜은 생체 내에서 유전자 편집 세포의 강력한 생착을 위한 최적화된 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC) 배양 절차를 설명합니다.

유전자 치료 애플리케이션을 위한 조혈 줄기 및 전구 세포의 CRISPR/Cas9 유전자 편집

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

생체 외 배양은 조혈 줄기 및 전구 세포의 재증식 잠재력을 방해할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 배양 중 줄기를 보존하여 생체 내에서 유전자 변형 세포의 빈도를 개선합니다. 조혈모세포 유전자 치료는 현재 단일성 질환 및 HIV와 같은 전염병에 사용되고 있습니다.HSPC 유전자 치료 프로토콜은 생체 외 배양에 크게 의존합니다. 당사의 프로토콜은 생체 외 배양을 사용하는 모든 절차와 호환되어야 합니다. 이 프로토콜을 시연하는 것은 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Vigneshwaran Venkatesan이 될 것입니다.HSPC를 분리한 후 사이토카인과 소분자 레스베라트롤, UM729 및 스템레게닌1을 포함하는 줄기세포 배양 배지에서 배양합니다. 유전자 편집 전에 써모믹서를 섭씨 37도로 설정하여 가이드 RNA를 재구성한 다음 TE 버퍼를 섭씨 37도에서 10분 동안 예열합니다. 합성 화학적으로 변형 된 sgRNA 바이알을 섭씨 4도에서 1 분 동안 11, 000 회 g로 원심 분리하고 1.5 나노 몰의 동결 건조 된 sgRNA가 들어있는 바이알에 15 마이크로 리터의 TE 버퍼를 첨가하고 부드럽게 소용돌이 치며 혼합하여 마이크로 리터당 100 피코 몰의 최종 농도를 얻습니다.ThermoMixer에서 섭씨 37도에서 30-40 초 동안 최소 흔들림으로 바이알을 배양하십시오. 측면에 있는 바이알을 부드럽게 두드리고 바이알을 돌려 15마이크로리터의 sgRNA를 수집합니다. 1 마이크로 리터 분취량을 만들어 섭씨 영하 80도에서 최대 1 년 동안 보관하십시오.핵형성의 경우, 200배 g에서 상온에서 5분 동안 원심분리하여 5번째 세포에 10번 펠렛을 2번 올렸다. 상청액이 폐기되면 펠릿을 20 마이크로리터의 완충액에 재현탁합니다. 세포 현탁액을 준비된 RNP 복합체와 부드럽게 혼합하여 기포를 피하십시오.이제 현탁액을 상용 뉴클레오펙션 스트립으로 옮기고 펄스 코드 DZ-100을 선택하여 4D-뉴클레오펙터를 사용하여 세포를 전기천공합니다. 뉴클레오펙션 스트립의 전기천공된 세포에 100마이크로리터의 사전 배양된 배양 배지를 추가하고 실온에서 10분 동안 세포를 방해받지 않고 그대로 둡니다. 배양이 끝나면 실험 요구 사항에 따라 내용물을 배양 용기로 옮깁니다.NSG 마우스를 HSPC 이식 6 내지 8시간 내에 파이 케이지에 넣는다. 시판되는 조사기를 사용하여 마우스를 3.5 회색으로 조사한다. NBSGW의 경우, HSPC 이식 48시간 전에 체중 킬로그램당 12.5 밀리그램의 용량으로 부술판을 복강내 주사하여 6 내지 8주령의 수컷 및 암컷 마우스를 예비조건화하였다.마우스 1마리를 주입하기 위해, 5번째 세포를 1.5밀리리터 튜브에 6회 10번 펠릿으로 200회 g에서 5분간 원심분리한다. 실온에서. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 부드럽게 피펫팅하고 세포 펠릿을 100마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다.사전 조절된 NSG 또는 NBSGW 마우스를 마우스 억제기에 넣고 꼬리 정맥 주사로 HSPC를 주입합니다. 마우스 꼬리를 잡고 플러그를 부드럽게 밀어 마우스를 제지합니다. 70 % 에탄올로 마우스 꼬리를 부드럽게 닦으십시오.31 게이지 인슐린 주사기를 사용하여 100 마이크로리터의 세포 현탁액을 흡인합니다. 이제 적외선 램프의 빛을 꼬리로 30-40 초 동안 향하게하여 마우스의 몸 부위를 티슈 페이퍼 주름으로 덮습니다. 주사기로 대패 축에 꼬리를 유지하려면 왼쪽 집게 손가락으로 들어 올리십시오.바늘의 베벨 부분을 왼쪽 또는 오른쪽 꼬리 꼬리 정맥에 20도 각도로 부드럽게 삽입하십시오. 플런저를 밀어 세포 현탁액을 정맥에 주입하고 티슈 페이퍼로 피어싱 부위 근처에 부드러운 압력을 가하고 바늘을 빼냅니다. 마취 후 동물을 복부 누운 자세에 놓고 쥐를 부드럽게 긁어 눈을 뜨면 눈의 지구가 약간 튀어 나오도록합니다.목초지 피펫을 30-45도 각도로 니팅 멤브레인 아래 눈의 내측 캔서스에 부드럽게 삽입합니다. 파스퇴르 피펫을 적절한 위치에 놓은 후 튜브에 약간의 압력을 가하고 튜브를 부드럽게 회전시키기 시작합니다. 50-80 마이크로 리터의 말초 혈액을 수집 한 후 눈의 내측 칸투스에서 피펫을 부드럽게 빼냅니다.안락사 후 요도에서 1cm 위에 수직 절개를하고 횡격막 아래 1cm까지 연장하십시오. 절개 부위의 모서리를 수평으로 잘라 복부를 엽니 다. 대퇴골과 경골을 해부 한 후 가위를 사용하여 대퇴골과 경골에 부착 된 연조직을 제거하고 티슈 페이퍼로 뼈를 부드럽게 문지릅니다.메스를 사용하여 0.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브의 바닥에 직경이 0.2cm 이하인 작은 구멍을 만드십시오. 메스를 사용하여 뼈의 근위 끝을 제거하고 절단면이 0.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브의 구멍을 향하도록 뼈를 놓습니다. 이제 100 마이크로 리터의 멸균 PBS가 들어있는 1.5 밀리리터 튜브에 뼈가있는 0.5 밀리리터 튜브를 놓습니다.뚜껑을 닫고 실온에서 멸균 조건에서 3 분 동안 200 회 g으로 튜브를 돌리고 빈 골수 구멍이있는 뼈가 들어있는 0.5 밀리리터 튜브를 버립니다. 골수가 들어있는 1.5 밀리리터 반응 튜브에 1 밀리리터의 PBS를 넣은 다음 1 밀리리터 피펫을 사용하여 세포를 10 번 부드럽게 재현탁시킵니다. 1 밀리리터의 세포 현탁액을 9 밀리리터의 적혈구 용해 완충액이 들어있는 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다.2 분마다 튜브를 부드럽게 뒤집어 7 분 동안 얼음에서 세포를 배양하십시오. 인큐베이션 후, 튜브를 실온에서 5분 동안 200회 g으로 원심분리하고, 투명한 옅은 백색 펠릿이 관찰될 때까지 세척을 반복한다. 살아있는 세포 및 CD34 양성, CD90 양성 세포의 빈도는 핵 형성 48 시간 후에 RUS 그룹에서 증가했다.72시간 후, DMSO 처리군에 비해 RUS-처리된 군에서 인델의 백분율 및 빈도가 증가하여 유전자 편집의 증가를 시사하였다. CD34 양성, CD90 양성 세포 및 총 유핵 세포의 절대 수는 편집 후 48 시간에 상당히 높습니다. NSG 마우스에서 인간 CD45 양성 세포의 유세포 분석 결과는 배양 조건에서 증가 된 생착을 보였다.마우스 BM 세포에서 유전자 편집 빈도를 분석한 결과, RUS 보충 배양 조건에서 유전자 편집 HSPC의 생착이 증가한 것으로 나타났습니다. HSPC를 mL 당 200, 000 세포의 합류점에서 배양하는 것은 기능적 줄기 세포를 개선하는 데 중요합니다. 제대혈 줄기 세포와 iSPC 유래 줄기 세포를 증폭하는 것은이 프로토콜이 테스트되는 새로운 영역입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 인간 T 세포에서 유전자 편집을 수행하는 방법을 보여줍니다. 1차 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물은 CRISPR-Cas9 리보핵단백질 복합체와 결합되어 knockout을 위한 특정 유전자를 표적으로 합니다. 전기천공법(electroporation) 시 sgRNA는 Cas9을 타겟 DNA 염기서열로 유도하여 정밀한 절단을 생성합니다. 그런 다음 이러한 절단은 세포의 비상동 말단 결합 메커니즘에 의해 복구되어 유전자 녹아웃으로 이어집니다.

T 세포의 유전자 편집을 위한 CRISPR-Cas9 기술

타겟된 유전자 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 편집 크게 유전자의 생물 학적 기능에 대 한 이해를 촉진 했다. 여기, 우리가 그들의 종양 활동을 공부 하기 위하여 모델 calreticulin 돌연변이 cytokine 종속 조 혈 모 세포에서에 CRISPR/Cas9 방법론을 활용 합니다.

CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 돌연변이 Calreticulin Cytokine 종속 조 혈 모 세포에서의 종양 활동을 조사 하기 위해 편집

프로토콜에 대 한 빠른 마우스에서 유전자 장애 CRISPR/Cas9-중재 하 고 인간의 기본 조 혈 모 세포가이 문서에서 설명 하는. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins sgRNAs 녹음 방송 생체 외에서 그리고 상업적인 Cas9를 통해 생성 된 electroporation 통해 소개 된다. 높은 편집 효율성 제한 시간 및 금융 비용으로 달성 된다.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

여기에 제시된 것은 튜브 전기포공을 이용한 포유류 세포에서 효율적인 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질 매개 유전자 편집을 위한 프로토콜이다.

CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질-튜브 전기포공에 의한 정밀 유전자 편집

여기에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 CAR-T 세포를 유전적으로 편집하는 프로토콜을 제시합니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 CAR-T 셀에서 GM-CSF를 제거합니다.

설명된 것은 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 고효율 게놈 편집을 위한 프로토콜로 조혈 시스템 별 유전자 수정을 통해 마우스 모델 시스템을 신속하게 개발합니다.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

여기서, 우리는 CAR-T 세포를 수정하기 위하여 CRISPR Cas 기술을 사용하여 1 차적인 인간 T 세포에 있는 유전자 편집을 위한 프로토콜을 제시합니다.

인간 CRISPR-엔지니어링 CAR-T 셀 생산

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 체세포 돌연변이를 충실하게 모델링하는 새로운 전략은 조혈 줄기 세포 생물학 및 혈액 악성 종양을 더 잘 연구하는 데 필요합니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9의 사용과 이중 rAAV 공여체 형질도입을 결합하여 HSPC에서 이형접합체 기능 획득 돌연변이를 모델링하는 프로토콜이 설명됩니다.

인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 발암성 이형접합체 기능 획득 돌연변이 공학

THP-1 세포주는 다양한 생물학 관련 연구 분야에서 인간 단핵구/대식세포의 기능을 조사하기 위한 모델로 널리 사용됩니다. 이 논문에서는 효율적인 CRISPR-Cas9 기반 엔지니어링 및 단일 세포 클론 분리를 위한 프로토콜에 대해 설명하여 강력하고 재현 가능한 표현형 데이터를 생성할 수 있습니다.

THP-1 세포의 전기천공법 기반 CRISPR-Cas9 매개 유전자 녹아웃 및 단일 세포 클론 분리

여기에서는 CRISPR/Cas9 기술과 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석을 통합하여 조혈 줄기 세포 및 전구 세포의 비정상적인 증식 능력에 중요한 후보 유전자를 식별하는 프로토콜을 제시합니다.

CRISPR/Cas9 기술과 세포 계수를 결합한 조혈 줄기 및 전구 세포의 비정상 성장 관련 유전자 평가

학습하세요 조혈 줄기 및 전구 세포의 CRISPR/Cas9 유전자 편집 프로토콜을 통해 체외 배양 중 줄기세포 특성을 보존하고 유전자 수정 세포의 이식 효율을 향상시키는 방법을. 이 기술은 단일 유전자 질환 및 HIV와 같은 감염성 질환 치료에 활용됩니다.

유전자 치료 애플리케이션을 위한 조혈 줄기 및 전구 세포의 CRISPR/Cas9 유전자 편집

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