맞춤형 관류 생물 반응기에서 돼지 혈관 플랩의 조달 및 관류-탈세포화

이 방법은 3 개의 혈관 화 된 돼지 피판의 외과 적 조달과 그 이후의 관류 탈세포 화를 설명합니다. 이 방법은 조직 탈세포화 및 재세포화 접근법을 사용하여 돼지 플랩을 재생하려는 노력을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간단한 조립 생물 반응기 설정으로 다양한 혈관 화 된 돼지 플랩에 걸쳐 풍부한 탈세포 화를 달성 할 수있는 다양성입니다.

여기에 설명된 기술은 재건 수술에서 돼지 피판을 사용하는 잠재적인 조직 공학 솔루션으로서 다른 혈관 피판에 광범위하게 적용될 수 있습니다. 시작하려면 LS50 백금 코팅 실리콘 튜브의 약 16cm를 측정하여 유입 및 유출 튜브를 만드십시오. 한쪽 끝을 노란색 3스톱 펌프 튜브에 연결하고 다른 쪽 끝을 멸균 2밀리리터 혈청학적 피펫에 연결하여 세제 저장소에서 바이오리액터 챔버로 향수를 운반합니다.

챔버와 튜브를 개별 포장된 멸균 포장으로 오토클레이브합니다. omental 플랩 조달의 경우 12 주 된 마취 된 요크셔 돼지를 앙와위 자세에 놓은 다음 일반적인 멸균 방식으로 복부를 준비하십시오. 복부에 들어가 위 두부를 동원하기 위해 xipho-umst 개복술을 수행하고 omentum을 수술 부위에 놓습니다.

왼쪽 위 배체 동맥이 비장 동맥과 합류하는 더 큰 곡률의 왼쪽에서 시작하여 직선 Stevens 건절개 가위를 사용하여 왼쪽 위 배체 동맥과 정맥을 골격화합니다. 그런 다음 수술 용 넥타이 또는 클립을 사용하여 별도로 분리하고 나눕니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 위의 더 큰 곡률을 따라 진행하여 omentum에서 발생하는 짧은 혈관 가지를 결찰하고 분할하여 위의 더 큰 곡률을 공급합니다.

오른쪽 위 상피 배혈 혈관과 위 십이지장 동맥의 교차점이 발생할 때까지 더 큰 omentum의 동원을 계속하십시오. 그런 다음 오른쪽 위 상피 동맥과 정맥을 결찰하고 분할하여 omental 플랩을 풀고 나중에 플랩 캐뉼러를 허용합니다. 텐서 근막 라타 플랩 조달의 경우 돼지를 측면 욕창 위치에 놓습니다.

전방 상장골 척추 또는 ASIS에서 측면 슬개골쪽으로 내부 플랩 경계를 표시하고 꼬리쪽으로 약 8-10cm 후방 경계를 표시하십시오. 메스를 사용하여 슬개골의 말단 가장자리를 날카롭게 절개하십시오. 피하 조직을 통한 절개를 심화시켜 대퇴직근 위에있는 근막에 도달하고 표시된 경계를 따라 ASIS쪽으로 절개를 계속합니다.

근막 플랩 만 분리하려면 밑에있는 근막 층에서 위에 놓인 피부 구성 요소를 제거하십시오. 그런 다음 작은 천공기 혈관을 피부에 결찰하거나 소작하십시오. 플랩의 말단 경계로 돌아가서 깊은 근막을 절개하십시오.

밑에있는 광대 한 측면 근육에서 근막을 ASIS쪽으로 동원합니다. 척추를 깊은 대퇴 혈관쪽으로 추적 한 후, 근막 피판을 공급하는 외측 대퇴 동맥과 정맥을 골격화합니다. 그런 다음 플랩 혈관을 근위부로 결찰하고 분할하여 깊은 대퇴 혈관에 합류하고 나중에 캐뉼러를 허용합니다.

방사형 팔뚝 플랩 조달의 경우 확장 된 돼지 팔뚝의 방사형 측면에 3 x 3cm 정사각형을 표시하십시오. 근위 플랩 마진의 중간 점과 전방 포사 사이에 선을 그려 요골 동맥 척추의 대략적인 경로를 나타냅니다. 촉진으로 동맥 경로를 확인하십시오.

다음으로, 상완 전 근막까지 깊이가있는 원위부에서 메스를 사용하여 피부를 절개하십시오. 원위 요골 동맥과 그 대정맥이 만날 때까지 tenotomy 가위로 둔하게 해부하십시오. 그런 다음 동맥과 정맥을 수술 용 넥타이 또는 클립으로 분리하고 나눕니다.

표시된 피부 사각형의 방사형 및 척골 가장자리에서 피부 절개를 계속하십시오. 그런 다음 수술 칼날이나 소작기로 밑에있는 요골 뼈에서 플랩을 동원하여 척골에서 반경 방향으로 진행하면서 피부 플랩을 앞쪽 포사쪽으로 근위로 올립니다. tenotomy 가위를 사용하여 요골 동맥과 대정맥을 근위부에서 골격화하여 상완 동맥과 정맥을 각각 연결합니다.

혈관 척추를 분리하기 위해 주변 섬유 지방 조직에서 혈관을 해부합니다. 그런 다음 동맥과 정맥을 별도로 결찰하고 나누어 방사형 팔뚝 플랩을 자유롭게합니다. 다음으로, 3-0 실크 타이로 고정 된 20-24 게이지 혈관 카테터로 척추 혈관을 캐뉼러합니다.

명확한 정맥 유출이 관찰 될 때까지 헤파린 화 된 식염수를 플랩 동맥 캐뉼라로 플러시하십시오. 층류 생물 안전 캐비닛에서 작업하는 동안 생물 반응기 조직 챔버에 플랩을 놓습니다. 잔류 공기를 제거하고 플랩 동맥 캐뉼러와 수 루어 커넥터 사이의 연결을 허용하도록 플랩을 배열하기 위해 멸균 헤파린 화 식염수가있는 프라임 유입 튜브.

그런 다음 멸균 지혈제를 사용하여 동맥 캐뉼러를 커넥터에 나사로 고정하십시오. 그런 다음 스톱 콕을 통해 헤파린 화 된 식염수를 플러시하여 루어 연결에 누출이없고 플롭이 정맥 유출의 증거로 관류 될 수 있는지 확인하십시오. 티슈 챔버 뚜껑을 닫은 후 노란색 3스톱 펌프 튜브가 있는 유입 튜브를 티슈 챔버의 유입 스톱콕에 연결합니다.

또한 관류 압력 모니터링을 위해 인라인 압력 센서 변환기를 유입 3방향 스톱콕에 부착합니다. 그런 다음 유입 연동 펌프를 켜고 초기 화면에서 화살표를 사용하여 세 번째 탭으로 이동하여 튜브 ID를 1.85mm로 설정합니다. 그런 다음 두 번째 탭에서 관류 속도를 설정합니다.

전달 모드로서의 입력 속도는 분당 2 밀리리터로 설정됩니다. 화면에 표시된 대로 흐름 방향이 올바른지 확인합니다. 호환되는 카세트를 사용하여 3-스톱 펌프 튜브를 연동 펌프에 로드합니다.

유출 펌프 설정을 분당 4밀리리터의 속도로 설정합니다. 노란색 3스톱 펌프 튜브가 있는 유출 튜브를 조직 챔버의 유출 스톱콕에 연결합니다. 그런 다음 3스톱 펌프 튜브를 연동 펌프에 로드하고 각 펌프의 전원 버튼을 눌러 두 펌프의 흐름을 시작합니다.

조직 챔버에서 헤파린 화 된 식염수로 플랩의 관류 탈세포화를 시작하여 15 분 동안 잔류 된 혈전을 제거합니다. 완료되면 잔류 식염수를 500ml의 나트륨 도데 실 설페이트 또는 SDS, 탈세포 화 용액으로 교체하여 플랩을 잠수하십시오. 다음으로, 유입 튜브를 SDS 용액으로 옮기고 조직을 풍부하게합니다.

SDS 탈세포화 후, 하루 동안 PBS로 플랩을 관류하기 전에 나머지 SDS를 흡인한다. SDS 관류 탈세포화 후, DNA 용액에서 플랩을 2시간 동안 순차적으로 관류한 후, PBS에서 1일 동안 관류한 후, 유입 튜브를 증류수에 과아세트산과 에탄올로 옮겨 3시간 동안 관류하여 플랩을 살균한다. 완료되면 플랩을 무균 적으로 제거하고 각각 15 분 동안 1 % 항생제 항균제가 함유 된 PBS를 두 번 세척합니다.

재세포화 준비가 될 때까지 플랩을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 3-10mm 펀치 생검 도구를 사용하여 탈세포화된 플랩을 평가하기 위한 조직 샘플을 얻습니다. 수동 제어로 플러시된 분리된 탈세포 플랩은 omentum, 텐서 근막 라타 및 방사형 팔뚝 플랩의 자유롭게 배수되는 정맥 캐뉼라에서 유출의 증거를 보여주었습니다.

토착 omentum, 텐서 근막 lata 및 방사형 팔뚝 플랩의 총 형태는 조달 직후 분홍색으로 나타났습니다. 이에 비해 탈세포화된 조직은 특징적으로 흰색 또는 불투명했습니다. 헤 마톡실린과 에오신을 사용한 천연 조직의 조직 학적 검사는 청색 핵의 존재를 보여 주었다.

탈세포화된 플랩에서 조직학적 염색은 청색 핵 염색 없이 세포 물질의 손실을 나타냈으며, 이는 무세포 조직 스캐폴드를 나타냅니다. DNA 함량의 추가 정량화는 천연 조직에 비해 무세포 스캐폴드에서 DNA의 현저한 감소를 보여주었다. 가장 중요한 고려 사항은 조달 중에 사용되는 수술 기술로, 후속 관류 탈세포화를 허용하기 위해 플랩 척추의 손상을 방지하기 위해 주의를 기울입니다.

관류 탈세포화 후, 생성된 플랩은 천연 조직 구획을 재생하기 위해 조직 특이적 세포 집단으로 재세포화될 수 있다.