CRISPR-Cas12a와 결합된 재조합 중합효소 증폭을 사용한 현장 배치 가능 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 검출
2022년 12월 23일
이 연구에서는 CRISPR-Cas12a와 결합된 재조합 중합효소 증폭을 기반으로 하는 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스에 대한 빠르고 민감하며 휴대 가능한 검출 방법이 개발되었습니다.
황 롱 빙, HLB로 약칭. 전 세계적으로 치명적인 감귤류병입니다. 중국과 미국과 같은 대부분의 감귤류 생산 국가에서 HLB는 체관 제한 박테리아 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스(CLas로 약칭)에 의해 발생합니다.
CLas의 조기 발견은 재배자가 조기 개입을 촉진하고 질병 확산을 예방하는 데 중요했습니다. 그래서 여기서 우리는 재조합 효소 중합효소 증폭 및 CRISPR-Cas12a 시스템과 결합하여 신속하고 휴대 가능한 HLB 진단을 위한 새로운 방법을 개발했습니다. 우리는 그것을 CLas-DETECTR라고 불렀습니다.
우리 플랫폼의 감도는 PCR보다 훨씬 높습니다. 또한, 잎 샘플을 사용했을 때 qPCR과 유사한 결과를 보여줍니다. 기존의 CLas 검출과 비교하여 당사의 방법은 90분 내에 완료할 수 있으며 등온 조건에서 작동합니다.
결과는 또한 현장에서 휴대용 형광 검출 장치를 통해 시각화할 수 있습니다. CLas-DETECTR에는 용액 준비, 감귤류 총 DNA 분리, 등온 DNA 증폭 및 시각화 결과의 4단계가 포함됩니다. CLas-DETECTR 분석의 개략도가 여기에 설명되어 있습니다.
완충액 A, 용액 B, 및 용액 C는 프로토콜에 기재된 바와 같이 제조된다. 시간을 절약하고 이 방법을 현장 CLas 검출에 적합하게 만들기 위해 E.coli 폴리에틸렌 글리콜 기반 접근법을 사용하여 DNA 증폭을 위한 조식물 추출물을 얻었습니다. 감귤류 잎은 도구에 사용됩니다.
잎에서 잎 디스크 몇 조각을 펀치하십시오. 리프 디스크를 1.5 밀리리터 에펜 도르프 튜브에 넣으십시오. 그런 다음 200 마이크로 리터의 버퍼 A를 튜브에 첨가하십시오.
플라스틱 막대로 수동으로 부드러워 질 때까지 잎 디스크를 연마하십시오. 튜브를 10 분 동안 그대로 두십시오. 상청액은 이어서 DNA 증폭에 적용됩니다.
등온 DNA 증폭을 위해 2.3단계의 상청액 1마이크로리터와 아세트산마그네슘 1마이크로리터를 용액 B에 넣고 잘 섞습니다. 실험실에서 간단한 인큐베이터에서 37도에서 15 분 동안 배양하십시오. 결과를 시각화하려면 3.2단계의 혼합물 10마이크로리터를 용액 C에 넣고 잘 섞습니다.
37도 인큐베이터에서 60 분 동안 배양하십시오. 고글을 착용하고 휴대용 형광 감지 장치를 통해 녹색 형광 신호를 관찰합니다. CLas-DETECTR의 특이성을 테스트하기 위해, 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101의 첫 번째 순수 콜로니, 크산토모나스 시트리 아종.
우리 실험실에서 분리 된 감귤류 구내염과 Burkholderia stabilis 균주 1440의 병원균 인 Citri는 게놈 DNA를 추출하는 데 사용되었습니다. 그 다음 3개의 박테리아 게놈 DNA와 CLas 양성 뉴홀 잎 게놈 DNA를 CLas-DETECTR 검사를 실시하였다. CLas-DETECTR의 민감도를 테스트하기 위해, 프로토콜에 기재된 바와 같이 PCR, CLas-DETECTR 및 qPCR을 사용하여 일련의 CLas DNA 단편 희석물을 검출하였다. 특이성 및 민감도 테스트 후, CLas-DETECTR 방법을 사용하여 현장에서 CLas의 존재를 검출하였다.
중국 장시성 간난 사범대학 캠퍼스의 생식질 자원 보육원에서 자란 Newhall 달콤한 오렌지 나무에서 채취한 잎 샘플. 실험실에서 일반적으로 사용되는 설득력 있는 CLas 검출 방법인 qPCR도 적용되었습니다. 우리 실험실에서 CLas의 존재가 확인 된 HLB 감염 및 HLB 감염되지 않은 Newhall 나무의 잎 샘플은 CLas-DETECTR 테스트를 받았습니다.
녹색 형광 신호는 HLB-감염된 샘플에서 포착되었지만, HLB-감염되지 않은 음성 대조군에서는 포착되지 않았다. 다른 박테리아에서 추출한 핵산을 사용하여 CLas-DETECTR의 특이성을 결정했습니다. CLas-DETECTR 분석에서 CLas 양성 뉴홀 잎에서 추출한 gDNA만이 녹색 형광 신호를 나타냈습니다.
아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101, 크산토모나스 시트리 아종 시트리 및 버크홀데리아 스태빌리스 균주 1440에서 추출한 gDNA는 그렇지 않았으며, 이는 CLas-DETECTR이 CLas를 특이적으로 검출할 수 있음을 의미합니다. 또한 프로토콜에 나열된 일련의 CLas DNA 희석액을 사용하여 CLas-DETECTR의 민감도를 테스트했습니다.
PCR은 메가리터당 201개의 사본을 검출할 수 있습니다. 반면에 CLas-DETECTR는 메가리터당 2.01개의 복사본을 감지할 수 있어 민감한 현장 진단으로 사용할 수 있음을 시사합니다. qPCR은 메가리터당 0.201개의 카피를 검출할 수 있으며 Ct 값은 36보다 높습니다.
따라서 CLas-DETECTR은 희석된 CLas 특이적 앰플리콘을 사용했을 때 기존 PCR보다 2배 더 민감하고 qPCR보다 1배 덜 민감합니다. 마지막으로, 현장 샘플에 대한 CLas-DETECTR의 타당성을 재검토하고 민감도를 qPCR과 비교했습니다. 숫자로 보면 알 수 있습니다.
CLas 농도가 메가리터당 0.2 카피 미만일 때 Ct 값이 36보다 높으며 이는 매우 낮은 농도임을 알 수 있습니다. 15개의 샘플 중에서, qPCR에 의해 검출된 샘플 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 및 14의 Ct 값은 36 미만이었다. 명백한 녹색 형광 신호가 관찰되었다.
반면, qPCR에 의해 검출된 샘플 6, 7, 9, 12 및 15의 Ct 값이 결정되지 않은 경우, 녹색 형광 신호는 관찰되지 않았다. 또한, qPCR에 의해 검출된 샘플 5 및 11의 CT 값이 36보다 높을 때 약한 녹색 형광 신호가 관찰되었다. 결과는 우리 플랫폼이 현장에서 HLB 진단을 위한 빠르고 강력하며 민감한 도구임을 시사합니다.
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개요
이 연구는 감귤 식물의 황룡병(HLB)의 원인균인 Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas)의 빠르고 정확한 검출의 필요성에 대응합니다. CLas-DETECTR라고 불리는 새로운 방법은 재조합효소 중합효소 증폭과 CRISPR-Cas12a 기술을 결합하여 현장에서의 휴대성 있고 민감한 검사를 가능하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 식물 병리학
- 농업 진단
- 미생물 유전학
배경
- 황룡병(HLB)은 전 세계 감귤 생산에 심각한 영향을 미칩니다.
- CLas 조기 검출은 질병 확산 방지에 중요합니다.
- PCR과 같은 현재 방법에는 한계가 있어 현장 적용성을 위한 개선이 필요합니다.
사용된 방법
- CRISPR-Cas12a와 결합된 재조합효소 중합효소 증폭
- 검사를 위해 감귤 잎의 현장 샘플이 사용되었습니다.
- 결과 시각화를 위한 형광 검출 기술.
주요 결과
- CLas-DETECTR은 표준 PCR보다 훨씬 높은 민감도를 보였습니다.
- CLas-양성 샘플에서만 특이적인 형광이 관찰되었습니다.
- 이 방법은 등온 조건에서 90분 이내에 결과를 얻을 수 있습니다.
결론
- 이 연구는 CLas-DETECTR이 HLB에 대한 강력하고 민감한 진단 도구임을 보여줍니다.
- 이 방법은 감귤 질병을 효과적으로 관리하기 위한 적시 개입을 용이하게 할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Rapid, field-deployable detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) addresses a critical bottleneck in agricultural pathogen surveillance, enabling earlier intervention and containment of Huanglongbing (HLB) outbreaks. The integration of recombinase polymerase amplification with CRISPR-Cas12a delivers high sensitivity and specificity, supporting confident decision-making at the point of need. This diagnostic advancement enhances predictive confidence and operational agility for disease management pipelines in agri-biotech portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid hypothesis testing for pathogen presence in plant systems.
- Supports functional validation of detection targets through CRISPR-based specificity.
- Facilitates biological de-risking by distinguishing CLas from other citrus pathogens.
- Improves predictive confidence for early-stage intervention strategies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated plant DNA extracts for downstream diagnostic workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative fluorescence readouts.
- Enables scalable, field-ready screening without laboratory PCR infrastructure.
- Supports reliable evaluation of sample status for rapid triage.
Translational & Preclinical Research
- Aligns diagnostic outputs with disease-relevant field conditions for translational continuity.
- Bridges laboratory assay performance with real-world sample variability.
- Reduces risk in advancing detection platforms toward broader agricultural deployment.
- Provides mechanistic de-risking by confirming target specificity in complex matrices.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through field validation, supporting workflows from hypothesis testing to actionable diagnostics in agricultural biotechnology.
- Discovery Biology: Confirms pathogen presence and specificity using CRISPR-Cas12a-mediated detection.
- Screening: Offers rapid, reproducible, and quantitative fluorescence outputs for sample triage.
- Analytics: Provides sensitivity thresholds and comparative performance data versus PCR and qPCR.
- Translational Research: Demonstrates continuity from laboratory validation to field deployment in citrus samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a portable, reusable diagnostic platform adaptable to other plant pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in pathogen detection.
- Operational Value: Enables standardized, rapid, and field-deployable diagnostics without complex instrumentation.
- Strategic Value: Supports timely go/no-go decisions for disease management and resource allocation.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization of diagnostic and intervention strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid extraction and isothermal amplification techniques.
- Needs access to handheld fluorescence detection devices for field visualization.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and assay execution.
- Adaptable to various plant matrices with protocol optimization.
- Limited by the need for CRISPR-Cas12a reagents and fluorescence-compatible infrastructure.
