Name: 맞춤형 관류 생물 반응기에서 돼지 혈관 플랩의 조달 및 관류-탈세포화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 학습하세요 돼지 혈관 플랩의 외과적 조달 및 맞춤형 관류 생물 반응기를 이용한 관류-탈세포화 방법을. 이 기술은 조직 공학 및 재건 외과 연구에 활용될 수 있습니다.

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<ol><li>Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+Forearm+Flap+Donor-Site+Complications+and+Morbidity%3A+A+Prospective+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).</li>
<li>Edsander-Nord, Å, Jurell, G., Wickman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-site+morbidity+after+pedicled+or+free+TRAM+flap+surgery%3A+A+prospective+and+objective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).</li>
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<li>Kueckelhaus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+composite+allotransplantation%3A+Current+standards+and+novel+approaches+to+prevent+acute+rejection+and+chronic+allograft+deterioration%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration.</a> Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).</li>
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<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+skin%2Fadipose+tissue+flap+matrix+for+engineering+vascularized+composite+soft+tissue+flaps%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps.</a> Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).</li>
<li>Jank, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+bioengineered+skin+flap+scaffold+with+a+perfusable+vascular+pedicle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+-+Part+A%22%5BJournal%5D)">Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle.</a> Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).</li>
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<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+skeletal+muscle+as+a+three-dimensional+scaffold+with+a+vascular+network+template%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template.</a> Biomaterials. 89, 114-126 (2016).</li>
<li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+the+porcine+ear+generates+a+biocompatible%2C+nonimmunogenic+extracellular+matrix+platform+for+face+subunit+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering.</a> Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).</li>
<li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularization+of+human+ear+grafts+enables+ECM-based+scaffolds+for+auricular+vascularized+composite+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).</li>
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<li>Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+composite+tissues+by+perfusion+decellularization%2Frecellularization%3A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Transplantation+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review.</a> Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).</li>
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<li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).</li>
<li>Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+systems+and+devices%3A+State-of-the-art%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularization systems and devices: State-of-the-art.</a> Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).</li>
<li>Schilling, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+an+automatable%2C+3D+printed+perfusion+device+for+tissue+infusion+and+perfusion+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).</li>
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저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

제안된 프로토콜은 저농도 SDS의 관류를 사용하여 다양한 돼지 유래 플랩을 탈세포화합니다. 이 절차를 통해 무세포 omentum, 텐서 근막 라타 및 방사형 팔뚝 플랩은 저농도 SDS를 선호하는 프로토콜을 사용하여 성공적으로 탈세포화될 수 있습니다. 예비 최적화 실험에 따르면 2일에서 5일 사이에 낮은 농도(0.05%)의 SDS가 조직학적 기술로 분석했을 때 망막, 텐서 근막 라타 및 방사형 팔뚝 플랩에 대한 세포 물질을 제거할 수 있는 것으로 확인되었습니다(보충 그림 1, 보충 그림 2, 보충 그림 3). 이 방법은 짧은 시간 내에 합리적인 비용으로 탈세포화를 달성하는 간단한 접근 방식을 제공합니다. 우리의 경험에 따르면, 돼지 플랩의 탈세포화 및 살균은 2-5일이 소요되며, 밀도가 더 높은 조직(예: 5일에 팔뚝 피부 대 2일에 omentum)에 더 긴 기간 탈세포화가 필요합니다. 또한, 이 프로토콜에 사용된 저농도의 SDS는 0.05%의 낮은 SDS 농도가 SDS의 임계 미셀 농도(약 0.2<...

외상성 손상 및 종양 제거는 크고 복잡한 연조직 결함을 유발할 수 있습니다. 이러한 결함은 환자의 삶의 질을 손상시키고 기능 상실을 유발하며 영구적 인 장애를 초래할 수 있습니다. 자가 조직 플랩 이식과 같은 기술이 일반적으로 시행되었지만 플랩 가용성 및 기증자 부위 이환율 문제는 주요 제한 사항입니다 1,2,3. 혈관화 복합 동종 이식(VCA)은 복합 조직, 예를 들어 근육, 피부, 혈관계를 단일 단위로 수혜자에게 전달하는 유망한 대안입니다. 그러나 VCA는 약물 독성, 기회 감염 및 악성 종양 4,5,6을 유발하는 장기 면역 억제가 필요합니다.
조직 공학적 무세포 스캐폴드는 이러한 한계에 대한 잠재적인 해결책입니다7. 무세포 조직 스캐폴드는 기본 세포외 기질(ECM) 마이크로아키텍처를 보존하면서 천연 조직에서 세포 물질을 제거하는 탈세포화 방법을 사용하여 얻을 수 있습니다. 조직 공학에서 합성 물질을 사용하는 것과는 대조적으로, 생물학적으로 유래 된 스캐 폴드의 사용은 생체 적합성 및 임상 번역 가능성을 허용하는 생체 모방 ECM 기질을 제공한다8. 탈세포화 후, 수용자-특이적 세포를 갖는 스캐폴드의 후속 재세포화는 면역원성이 거의 또는 전혀 없는 기능적이고 혈관화된 조직을 생성할 수 있다 9,10,11. 관류 탈세포화 기술을 사용하여 무세포 조직을 얻기 위한 효과적인 프로토콜을 개발함으로써 광범위한 조직 유형을 설계할 수 있습니다. 차례로,이 기술을 기반으로 더 복잡한 조직에 적용 할 수 있습니다. 현재까지, 혈관화된 연조직의 관류 탈세포화는 설치류12, 돼지 13, 및 인간 모델(14) 뿐만 아니라 돼지 직장 복부 골격근15에서의 전층 근막 피판과 같은 단순 혈관화된 조직을 사용하여 조사되었다. 추가적으로, 복잡한 혈관화된 조직은 또한 돼지 및 인간의 귀모델(16,17) 및 인간 전면-얼굴 이식 모델(18)에서 입증된 바와 같이 관류 탈세포화되었다.
여기서, 프로토콜은 생물학적으로 유도 된 ECM 스캐 폴드를 사용하여 혈관 화 된 자유 플랩의 탈 세포 화를 설명합니다. 우리는 임상적으로 관련된 세 가지 플랩의 탈세포화를 제시합니다: 1) omentum, 2) tensor fascia lata 및 3) 방사형 팔뚝, 모두 재건 수술에서 일상적으로 사용되는 일꾼 플랩을 대표하며 조직 탈세포화의 맥락에서 동물 연구에서 이전에 조사되지 않았습니다. 이 생체 공학 플랩은 대규모 연조직 결함 복구 및 재건 분야에서 사용하기 위한 임상 응용 가능성이 있는 다재다능하고 쉽게 사용할 수 있는 플랫폼을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>0.2 & 마이크로; m pore Acrodisk 필터</td><td>VWR</td><td>CA28143-310</td><td></td></tr><tr><td>0.9 % 염화나트륨 용액 (일반 식염수)</td><td>Baxter</td><td>JF7123</td><td></td></tr><tr><td>20 L 폴리프로필렌 Carboy</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-62507-20</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Sofsilk 비흡수성 수술용 넥타이</td><td>Covidien</td><td>&nbsp; LS639</td><td></td></tr><tr><td>3방향 스톱콕</td><td>Cole-Parmer</td><td>UZ-30600-04</td><td></td></tr><tr><td>Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균 용액, 100X</td><td>Wisent</td><td>450-115-EL</td><td></td></tr><tr><td>아트로핀 황산염 15 mg/30ml</td><td>서까래 8 제품</td><td>238481</td><td></td></tr><tr><td>BD Angiocath 20-Gauge</td><td>VWR</td><td>BD381134</td><td></td></tr><tr><td>BD Angiocath 22-Gauge</td><td>VWR</td><td>BD381123</td><td></td></tr><tr><td>BD Angiocath 24-Gauge</td><td>VWR</td><td>BD381112</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Calcium Chloride Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>DNAse Co-factor</td></tr><tr><td>DNase I from bovine pancreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>DNA Assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 10X</td><td>Wisent</td><td>311-415-CL</td><td>&nbsp; Ca 없음++/Mg++</td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>Heparin, 1000 I.U./mL</td><td>Leo Pharma A/S</td><td>453811</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine Hydrochloride&nbsp; 5000 mg/50 ml</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td><td></td><td></td>612316</tr><tr><td>Ismatec 펌프 Tygon 3-Stop 튜빙</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-96450-40</td><td>내부 직경:&nbsp; 1.85 mm</td></tr><tr><td>Ismatec REGLO 4-채널 펌프</td><td>Cole-Parmer</td><td>78001-78</td><td></td></tr><tr><td>Ismatec 튜빙 카세트</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-78016-98</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 99.9%, 250 ml</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td></td><td></td>2231929</tr><tr><td>LB 한천 Lennox</td><td>Bioshop Canada</td><td>LBL406.500</td><td>멸균 테스트 한천 플레이트</td></tr><tr><td>황산 마그네슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>DNAse 보조 인자</td></tr><tr><td>Masterflex L / S 16 튜빙</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-96410-16</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam 50 mg / 10 ml</td><td>캐나다 Inc.의 제약 파트너</td><td></td><td></td>2242905</tr><tr><td>Monopolar Cautery 연필</td><td>Valleylab</td><td>E2100</td><td></td></tr><tr><td>Normal Buffered Formalin, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>N&deg; 11 메스 블레이드</td><td>Swann Morton</td><td>303</td><td></td></tr><tr><td>Papain from papaya 라텍스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3125</td><td></td></tr><tr><td>Peracetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>269336</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 바베드 커넥터 1/4"에서 1/8" 튜브용 ID</td><td>McMaster-Carr</td><td>5117K61</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 바베드 튜브 90&deg; 엘보 커넥터</td><td>McMaster-Carr</td><td>5117K76</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 퀵턴 튜브 플러그</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K143</td><td>수 Luer</td></tr><tr><td>플라스틱 퀵 턴 튜브 소켓</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K293</td><td>암 Luer</td></tr><tr><td>Punch 생검 도구</td><td>Integra Miltex</td><td>3332</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 40 mEq/20 ml</td><td>Hospira Healthcare Corporation</td><td>37869</td><td></td></tr><tr><td>포비돈-요오드, 10%</td> <td>루지에</td><td>833133</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 피펫, 2mL</td><td>Fisher Science</td><td>13-678-27D</td><td></td></tr><tr><td>스냅 뚜껑 밀폐 용기</td><td>SnapLock</td><td>142-3941-4</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨 분말</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>수술용 금속 결찰 클립, 소형</td><td>Teleflex</td><td>001200</td><td></td></tr><tr><td>Stevens Tenotomy 가위, 115mm, 직선</td><td>B. Braun</td><td>BC004R</td><td></td></tr><tr><td>TruWave 압력 모니터링 세트</td><td>Edwards Lifesciences</td><td>PX260</td><td></td></tr></tbody></table>

맞춤형 관류 생물 반응기에서 돼지 혈관 플랩의 조달 및 관류-탈세포화

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

대량의 연조직 결함은 기능적 결함을 유발하고 환자의 삶의 질에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 자가 자유 피판 이식 또는 혈관화 복합 동종 이식 (VCA)을 사용하여 외과 적 재건을 수행 할 수 있지만, 이러한 방법에는 단점도 있습니다. 기증자 부위 이환율 및 조직 가용성과 같은 문제는 자가 자유 피판 전달을 제한하는 반면, 면역억제는 VCA의 중요한 한계입니다. 탈세포화/재세포화 방법을 사용하는 재건 수술에서 조작된 조직은 가능한 해결책을 제시합니다. 탈세포화된 조직은 기본 세포외 기질(ECM) 마이크로아키텍처를 보존하면서 천연 세포 물질을 제거하는 방법을 사용하여 생성됩니다. 이어서, 이들 무세포 스캐폴드는 후속적으로 수용자-특이적 세포로 재세포화될 수 있다.
이 프로토콜은 돼지 모델에서 무세포 스캐폴드를 달성하는 데 사용되는 조달 및 탈세포화 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 관류 바이오리액터 설계 및 설정에 대한 설명도 제공한다. 플랩에는 돼지 omentum, 텐서 근막 라타 및 방사형 팔뚝이 포함됩니다. 탈세포화는 저농도 도데실 황산나트륨(SDS) 세제의 생체 외 관류에 이어 맞춤형 관류 바이오리액터에서 DNase 효소 처리 및 과초산 살균을 통해 수행됩니다.
성공적인 조직 탈세포화는 거시적으로 플랩의 흰색 불투명 외관을 특징으로 합니다. 무세포 플랩은 조직 학적 염색에 핵이없고 DNA 함량이 크게 감소함을 보여줍니다. 이 프로토콜은 보존된 ECM 및 혈관 마이크로아키텍처를 사용하여 탈세포화된 연조직 스캐폴드를 생성하는 데 효율적으로 사용할 수 있습니다. 이러한 스캐폴드는 후속 재세포화 연구에 사용될 수 있으며 재건 수술에서 임상 번역의 잠재력을 가지고 있습니다.

혈관화된 돼지 플랩을 탈세포화하는 이 프로토콜은 맞춤형 관류 바이오리액터에서 플랩 혈관구조를 통한 이온계 세제 SDS의 관류에 의존합니다. 탈세포화 이전에는 돼지 모델에서 3개의 혈관화된 플랩을 조달하고 주 공급 용기에 따라 캐뉼러링했습니다. 플랩은 성공적인 탈세포화를 허용하기 위해 특허, 관류 가능한 혈관구조를 유지하기 위해 조달 후 즉시 플러싱되었습니다. 밀폐 된 스냅 뚜껑 용기를 사용하여 밀폐 된 환경 내에서 플랩 관류를 허용하도록 맞춤형 생물 반응기를 설계했습니다. 바이오리액터 내의 플랩의 관류는 조직 챔버에 연결된 2개의 연동 펌프를 사용하여 단일 패스 방식으로 달성되었습니다. 관류 압력은 인라인 압력 센서로 모니터링되었습니다.
탈세포화 동안, SDS 노출 기간은 처리되는 조직의 유형에 의존하였다. 기술된 관류 탈세포화 기술을 사용하여, 오멘텀, 텐서 근막 및 방사형 팔뚝 플랩을 각각 2일, 3일 및 5일 동안 0.05% SDS로 탈세포화하였다. 탈세포화 후 성공적인 살...

이 프로토콜은 맞춤형 관류 생물 반응기에서 플랩 혈관 구조를 통해 나트륨 도데 실 설페이트 세제의 관류에 의한 혈관 화 된 돼지 플랩의 외과 적 조달 및 후속 탈세포화를 설명합니다.

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

이 방법은 3 개의 혈관 화 된 돼지 피판의 외과 적 조달과 그 이후의 관류 탈세포 화를 설명합니다. 이 방법은 조직 탈세포화 및 재세포화 접근법을 사용하여 돼지 플랩을 재생하려는 노력을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간단한 조립 생물 반응기 설정으로 다양한 혈관 화 된 돼지 플랩에 걸쳐 풍부한 탈세포 화를 달성 할 수있는 다양성입니다.여기에 설명된 기술은 재건 수술에서 돼지 피판을 사용하는 잠재적인 조직 공학 솔루션으로서 다른 혈관 피판에 광범위하게 적용될 수 있습니다. 시작하려면 LS50 백금 코팅 실리콘 튜브의 약 16cm를 측정하여 유입 및 유출 튜브를 만드십시오. 한쪽 끝을 노란색 3스톱 펌프 튜브에 연결하고 다른 쪽 끝을 멸균 2밀리리터 혈청학적 피펫에 연결하여 세제 저장소에서 바이오리액터 챔버로 향수를 운반합니다.챔버와 튜브를 개별 포장된 멸균 포장으로 오토클레이브합니다. omental 플랩 조달의 경우 12 주 된 마취 된 요크셔 돼지를 앙와위 자세에 놓은 다음 일반적인 멸균 방식으로 복부를 준비하십시오. 복부에 들어가 위 두부를 동원하기 위해 xipho-umst 개복술을 수행하고 omentum을 수술 부위에 놓습니다.왼쪽 위 배체 동맥이 비장 동맥과 합류하는 더 큰 곡률의 왼쪽에서 시작하여 직선 Stevens 건절개 가위를 사용하여 왼쪽 위 배체 동맥과 정맥을 골격화합니다. 그런 다음 수술 용 넥타이 또는 클립을 사용하여 별도로 분리하고 나눕니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 위의 더 큰 곡률을 따라 진행하여 omentum에서 발생하는 짧은 혈관 가지를 결찰하고 분할하여 위의 더 큰 곡률을 공급합니다.오른쪽 위 상피 배혈 혈관과 위 십이지장 동맥의 교차점이 발생할 때까지 더 큰 omentum의 동원을 계속하십시오. 그런 다음 오른쪽 위 상피 동맥과 정맥을 결찰하고 분할하여 omental 플랩을 풀고 나중에 플랩 캐뉼러를 허용합니다. 텐서 근막 라타 플랩 조달의 경우 돼지를 측면 욕창 위치에 놓습니다.전방 상장골 척추 또는 ASIS에서 측면 슬개골쪽으로 내부 플랩 경계를 표시하고 꼬리쪽으로 약 8-10cm 후방 경계를 표시하십시오. 메스를 사용하여 슬개골의 말단 가장자리를 날카롭게 절개하십시오. 피하 조직을 통한 절개를 심화시켜 대퇴직근 위에있는 근막에 도달하고 표시된 경계를 따라 ASIS쪽으로 절개를 계속합니다.근막 플랩 만 분리하려면 밑에있는 근막 층에서 위에 놓인 피부 구성 요소를 제거하십시오. 그런 다음 작은 천공기 혈관을 피부에 결찰하거나 소작하십시오. 플랩의 말단 경계로 돌아가서 깊은 근막을 절개하십시오.밑에있는 광대 한 측면 근육에서 근막을 ASIS쪽으로 동원합니다. 척추를 깊은 대퇴 혈관쪽으로 추적 한 후, 근막 피판을 공급하는 외측 대퇴 동맥과 정맥을 골격화합니다. 그런 다음 플랩 혈관을 근위부로 결찰하고 분할하여 깊은 대퇴 혈관에 합류하고 나중에 캐뉼러를 허용합니다.방사형 팔뚝 플랩 조달의 경우 확장 된 돼지 팔뚝의 방사형 측면에 3 x 3cm 정사각형을 표시하십시오. 근위 플랩 마진의 중간 점과 전방 포사 사이에 선을 그려 요골 동맥 척추의 대략적인 경로를 나타냅니다. 촉진으로 동맥 경로를 확인하십시오.다음으로, 상완 전 근막까지 깊이가있는 원위부에서 메스를 사용하여 피부를 절개하십시오. 원위 요골 동맥과 그 대정맥이 만날 때까지 tenotomy 가위로 둔하게 해부하십시오. 그런 다음 동맥과 정맥을 수술 용 넥타이 또는 클립으로 분리하고 나눕니다.표시된 피부 사각형의 방사형 및 척골 가장자리에서 피부 절개를 계속하십시오. 그런 다음 수술 칼날이나 소작기로 밑에있는 요골 뼈에서 플랩을 동원하여 척골에서 반경 방향으로 진행하면서 피부 플랩을 앞쪽 포사쪽으로 근위로 올립니다. tenotomy 가위를 사용하여 요골 동맥과 대정맥을 근위부에서 골격화하여 상완 동맥과 정맥을 각각 연결합니다.혈관 척추를 분리하기 위해 주변 섬유 지방 조직에서 혈관을 해부합니다. 그런 다음 동맥과 정맥을 별도로 결찰하고 나누어 방사형 팔뚝 플랩을 자유롭게합니다. 다음으로, 3-0 실크 타이로 고정 된 20-24 게이지 혈관 카테터로 척추 혈관을 캐뉼러합니다.명확한 정맥 유출이 관찰 될 때까지 헤파린 화 된 식염수를 플랩 동맥 캐뉼라로 플러시하십시오. 층류 생물 안전 캐비닛에서 작업하는 동안 생물 반응기 조직 챔버에 플랩을 놓습니다. 잔류 공기를 제거하고 플랩 동맥 캐뉼러와 수 루어 커넥터 사이의 연결을 허용하도록 플랩을 배열하기 위해 멸균 헤파린 화 식염수가있는 프라임 유입 튜브.그런 다음 멸균 지혈제를 사용하여 동맥 캐뉼러를 커넥터에 나사로 고정하십시오. 그런 다음 스톱 콕을 통해 헤파린 화 된 식염수를 플러시하여 루어 연결에 누출이없고 플롭이 정맥 유출의 증거로 관류 될 수 있는지 확인하십시오. 티슈 챔버 뚜껑을 닫은 후 노란색 3스톱 펌프 튜브가 있는 유입 튜브를 티슈 챔버의 유입 스톱콕에 연결합니다.또한 관류 압력 모니터링을 위해 인라인 압력 센서 변환기를 유입 3방향 스톱콕에 부착합니다. 그런 다음 유입 연동 펌프를 켜고 초기 화면에서 화살표를 사용하여 세 번째 탭으로 이동하여 튜브 ID를 1.85mm로 설정합니다. 그런 다음 두 번째 탭에서 관류 속도를 설정합니다.전달 모드로서의 입력 속도는 분당 2 밀리리터로 설정됩니다. 화면에 표시된 대로 흐름 방향이 올바른지 확인합니다. 호환되는 카세트를 사용하여 3-스톱 펌프 튜브를 연동 펌프에 로드합니다.유출 펌프 설정을 분당 4밀리리터의 속도로 설정합니다. 노란색 3스톱 펌프 튜브가 있는 유출 튜브를 조직 챔버의 유출 스톱콕에 연결합니다. 그런 다음 3스톱 펌프 튜브를 연동 펌프에 로드하고 각 펌프의 전원 버튼을 눌러 두 펌프의 흐름을 시작합니다.조직 챔버에서 헤파린 화 된 식염수로 플랩의 관류 탈세포화를 시작하여 15 분 동안 잔류 된 혈전을 제거합니다. 완료되면 잔류 식염수를 500ml의 나트륨 도데 실 설페이트 또는 SDS, 탈세포 화 용액으로 교체하여 플랩을 잠수하십시오. 다음으로, 유입 튜브를 SDS 용액으로 옮기고 조직을 풍부하게합니다.SDS 탈세포화 후, 하루 동안 PBS로 플랩을 관류하기 전에 나머지 SDS를 흡인한다. SDS 관류 탈세포화 후, DNA 용액에서 플랩을 2시간 동안 순차적으로 관류한 후, PBS에서 1일 동안 관류한 후, 유입 튜브를 증류수에 과아세트산과 에탄올로 옮겨 3시간 동안 관류하여 플랩을 살균한다. 완료되면 플랩을 무균 적으로 제거하고 각각 15 분 동안 1 % 항생제 항균제가 함유 된 PBS를 두 번 세척합니다.재세포화 준비가 될 때까지 플랩을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 3-10mm 펀치 생검 도구를 사용하여 탈세포화된 플랩을 평가하기 위한 조직 샘플을 얻습니다. 수동 제어로 플러시된 분리된 탈세포 플랩은 omentum, 텐서 근막 라타 및 방사형 팔뚝 플랩의 자유롭게 배수되는 정맥 캐뉼라에서 유출의 증거를 보여주었습니다.토착 omentum, 텐서 근막 lata 및 방사형 팔뚝 플랩의 총 형태는 조달 직후 분홍색으로 나타났습니다. 이에 비해 탈세포화된 조직은 특징적으로 흰색 또는 불투명했습니다. 헤 마톡실린과 에오신을 사용한 천연 조직의 조직 학적 검사는 청색 핵의 존재를 보여 주었다.탈세포화된 플랩에서 조직학적 염색은 청색 핵 염색 없이 세포 물질의 손실을 나타냈으며, 이는 무세포 조직 스캐폴드를 나타냅니다. DNA 함량의 추가 정량화는 천연 조직에 비해 무세포 스캐폴드에서 DNA의 현저한 감소를 보여주었다. 가장 중요한 고려 사항은 조달 중에 사용되는 수술 기술로, 후속 관류 탈세포화를 허용하기 위해 플랩 척추의 손상을 방지하기 위해 주의를 기울입니다.관류 탈세포화 후, 생성된 플랩은 천연 조직 구획을 재생하기 위해 조직 특이적 세포 집단으로 재세포화될 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

재관류의 decellularization는 기관의 세포외 기질 구성과 마이크로 아키텍처를 유지 전체 간 공사장 공중 발판을 생산하는 새로운 기술입니다. 여기에, hepatocytes과 재관류의 decellularization 이후 repopulation를 사용하여 전체 오르간 공사장 공중 발판을 준비하는 방법이 설명되어 있습니다. 기능 및 transplantable 간 이식이 기술을 사용하여 생성할 수 있습니다.

전체 간은의 Decellularization 및 Recellularization

신속하고 완벽하게 역행 재관류를 통해 그대로 돼지의 심장에서 세포 구성 요소를 제거하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 여러 임상 응용 프로그램에서 사용하기 위해 가능성이있는 사이트 특정 심장 세포 외 기질 비계를 산출.

퇴행성 관상 재관류에 의한 돼지 심장의 Decellularization 절차

전체 장기 탈세포화는 재생 의학에 사용될 수 있는 자연적인 생물학적 골격을 생성합니다. 폐 재생의 비인간 영장류 모델에 대한 설명이 제시되는데, 이는 전체 폐가 탈세포화되고 성체 줄기 세포와 내피 세포를 파종하여 혈관 순환과 액체 매체 환기를 촉진하는 생물 반응기에 파종되는 것입니다.

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor(특수 대형 장기 생물반응기를 이용한 비인간 영장류 폐 탈세포화 및 재세포화)

여기, 우리는 두 번 시드를 부분적으로 유도 만능 줄기 세포로 쥐에 이식을위한 기능적인 조직 설계 혈관 이식을 생성하는 프로토콜을 제시 (PiPSC은) - 탈세 포화 선박 발판 생물 반응기에서 유래 내피 세포 - 평활근 세포 및 PiPSC 산출했다.

마우스 모델에서 조직 공학 혈관의 생성 및 손톱 확장

현재까지 두꺼운 조직 결손은 일반적으로 자가 조직 플랩 또는 엔지니어링 조직을 적용하여 재구성됩니다. 이 프로토콜에서는 자가 피판을 대체하기 위해 자가 척추경을 지닌 혈관 조직 피판을 엔지니어링하는 새로운 방법을 제시합니다.

엔지니어링 혈관을 근육 플랩

당사의 독점 장치를 사용하여 간 채취, 삽관 및 관류를 위한 제시된 기술은 쥐 간에서 탈세포화 및 재세포화 실험을 개선하기 위한 정교한 관류 설정을 가능하게 합니다.

진동 압 관류 장치에서 쥐 간을의 탈세 포화 절차

이 메서드는 decellularization의 삼투성 충격 및 최소한의 기관 매트릭스 중단 이온 세제의 관류에 따라 간단한 프로토콜을 사용 하 여 복잡 한 단단한 기관 수 있습니다. 그것은 흐름 역학 및 세포질 파편 유출의 실시간 모니터링으로 가압된 주머니 안에 인간의 마음에 대 한 소설 decellularization 기법으로를 구성 됩니다.

거꾸로 방향 가압된 주머니 안에 전체 인간의 마음의 decellularization

본 프로토콜은 돼지 근막-피부 피판 모델과 혈관화된 복합 조직 연구에서의 잠재적 용도를 설명합니다.

혈관화된 복합 동종이식편 생명공학 연구를 위한 신뢰할 수 있는 돼지 근막-피부 피판 모델

우리는 복합 쥐 뒷다리에 대한 수술 기술과 탈세포화 과정을 설명합니다. 탈세포화는 생체 외 기계 관류 시스템을 통해 저농도 도데실 황산나트륨을 사용하여 수행됩니다.

혈관화된 복합 동종 이식을 위한 생체 내 관류 기반 생물반응기를 사용한 쥐 뒷다리의 조달 및 탈세포화

이 프로토콜은 관류 중인 혈관의 체외 배양을 위해 새로 개발된 3D 프린팅 바이오리액터의 설정 및 작동을 제시합니다. 이 시스템은 다른 사용자가 쉽게 채택할 수 있도록 설계되었으며, 실용적이고 저렴하며 기초 생물학 및 약리학 연구와 같은 다양한 실험 응용 분야에 적용할 수 있습니다.

Ex Vivo (체외 주행) 3D 프린팅 생물반응기에서 큰 혈관의 관류 배양

이 프로토콜은 실험 연구를 목적으로 하부 하복동맥 페디클을 기반으로 인간 천공관 피판 모델을 채취하는 외과적 기법을 설명합니다.

혈관 화된 복합 동종편 및 자유 피판의 보존 전략을 조사하기 위한 실험적 인간 DIEP 플랩 모델

학습하세요 돼지 혈관 플랩의 외과적 조달 및 맞춤형 관류 생물 반응기를 이용한 관류-탈세포화 방법을. 이 기술은 조직 공학 및 재건 외과 연구에 활용될 수 있습니다.

맞춤형 관류 생물 반응기에서 돼지 혈관 플랩의 조달 및 관류-탈세포화

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