Name: 설치류 심장에서의 바이러스 전이 유전자 발현 및 심장 부정맥 위험 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: 배우세요 초음파 유도 심근내 바이러스 주사를 이용한 설치류 심장의 효율적인 유전자 발현 기법과 Langendorff 관류를 통한 심실 부정맥 유발 평가 방법을. 이 프로토콜은 심장 질환 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 캐나다 보건 연구소 (CIHR) 프로젝트 보조금 (PJT-148918 및 PJT-180533, WL), CIHR 조기 경력 조사자 상 (AR8-162705, WL), 캐나다 심장 및 뇌졸중 재단 (HSFC) 맥도날드 장학금 및 신규 조사자 상 (S-17-LI-0866, WL), 학생 장학금 (JW 및 YX), 오타와 대학교 심장 기부 기금의 박사후 연구원 (AL로). 저자는 Richard Seymour 씨의 기술 지원에 감사드립니다. 그림 2 는 승인된 라이선스가 있는 Biorender.com 사용하여 작성되었습니다.

설명 된 모든 방법과 절차는 오타와 대학의 동물 연구 윤리 검토위원회와 오타와 대학 심장 연구소의 생물 안전성 검토위원회의 승인을 받았습니다. 개발된 안전성 프로토콜에는 재조합 아데노바이러스 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 다루는 모든 절차가 레벨 II 생물안전 캐비닛에서 수행되었다는 것이 포함됩니다. 바이러스와 접촉 한 모든 항목은 실험 후 철저히 오염 제거되었습니다. Ctnnb1 플록스/플록스 및 αMHC-MerCreMer 마우스(8-12주령, 성별) 및 Sprague-Dawley 쥐(200-250g, 수컷)를 본 연구에 사용했습니다. 동물은 상업적 출처로부터 수득하였다(재료 표 참조). 동물을 다루는 모든 절차는 기관 규제위원회에서 훈련되고 승인 된 직원이 수행했습니다. 모든 절차 중에 적절한 개인 보호 장비가 사용되었습니다.
1. 설치류 심실 조직에서의 바이러스 전이 유전자 발현
참고: 표적 유전자를 발현하는 재조합 아데노바이러스 또는 AAV(역가 1 x 1010 PFU/mL) 또는 AAV9-GFP(역가 1 x 1013 GC/mL)( 재료 표 참조)와 같은 해당 대조군 바이러스를 -80°C 냉동고에 보관하십시오.
<ol><li>바이러스 주입 당일에 얼음에서 바이러스를 해동하십시오. 표적 유전자를 발현하는 바이러스와 대조군 바이러스를 30G 1/2 바늘로 두 개의 별도 주사기(부피=50μL)에 흡인하고 사용할 때까지 얼음 위에 보관합니다. 알림: 주사기와 바늘의 기포는 조심스럽게 제거해야합니다.</li>
	<li>부프레노르핀을 쥐 또는 생쥐에게 투여하고(쥐의 경우 0.05mg/kg, 생쥐의 경우 0.1mg/kg, 피하), 1시간 후 3% 이소플루란을 사용하여 마취를 유도하고, 후속 절차를 위해 이소플루란을 2%(0.5-1.0L/min의 유속으로 100% 산소에서)로 유지합니다.</li>
	<li>한 쌍의 집게로 동물의 몸 (예 : 꼬리)을 부드럽게 꼬집고 동물이 몸의 움직임으로 꼬집음에 반응하지 않으면 적절한 마취가 확인됩니다.</li>
	<li>전기 가열 패드를 사용하여 체온을 37 ° C로 유지하십시오. 머리 깎기를 사용하여 가슴 부위의 머리카락을 면도하십시오. 알림: 전기 가열 패드를 사용하는 동안 잠재적인 고르지 않은 열 분포 때문에 주의해야 합니다.</li>
	<li>각막의 건조를 막기 위해 양쪽 눈에 안과 용 연고를 바르십시오.</li>
	<li>동물을 앙와위 자세로 유지하고 전임상 영상 시스템 ( 재료 표 참조)을 사용하여 단축 방향으로 동물의 심장을 초음파 영상화하십시오. 알림: 다음 단계는 멸균 환경을 제공하는 레벨 II 생물안전 캐비닛에서 수행됩니다. 안전한 바늘 취급을 포함한 표준 안전 절차가 사용됩니다.</li>
	<li>요오드 기반 또는 클로르헥시딘 기반 스크럽과 알코올을 원형 운동으로 3 번 번갈아 가며 동물의 왼쪽 가슴 아래 부위를 소독하십시오.</li>
	<li>초음파 영상 유도에 따라 30단계에서 준비한 바이러스가 포함된 주사기의 1/2G 바늘을 1.1G 삽입합니다. 몸의 왼쪽 가슴 아래쪽을 통해 동물의 가슴으로.</li>
	<li>바늘 끝을 좌심실 전면 자유 벽에 접근하고 10-15 μL의 바이러스를 천천히 주입합니다. 바늘 끝 근처의 향상된 밝기로 초음파 이미지에서 성공적인 주입을 확인하십시오. 참고: 각 부위에 주입되는 바이러스의 양은 심근 조직의 물리적 손상을 방지하기 위해 15μL 이하입니다.</li>
	<li>심장에서 바늘을 빼내고 좌심실의 다른 부위에 삽입하여 같은 양의 바이러스를 두 번째 및 세 번째로 주사합니다. 참고: 총 주사 부위 수는 실험 설계에 의해 결정됩니다. 국소 전이 유전자 발현이 필요한 경우 한 번의 주사 만 필요합니다. 더 확산 성 전이 유전자 발현이 필요한 경우 일반적으로 여러 주사 부위 (3-5 개)가 필요합니다.</li>
	<li>주사가 끝나면 동물을 새장으로 되돌립니다.</li>
	<li>동물이 흉골 누운 자세를 유지하고 수용실로 되돌릴 수있는 충분한 의식을 회복 할 때까지주의 깊게 모니터링하십시오.</li>
	<li>다음 2 일 동안 부 프레 노르 핀 HCl (0.1 mg / kg, 마우스의 경우 하루에 두 번, 0.05 mg / kg, 쥐의 경우 하루에 두 번, 피하)을 동물에게 투여하십시오. 동물을 사육장으로 돌려보내고 통증이나 고통의 비정상적인 징후가 있는지 매일 모니터링하고, 발견되면 기관 동물 관리 위원회 프로토콜에 따라 동물을 치료합니다.</li>
</ol>2. 심장 부정맥 감수성 평가
참고: 아데노바이러스 주사 후 4-6일 및 AAV 주사 후 1-2주에 2.1.-2.2단계에 따라 심장 부정맥에 대한 동물 심장의 감수성을 평가합니다.
<ol><li>쥐 또는 마우스 심장의 Langendorff 관류를 수행하십시오.<ol><li>1 L의 물에 다음을 첨가하여 티로드 용액을 제조한다: NaCl, 7.9 g (최종 = 135 mM); KCl, 0.37 g (5.0 mM); CaCl2, 0.27 g (1.8 mM); MgCl2, 0.24 g (1.2 mM); 헤페스, 2.38 g (10 mM); 및 포도당, 1.8 g (10 mM). NaOH로 pH를 7.40으로 조정합니다 ( 재료 표 참조).</li>
		<li>0.2μm 필터로 용액을 여과하고 2.1.6.-2.2.8 단계에서 연속적으로 100%O2 로 버블링합니다.</li>
		<li>쥐 또는 마우스에 헤파린을 투여하고 (500 U / kg, 복강 내 주사) 10 분 후에 3 % 이소 플루 란으로 동물을 마취시킵니다. 몸에 부드럽게 꼬집어 적절한 마취를 보장하십시오.</li>
		<li>메스를 사용하여 왼쪽 쇄골 절개술을 위해 쇄골 중간 선에 1-1.5cm의 수직 절개를하고 심장을 노출시킵니다.</li>
		<li>대동맥 궁 수준에서 가위로 절단하여 심장을 모으고 즉시 얼음처럼 차가운 Tyrode 용액에 심장을 넣으십시오. 알림: 심장 수집 중에 심장을 손상시키지 않도록주의하십시오.</li>
		<li>일정한 유속 모드에서 수정 된 Langendorff 관류 시스템 ( 재료 표 참조)에 연결된 무딘 바늘 (쥐의 경우 18G, 생쥐의 경우 23G)로 심장의 대동맥을 캐뉼러합니다. 관류 압력을 70-80 mmHg로 유지하기 위해 유량을 조정하십시오. 알림: 관류 바늘의 모든 기포는 대동맥 캐뉼러 형성 전에 제거해야 합니다. 해부 현미경을 사용하면 캐뉼러가 용이합니다.</li>
		<li>캐뉼러 된 심장을 실리콘 엘라스토머로 코팅 된 9, 10cm 플라스틱 접시에 놓고 좌심실이 위를 향하게하고 심장 9,12를 O 2 버블 Tyrode 용액으로 37 ° C에서 관류합니다.</li>
		<li>처음 2-3 번의 심장 박동 동안 심장에서 혈액이 씻겨 나가고 심장 색이 빨간색에서 창백함으로 변하는 것을 관찰하여 관류 시작시 올바른 대동맥 캐뉼러를 확인하십시오.</li>
		<li>작은 동물 ECG 시스템의 전극( 재료 표 참조)을 접시의 실리콘 엘라스토머 코팅에 삽입하여 심장 주위에 놓습니다(그림 1). 호환되는 소프트웨어를 사용하여 ECG를 기록합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>아드레날린 수용체 자극과 프로그램 된 전기 자극을 수행하여 심실 빈맥을 유도합니다.<ol><li>성공적인 대동맥 캐뉼러 후, 심장 준비를 안정화하기 위해 20 분 동안 Tyrode 용액으로 심장을 계속 관류하십시오.</li>
		<li>1 단계에서 심장 관류에 사용되는 Tyrode 용액에 2.2.3.2.8μM 이소 프로 테레 놀 ( 재료 표 참조)을 추가합니다.</li>
		<li>이소프로테레놀 관류 10분 후, 전기 자극기에 연결된 두 개의 백금 전극으로 정점에서 심장을 자극합니다( 재료 표 참조).</li>
		<li>10개의 연속 자극(S1, 5V, 100ms 간격)과 초기 간격이 80ms인 추가 자극(S2)을 포함하는 자극 절차(그림 2)로 시작합니다. 심장 박동을 더 이상 캡처할 수 없을 때까지(즉, 심장의 유효 불응 기간인 ERP에 도달할 때까지) 매번 S2 간격을 2ms씩 반복적으로 줄입니다.13.</li>
		<li>ECG에 의한 유도 된 심실 빈맥 (심실 빈맥 및 세동 포함)을 모니터링하십시오.</li>
		<li>위의 절차로 부정맥이 유발되지 않으면 ERP에 도달할 때까지 동일한 초기(80ms) 및 감소(2ms) 간격으로 S2 뒤에 또 다른 추가 자극(S3)을 추가합니다.</li>
		<li>심실 빈맥이 여전히 유도되지 않으면 ERP에 도달 할 때까지 동일한 초기 및 감소 간격으로 S3 후에 추가 자극 (S4)을 하나 더 추가하십시오.</li>
		<li>심실 빈맥이 여전히 유도되지 않으면 (건강한 심장 조절에서 예상되는대로) 전기 자극 프로토콜을 중단하고 심장을 유도하지 않는 것으로 간주하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update%3A+A+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139(2020).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte-specific+deletion+of+%CE%B2-catenin+protects+mouse+hearts+from+ventricular+arrhythmias+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction.</a> Scientific Reports. 11 (1), 17722(2021).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+exercise+training+on+the+FNDC5%2FBDNF+pathway+in+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats.</a> Physiological Reports. 7 (24), 14323(2019).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+Nod1%2FRIP2+signaling+is+essential+for+cardiac+hypertrophy+but+requires+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+for+signal+transductions+and+energy+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance.</a> Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).</li>
<li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+expression+associates+with+inflammation+in+early+atherosclerosis+in+humans+and+can+be+therapeutically+silenced+to+reduce+NF-%CE%BAB+activation+and+atherogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice.</a> Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).</li>
<li>Gharibeh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+is+a+regulator+of+sinus+node+development+and+heart+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118(2021).</li>
<li>Lu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+suppression+of+Scn5a+gene+expression+mediates+cardiac+Na%2B+channel+inhibition+by+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling.</a> Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).</li>
<li>Liang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phosphoinositide+3-kinase+%7Balpha%7D%2C+protein+kinase+C%2C+and+L-type+Ca2%2B+channels+in+mediating+the+complex+actions+of+angiotensin+II+on+mouse+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility.</a> Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).</li>
<li>Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+quiescent+cardiomyocytes+to+pacemaker+cells+by+expression+of+Tbx18%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18.</a> Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).</li>
<li>Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+complete+atrioventricular+block+recapitulates+clinical+indices+of+bradycardia+and+provides+a+platform+to+test+disease-modifying+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6930(2019).</li>
<li>Cingolani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+to+inhibit+the+calcium+channel+beta+subunit%3A+Physiological+consequences+and+pathophysiological+effects+in+models+of+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy.</a> Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).</li>
<li>Ionta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHOX2+overexpression+favors+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+pacemaker+cells%2C+improving+biological+pacing+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).</li>
<li>Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ventricular+refractoriness.+Effects+of+cycle+length%2C+pacing+site+and+atropine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine.</a> Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).</li>
<li>Segel, L. D., Ensunsa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin+improves+stability+and+longevity+of+perfluorochemical-perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts.</a> The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).</li>
<li>Hong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+inflammasome+as+a+potential+treatment+in+ischemic+stroke+concomitant+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121(2019).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-NLRP3+inflammasome+activation+exacerbates+cardiac+dysfunction+after+ischemic+stroke+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes.</a> Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral-cardiac+syndrome+and+diabetes%3A+Cardiac+damage+after+ischemic+stroke+in+diabetic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state.</a> Frontiers in Immunology. 12, 737170(2021).</li>
<li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li>
<li>Allison, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroconductive+nanoengineered+biomimetic+hybrid+fibers+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).</li>
<li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+human+cardiac+myocytes+for+medical+research%3A+Promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges.</a> Stem Cells International. 2017, 4528941(2017).</li>
<li>Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-based+treatment+of+acquired+heart+block%3A+The+battle+for+tomorrow+has+begun%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation.+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331(2017).</li>
<li>McLaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+human+recombinant+collagen+matrices+limit+adverse+remodeling+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 4866(2019).</li>
<li>Villanueva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxalase+1+prevents+chronic+hyperglycemia+induced+heart-explant+derived+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction.</a> Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).</li>
<li>Kanda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+paracrine+repair+of+injured+myocardium+using+microfluidic-based+cocooning+of+heart+explant-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells.</a> Biomaterials. 247, 120010(2020).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없습니다.

Langendorff-관류 및 격리 된 심장 준비의 성공을 위해서는 몇 가지 단계가 중요합니다. 첫째, 심장 수집 중 심장 손상을 피하는 것이 중요합니다 (예 : 실수로 짜내거나 가위로 자르는 경우). 둘째, 수집 된 심장을 가능한 한 빨리 차가운 Tyrode 용액에 넣는 것이 심장 박동을 멈추고 심장의 산소 소비를 줄이기 때문에 중요합니다. 셋째, 대동맥에 삽입하는 바늘이 너무 깊어서는 안되며, 이상적으로는 바늘 끝이 대동맥 판막 수준에 가까워 심장이 관상 동맥을 통해 잘 관류되도록해야합니다. 마지막으로, 관류 바늘의 기포는 대동맥 캐뉼러 형성 전에 제거해야 합니다.—일반적으로 캐뉼러 직전에 몇 초 동안 펌프를 켜서 바늘 끝의 기포를 제거하는 것이 도움이 됩니다.
Langendorff- 관류 심장 제제는 동물에 대한 생체 내 연구에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 심장에 적용되는 약물 (예 :이 연구에서 사용 된 이소 프로 테레 놀)의 농도와 지속 시간을...

심혈관 질환은 전 세계적으로 주요 사망 원인으로 2017년에만 1,800만 명의 목숨을 앗아갔습니다1. 설치류, 특히 마우스와 쥐는 취급의 용이성과 다양한 형질전환 과발현 또는 녹아웃 라인의 가용성으로 인해 심혈관 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 모델이 되었습니다. 설치류 모델은 질병 메커니즘을 이해하고 심근 경색2, 고혈압3, 심부전4 및 죽상 동맥 경화증5에서 잠재적 인 새로운 치료 표적을 식별하는 데 기본이되었습니다. 그러나 심장 부정맥 연구에서 설치류의 사용은 인간 또는 대형 동물 모델에 비해 작은 심장 크기와 빠른 심박수로 인해 제한됩니다. 따라서 심근 경색 후 생쥐 또는 쥐의 자발적인 치명적인 부정맥은 드물다2. 연구자들은 부정맥 부담이나 부정맥 경향의 의미있는 변화를 보여주지 않고 섬유증이나 유전자 발현과 같은 친 부정맥 기질을 반영 할 수있는 간접적 인 2 차 변화에 집중해야합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 유전자 변형 6,7 또는 심근 경색2 후에 심실 성 빈맥에 대한 마우스 및 래트 심장의 감수성을 신뢰성있게 평가할 수있는 방법이 본 프로토콜에 기재되어있다. 이 방법은 아드레날린 수용체 자극과 프로그램 된 전기 자극을 결합하여 분리 된 Langendorff 관류8 마우스 및 쥐 심장에서 심실 성 빈맥을 유도합니다.
설치류 심근 조직에서 바이러스 유전자 전달을위한 표준 접근법은 종종 침습적 절차이며 절차 후 동물의 회복 지연과 관련된 개흉술 9,10,11에 의한 심장 노출을 포함합니다. 이 논문은 전이유전자의 과발현에 대한 초음파 영상 유도 하에 바이러스를 직접 심근내 주사하는 방법을 설명한다. 이 덜 침습적 인 절차는 개흉술에 비해 바이러스 주사 후 더 빠른 동물 회복과 조직 손상을 허용하고 동물의 수술 후 통증과 염증을 줄여 심장 기능에 대한 형질 전환 유전자의 효과를 더 잘 평가할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>30 G 1/2 PrecisionGlide Needle</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>아데노-연관 바이러스 (AAV9-GFP)</td><td>Vector Biolabs</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>아데노바이러스 (Ad-GFP)</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>아데노바이러스 (Ad-Wnt3a)</td><td>Vector Biolabs</td><td>ADV-276318</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet (Level II)</td><td>Microzone Corporation</td><td>N/A</td><td>모델 #: BK-2-4</td></tr><tr><td>부프레노르핀</td><td>Vetergesic</td><td>DIN 02342510</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마-알드리치</td><td>102378</td><td></td></tr><tr><td>D-포도</td>당 <td>피셔 케미컬</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>이발기</td><td>WAHL 클리퍼 코퍼레이션</td><td>78001</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴 주사기</td><td>시그마-알드리치</td><td>20701</td><td>705 LT, 볼륨 50 &mu; L</td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Life Brand</td><td>E12107</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Fresenius Kabi</td><td>DIN 02264315</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Fresenius Kabi Ltd.</td><td>M60303</td><td></td></tr><tr><td>이소 프로테레놀 염산염</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>1351005</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 8 소프트웨어</td><td>ADInstruments Inc.</td><td>ECG 기록용</td> <td>버전 8.1.5</td></tr>: <tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>마우스(Ctnnb1flox/flox)</td><td>Jackson Labs</td><td>4152</td><td></td></tr><tr><td>마우스(&alpha; MHC-MerCreMer)</td><td>Jackson Labs</td><td>5650</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>for Langendorff 시스템</td></tr><tr><td>MS400 변환기</td><td>VisualSonic Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>안과 연고</td><td>Systane</td><td>DIN 02444062</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>압력계</td><td>NETECH</td><td>DigiMano 1000</td><td>Langendorff 시스템용</td></tr><tr><td>펌프</td><td>Cole-Parmer</td><td>UZ-77924-65</td><td>Langendorff 시스템용</td></tr><tr><td>쥐(Sprague-Dawley, 남성)</td><td>Charles River</td><td>400</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>메스 핸들</td><td>Fine Science Tools</td><td>10007-12</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 엘라스토머</td><td>Down Inc.</td><td>Sylgard 184</td><td>Langendorff 시스템용</td></tr><tr><td>소동물 ECG 시스템</td><td>ADInstruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Powerlab 8/35 및 Animal Bio Amp</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>자극기</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>VEVO3100 전임상 이미징 시스템</td><td>VisualSonic Inc.</td><td>해당 사항 없음</td><td></td></tr></tbody></table>

설치류 심장에서의 바이러스 전이 유전자 발현 및 심장 부정맥 위험 평가

Viral Transgene Expression in Rodent Hearts and the Assessment of Cardiac Arrhythmia Risk

심장병은 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 취급의 용이성과 형질 전환 균주의 풍부함으로 인해 설치류는 심혈관 연구의 필수 모델이되었습니다. 그러나 심장병 환자에서 종종 사망을 유발하는 자발적인 치명적인 심장 부정맥은 설치류 심장 질환 모델에서 드뭅니다. 이것은 주로 인간과 설치류 사이의 심장 전기적 특성의 종 차이 때문이며 설치류를 이용한 심장 부정맥 연구에 도전을 제기합니다. 이 프로토콜은 재조합 바이러스 (아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)의 심초음파-유도 근육내 주사를 사용하여 마우스 및 래트 심실 심근에서 효율적인 전이유전자 발현을 가능하게 하는 접근법을 설명한다. 이 연구는 또한 아드레날린 성 및 프로그램 된 전기 자극을 모두 사용하여 분리 된 Langendorff 관류 마우스 및 쥐 심장을 사용하여 부정맥에 대한 심장 감수성을 신뢰할 수있는 평가를 가능하게하는 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 심근 경색과 같은 부상 후 불리한 심장 리모델링과 관련된 심장 리듬 장애를 연구하는 데 중요합니다.

여기에 설명된 프로토콜(그림 1)에 따라 관류되면 분리된 쥐 또는 마우스의 심장이 최소 4시간 동안 리드미컬하고 안정적으로 박동합니다. 실험 설계가 더 긴 기간의 심장 관류를 요구하는 경우, 장기간 관류 후 심근 부종의 발생을 줄이기 위해 관류 용액에 알부민을 첨가하는 것이 도움이됩니다14. 관류 용액에 이소 프로 테레 놀을 포함시키는 것은 심근 경색 및 심부전과 같은 많은 부정맥 상태에서 발생하는 교감 신경계의 활성화를 모방합니다. 프로그래밍된 전기 자극 동안 심장의 성공적인 페이싱은 (1) 연속적인 S1 자극 동안 심장 박동의 1:1 캡처 및 (2) S1 페이싱 중 연장된(또는 더 넓은) QRS 복합체에 의해 확인됩니다(그림 3 및 그림 4). 후자는 심장이 정점에서 진행되고 심실 조직에서 활성화의 느린 전도가 QRS 복합 ...

본 프로토콜은 심초음파유도 하에 바이러스의 직접 심내내 주사에 의해 래트 및 마우스 심장에서 전이유전자 발현을 위한 방법을 기술한다. 격리 된 Langendorff 관류 심장의 프로그램 된 전기 자극에 의한 심실 부정맥에 대한 심장의 감수성을 평가하는 방법도 여기에 설명되어 있습니다.

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents ...

이 프로토콜을 통해 사용자는 심실 심근에서 효율적인 전이 유전자 발현을 달성하여 심장 부정맥을 검사하고 심실 조직에서 기능하기위한 유전자 발현 연구를 용이하게합니다. 바이러스 전이유전자 발현을 위한 기술은 동물에 대해 최소 침습적이며, 개흉술을 포함하는 기존의 접근법보다 손상이 적고 회복 시간이 단축됩니다. 작은 설치류 심장에서 부정맥을 유도하는 기술은 심장 질환의 작은 동물 모델에서 부정맥에 대한 감수성을 평가하는 데 유용합니다.이 절차를 시연하는 것은 실험실의 박사후 연구원 인 Alice Lu 박사가 될 것입니다. 시작하려면 마취 된 마우스의 왼쪽 가슴 아래 부위를 요오드 기반 또는 클로르헥시딘 기반 스크럽을 알코올로 번갈아 가며 원형 운동으로 3 번 멸균하십시오. 초음파 영상 안내에 따라 바이러스가 들어있는 주사기의 바늘을 동물의 가슴에 삽입하십시오.바늘 끝을 좌심실 전면 자유 벽에 접근하고 10-15 마이크로 리터의 바이러스를 천천히 주입하십시오. 바늘 끝 근처의 향상된 밝기로 초음파 이미지에서 성공적인 주입을 확인하십시오. 심장에서 바늘을 빼내고 좌심실의 다른 부위에 삽입하여 같은 양의 바이러스를 두 번째 및 세 번째로 주사합니다.마우스 심장의 Langendorff 관류를 수행하려면 캐뉼러 된 심장을 실리콘 엘라스토머로 코팅 된 10cm 플라스틱 접시에 넣고 좌심실이 위를 향하게하십시오. 일정한 유속 모드에서 수정 된 Langendorff 풍부 시스템에 연결된 무딘 바늘로 심장의 대동맥을 캐뉼러하십시오. 섭씨 37도에서 산소 거품이 있는 Tyrode 용액으로 심장을 관류하십시오.관류가 시작될 때 처음 2-3 번의 심장 박동 동안 심장에서 혈액이 씻겨 나가는 것을 관찰하고 심장 색을 빨간색에서 창백함으로 변경하여 올바른 대동맥 캐뉼러를 확인하십시오. 관류 압력을 수은 70-80mm로 유지하기 위해 유량을 조정하십시오. 확인 후, 작은 동물 ECG 시스템의 전극을 접시의 실리콘 엘라스토머 코팅에 삽입하여 심장 주위에 놓습니다.그런 다음 호환되는 소프트웨어를 사용하여 ECG를 기록합니다. 다음으로, 아드레날린 수용체 자극을 수행하고 이소 프로 테레 놀과 티로드 용액으로 심장을 관류시킵니다. 10분 후, 전기 자극기에 연결된 두 개의 백금 전극으로 정점에서 심장을 자극하여 심실 빈맥을 유도하도록 프로그래밍된 전기 자극을 수행합니다.초기 10 개의 연속 자극 S1로 자극 절차를 시작한 다음 초기 간격이 80 밀리 초인 추가 자극 S2로 시작합니다. 그런 다음 심장 박동을 더 이상 캡처할 수 없거나 심장의 유효 불응 기간(ERP)에 도달할 때까지 매번 S2 간격을 2밀리초씩 반복적으로 줄입니다. 심실성 빈맥 및 세동을 포함한 유도 된 심실 성 빈맥을 ECG로 모니터링하십시오.부정맥이 유발되지 않는 경우. ERP에 도달할 때까지 동일한 매개변수를 사용하여 S2 다음에 또 다른 추가 자극인 S3를 추가합니다. 심실 빈맥이 여전히 유도되지 않으면 전기 자극을 중단하고 심장을 비 유도성으로 간주하십시오.프로그래밍된 전기 자극 동안, 심장의 성공적인 페이싱은 연속적인 S1 자극 동안 심장 박동의 일대일 캡처와 S1 페이싱 동안 연장된 QRS 복합체에 의해 확인됩니다. 이러한 아드레날린 및 전기 자극의 조합은 건강하고 가짜 수술을 하는 야생형 마우스 심장 또는 대조군 아데노바이러스-GFP 주입 쥐 심장에서 심실 빈맥을 유발하지 않았습니다. 대조적으로, 동일한 프로토콜은 심근 경색 후 야생형 마우스 심장의 77 %와 Ad-Wnt3a의 심근 주사 후 4 마리 중 3 마리에서 심실 빈맥을 유도했습니다.바늘을 삽입하는 동안 바늘 끝이 심실 내부가 아닌 자유 벽 안에 내장되어 있는지 확인하십시오. 또한 심장의 대동맥을 고정하고 캐뉼러하는 것이 가장 중요한 단계입니다. 이러한 절차에 따라 심장은 표준 조직학 연구 또는 분자 생물학 분석에 사용될 수 있습니다.대안적으로, 단일 세포 전기 생리학 연구를 수행하기 위해 살아있는 세포를 분리 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Telemetric ECG는 심장 arrhythmias과 갑작스런 심장 죽음에 대한 동물 모델을 평가 필수적인 도구로 떠오르고있다. 여기, 우리는 생쥐의 장기 외래 ECG 모니터링 응용 프로그램에 대한 telemetric ECG 녹음에 stepwise 가이드를 제시한다.

마우스의 외래 ECG 기록

허혈성 심장 마비의 치료를위한 유전자 전달의 방법은 심근 경색의 돼지 모델을 사용하여 설명합니다. 우리 간단하고 재현성 방법은 우리가 쉽게 매우 간단하고 재현성 방법으로 다양한 유전자 전송의 효능을 평가할 수 있습니다.

잠복기 모델에서 허혈성 심장 마비에 대한 유전자 전송

이 비디오에서는 새끼 쥐에서 재조합 아데노 관련 바이러스 기반 유전자 전달을 보여줍니다. 이 방법은 표적 세포의 유전자 발현을 연구하는 데 도움이 됩니다.

재조합 아데노 관련 바이러스 기반 유전자 전달: 설치류 모델에서 이식유전자 전달 및 심장 특이적 발현을 위한 기술

이 프로토콜은 컨포칼 회전 디스크 현미경을 사용하여 렌티바이러스 및 아데노바이러스 형질도입 후 1차 쥐 신생아 심근세포를 사용하여 살아있는 세포를 이미징하는 방법을 설명합니다. 이를 통해 살아있는 심근세포의 세포 과정을 자세히 관찰할 수 있습니다.

차 쥐 신생아 심근 라이브 셀 이미징은 아데노 바이러스 다음과 렌티 바이러스 형질 도입은 공 초점 현미경 디스크를 회전시키는 사용

이 원고에서는 마우스 심장에서 유전자 발현을 조작하기 위해 재조합 아데노 관련 바이러스 9(rAAV9) 벡터를 준비하는 방법에 대해 설명합니다.

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Intramyocardial 쥐에 주입 하 여 심장 관련 유전자 조작 비보에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법

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허혈성 심장 질환에 대한 심근 유전자 치료는 미래 치료법에 대한 큰 가능성을 가지고 있습니다. 여기에서는 허혈성 심장에서 유전자 치료의 효능을 평가하기 위한 거대 동물 모델을 소개합니다.

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마우스 배아 심장에서 유전자 전달을 위한 효율적인 transgenesis 접근법

배우세요 초음파 유도 심근내 바이러스 주사를 이용한 설치류 심장의 효율적인 유전자 발현 기법과 Langendorff 관류를 통한 심실 부정맥 유발 평가 방법을. 이 프로토콜은 심장 질환 연구에 활용됩니다.

설치류 심장에서의 바이러스 전이 유전자 발현 및 심장 부정맥 위험 평가

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