Name: Nippostrongylus brasiliensis 감염 모델에서 IL-9 생성 림프 세포 연구를 위한 전략 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 배우세요 Nippostrongylus brasiliensis 감염 모델에서 IL-9 생성 T 세포와 ILC2 세포를 분리하고 유세포 분석으로 특성화하는 방법입니다. 이 기술은 면역 반응 연구에 필수적입니다.

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저자는 José Luis Ramos-Balderas의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 CONACYT(FORDECYT-PRONACE-303027)에서 PLL에 대한 다음 보조금으로 지원되었습니다. OM-P와 EO-M은 CONACYT(각각 736162 및 481437)로부터 펠로우십을 받았습니다. MCM-M은 CONACYT(Estancias Posdoctorales por México 2022(3))로부터 펠로우십을 받았습니다.

여기에 설명 된 모든 동물 실험은 멕시코 국립 자치 대학교 세포 생리학 연구소의 내부 동물 취급위원회 (CICUAL)의 승인을 받았습니다.
참고: 전체 프로토콜의 순서도는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 생쥐의 주거
<ol><li>8-10주령의 암컷 또는 수컷 생쥐를 12시간 명암 주기로 일정한 온도와 습도를 가진 동물 시설에 수용하고 물과 음식에 임의 로 접근할 수 있습니다. 참고: 이 프로토콜은 이전에 설명한 대로 C57BL/6 배경에서 IL-9 리포터 마우스 균주를 사용합니다4; 그러나, 다른 IL-9 리포터 균주(reporter strain 6,7,8)와 세포내 IL-9 염색(intracellular IL-9 staining)을 사용할 수 있으며, 다양한 결과가 나온다9.</li>
</ol>2. 생쥐 감염
<ol><li>감염 1 일 전에 몸의 중앙에서 꼬리 기저부 근처까지 생쥐의 등을 면도하십시오. 마취제의 사용은 필수적이지 않습니다.</li>
	<li>앞서설명한 바와 같이 허리에 100μL의 인산염 완충 식염수(PBS)10에 200마리의 생존 가능한 3기 N. brasiliensis 유충(L3)을 각 마우스에 피하 접종하거나, 대조군으로 PBS 단독으로 100μL를 주사합니다. 감염 후 4일째, 7일째 또는 10일째에 동물을 희생합니다.</li>
</ol>3. 폐, 소장, 종격동 및 장간막 림프절의 분리
<ol><li>자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시킵니다. 마우스를 등에 대고 70% 에탄올을 뿌립니다. 가위로 정중선을 절개하고 피부를 열어 복부와 흉부 부위를 노출시킵니다. 참고: 이소플루란은 대체 안락사 방법으로 사용할 수 있습니다12. 이산화탄소 챔버는CO2 가 폐 조직 손상과 출혈을 유발하므로 권장하지 않는다13.</li>
	<li>종격동 림프절과 폐의 분리<ol><li>흉골을 절개하고 "V"자 모양으로 잘라 갈비뼈와 흉부 근육을 제거합니다. 흉강이 노출되면 심장 아래 식도 옆에 있는 종격동 림프절을 찾습니다( 보충 그림 1 참조).</li>
		<li>종격동 림프절을 추출하여 12웰 배양 플레이트의 R-10 배지(표 1) 1mL에 수집합니다. 처리 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오. 참고: 샘플은 이 실험에 사용된 리포터 마우스의 형광 신호가 감소하지 않도록 빛으로부터 보호되어야 합니다.</li>
		<li>폐를 추출하고 마우스당 12웰 배양 플레이트의 R-10 배지 1mL에 수집합니다. 처리 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>장간막 림프절 사슬과 소장의 분리<ol><li>복강을 노출시키고 소장을 오른쪽으로 조심스럽게 움직여 결장을 따라 장간막 림프절(MLN) 사슬을 노출시킵니다.</li>
		<li>집게를 사용하여 MLN을 제거하고 종이 타월로 부드럽게 굴려서 지방을 빼냅니다.</li>
		<li>MLN을 12-웰 배양 플레이트에서 1mL의 R-10 배지로 옮깁니다. 처리 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>유문 괄약근 바로 아래와 맹장 위의 소장을 자릅니다. 집게를 사용하여 장을 천천히 당겨 부착 된 장간막과 지방 조직을 제거하십시오.</li>
		<li>소장을 종이 타월에 놓고 PBS로 충분히 적시십시오. 가위로 소장에서 Peyer의 패치를 제거하십시오. 알림: 생존력을 유지하려면 남은 지방 조직을 제거하고 전체 과정에서 PBS로 소장을 촉촉하게 유지하십시오.</li>
		<li>가위를 사용하여 소장을 세로로 자르고 집게를 열린 장 위로 부드럽게 밀어 배설물과 점액을 제거합니다.</li>
		<li>겸자로 소장을 잡고 얼음 위에 PBS 5mL로 몇 번 조심스럽게 담그고 씻습니다. 두 번 반복하십시오.</li>
		<li>소장을 짧은 조각(약 5mm)으로 자르고 2% FBS가 포함된 10mL의 HBSS14 가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 수집합니다(표 1). 즉시 상피내 및 고유판 세포를 계속 분리하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 소장, 폐 및 림프절에서 단세포 현탁액의 제조
참고: 소장에서 단세포 현탁액을 준비할 때 1인당 최대 6마리의 마우스를 처리하는 것이 매우 중요한데, 이는 처리 기간이 길어질수록 세포 생존력이 크게 감소하기 때문입니다. 이 방법은 Heligmosomoides polygyrus 감염 마우스 모델5에서 채택되었습니다.
<ol><li>진탕 배양기, R-20 배지, HBSS, 및 HBSS-2 mM EDTA(표 1)를 37°C에서 예열하였다.</li>
	<li>시료당 10mL의 소장 소화 배지(표 1)를 준비합니다.</li>
	<li>3.3.8 단계의 내장 조각을 손으로 세게 흔듭니다.</li>
	<li>유리 깔때기 위의 나일론 메쉬(약 10cm x 10cm)를 통해 각 샘플을 여과합니다. 메쉬 위에 예열된 HBSS 10mL를 추가하여 샘플을 세척하고 플로우 스루를 버립니다. 한 번 더 반복하십시오. 알림: 각 샘플에 새 메쉬를 사용하고 절차 전반에 걸쳐 재사용하십시오.</li>
	<li>깔때기에서 메쉬를 제거하고 50mL의 따뜻한 HBSS-10mM EDTA가 있는 2mL 원뿔형 튜브의 메쉬에서 샘플을 수집합니다(4.1단계). 37°C에서 10분 동안 인큐베이션하고 200rpm으로 진탕합니다.</li>
	<li>최대 속도(3,200rpm)로 10초 동안 소용돌이치고 유리 깔때기 위에 메쉬로 샘플을 여과하여 50mL 원뿔형 튜브에서 유동을 회수합니다.</li>
	<li>4.5단계와 4.6단계를 두 번 반복하여 동일한 50mL 원뿔형 튜브에서 플로우 스루를 회수합니다. 상피내 세포는 이 30mL 분획에 있습니다. 나머지 조직을 저장하십시오.</li>
	<li>상피내 세포로부터의 단세포 현탁액 제제<ol><li>4.7단계에서 회수한 30mL의 세포 현탁액을 실온(RT)에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오.</li>
		<li>5mL의 PBS를 첨가하고 RT에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리합니다.</li>
		<li>세포 펠릿을 RPMI 10% FBS-20μg/mL DNase 3mL에 재현탁합니다(표 1). 세포가 염색 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>고유판 세포로부터의 단일 세포 현탁액 제조<ol><li>깔때기 위의 메쉬를 통해 따뜻한 HBSS 10mL 이상을 부어 4.7단계에서 남은 소장 조직을 세척합니다. 세탁을 반복하십시오. 10mL의 소장 소화 배지가 있는 50mL 원뿔형 튜브의 메쉬에서 조직을 수집합니다.</li>
		<li>37°C에서 30분 동안 인큐베이션하고 200rpm으로 진탕합니다. 5분마다 최대 속도로 10초 동안 소용돌이칩니다.</li>
		<li>10mL의 FACS-EDTA 완충액(표 1)을 첨가하여 소화 반응을 중지하고 얼음 위에 올려 놓는다.</li>
		<li>혈청학적 피펫을 사용하여 100μm 세포 여과기를 통해 각 샘플을 여과하고 얼음 위에 놓인 50mL 원뿔형 튜브에서 현탁액을 회수합니다.</li>
		<li>4 °C에서 600 x g 로 6분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>상청액을 버리십시오. 세포 펠릿을 5 mL의 PBS로 세척하고, 4°C에서 6분 동안 600 x g 에서 원심분리하였다.</li>
		<li>상층액을 버리고 세포 펠릿을 RPMI 10% FBS-20μg/mL DNase 1mL에 재현탁합니다. 세포가 염색 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>폐에서 단일 세포 현탁액 준비 참고: 각 폐와 소장은 세포 생존율이 낮은 취급 시간이 연장되는 것을 방지하기 위해 두 사람이 병렬로 처리해야 합니다.<ol><li>처리된 샘플당 4mL의 폐 소화 배지(표 1)를 준비합니다.</li>
		<li>단계 3.2.3에서 폐를 함유하는 웰로부터 RPMI 배지를 제거한다. 가는 가위로 폐를 작은 조각으로 자릅니다.</li>
		<li>주걱을 사용하여 폐 조각을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 4mL의 폐 소화 배지를 추가합니다(표 1).</li>
		<li>37°C에서 30분 동안 인큐베이션하고 250rpm에서 진탕합니다. 완료되면 각 샘플이 처리될 때까지 얼음에 보관하십시오.</li>
		<li>6웰 배양 플레이트의 단일 웰에 위치한 100μm 세포 여과기를 통해 각 샘플을 여과합니다. 주사기 플런저로 조직을 분리하십시오.</li>
		<li>각 샘플을 15mL 원뿔형 튜브에서 회수하고 4mL의 R-2 배지를 추가합니다(표 1). 다른 샘플이 처리되는 동안 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>4 °C에서 5분 동안 600 x g 로 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 R-5 배지에 재현탁합니다(표 1).</li>
		<li>원심분리하는 동안, 조혈 세포 분획15,16을 농축하기 위해 시료 당 4 mL의 27.5% 밀도-구배 용액(표 1)을 준비한다. 단세포 분리를 위한 이러한 전략은 다른 유사한 밀도 구배 배지에 비해 더 효율적이고 비용 효율적이며 독성이 적다(17).</li>
		<li>4.10.7 단계의 세포 현탁액 1 mL에 27.5 % 밀도 구배 용액 4 mL를 넣고 세게 흔든다.</li>
		<li>혼합 현탁액 위에 R-5 배지 (표 1)를 천천히 추가하여 두 개의 상을 만듭니다.</li>
		<li>RT에서 1,500 x g 에서 20분 동안 원심분리기를 사용하고 가속을 낮추고 브레이크를 끕니다. 두 위상 사이에 형성된 고리를 관찰하십시오.</li>
		<li>1mL 마이크로피펫으로 두 상 사이에 형성된 링을 회수하고 4mL의 R-2 배지에 재현탁합니다.</li>
		<li>4 °C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오. 세포 펠릿을 1mL의 ACK 완충액에 재현탁하고(표 1), RT에서 1분 동안 인큐베이션합니다.</li>
		<li>4 mL의 R-5 배지를 첨가하고 4 °C에서 5 분 동안 450 x g 에서 원심 분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 R-10 배지에 재현탁합니다. 유세포 분석을 위해 염색될 때까지 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>림프절에서 단일 세포 현탁액 준비<ol><li>3.2.2 또는 3.3.3 단계의 림프절을 6-웰 배양 플레이트의 웰에 있는 두 개의 메쉬 조각 사이에 놓고 주사기 플런저로 해리합니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 1.5 mL 원뿔형 튜브에서 회수하고, 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리하였다.</li>
		<li>상층액을 버리고 세포 펠릿을 R-10 배지 1mL에 재현탁합니다. 유세포 분석을 위해 염색될 때까지 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오. 알림: 덩어리가 보이면 s를 걸러냅니다.amp100μm 셀 스트레이너를 통해 s.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 유세포 분석을 위한 세포 염색(그림 2 및 그림 3)
참고: 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 단계 4.11.3의 림프절 세포 현탁액을 원심분리하고, 세포 펠릿을 500 μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다(표 1).
<ol><li>ILC2s 식별을 위한 세포 염색(그림 3 및 보충 그림 2) 참고: 이 염색 절차는 IL-9 발현 ILC2 세포의 식별에 특이적입니다.<ol><li>플레이트 4.10.14 단계로부터의 폐 샘플 당 150 μL (대략 1.8 x 10 6 세포) 및 단계 4.11.3으로부터의 림프절 샘플 당 50 μL (종격동 및 장간막 림프절 샘플에 대해 각각 대략 0.7 x 10 6 및 2.2 x 106 세포) 96 웰 원뿔형 바닥 배양 플레이트에서. 100 μL의 FACS 완충액을 첨가하고, 4°C에서 5분 동안 450 x g에서 원심분리한다.</li>
		<li>96웰 원뿔형 바닥 배양 플레이트에서 4.8.3 및 4.9.7 단계로부터의 소장 샘플(상피내 및 고유판 샘플의 경우 각각 약 2.7 x 10 6 및0.6 x 106 세포)당 100 μL를 플레이트에 넣는다. 150 μL의 FACS 완충액을 첨가하고 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리합니다.</li>
		<li>상청액을 버리고, FACS 완충액에 희석된 비오티닐화 항체 칵테일(표 2)의 50 μL에 각각의 세포 펠렛을 재현탁시켰다. 빛으로부터 보호되는 4°C에서 30분 동안 배양한다. 참고: 상피내 및 고유판에 대해 20μg/mL DNase와 함께 FACS 버퍼를 사용하십시오.amp르.</li>
		<li>150 μL의 FACS 버퍼를 추가합니다. 4 °C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리합니다.</li>
		<li>상청액을 버리고, 세포 펠릿을 200 μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다. 다시 원심분리하고 상층액을 버립니다.</li>
		<li>세포 펠릿을 항체/염색 칵테일 50μL에 재현탁하고(표 2), 빛으로부터 보호되는 4°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>150 μL의 FACS 버퍼를 추가합니다. 4 °C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리합니다.</li>
		<li>상청액을 버리고, 세포 펠릿을 200 μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다. 다시 원심분리하고 상층액을 버립니다. 세척 (5.1.7 단계)을 반복하고 상청액을 버립니다.</li>
		<li>300 μL의 FACS 완충액에 세포 펠릿을 재현탁하고, 유세포 분석에 의해 분석한다.</li>
		<li>소장 및 폐 샘플의 경우 림프구, 단일 세포, 살아있는 세포, 조혈 세포, CD90+계통 세포, ST2+ 세포 및 IL-9+ 세포와 같은 게이팅 전략을 사용합니다(그림 3A, B 및 보충 그림 2A). 림프절 샘플의 경우 살아있는 세포, 단일 세포, CD90+ 계통 세포, ST2+ 세포 및 IL-9+ 세포와 같은 게이팅 전략을 사용합니다(보충 그림 2B, C).</li>
	</ol></li>
	<li>IL-9 생성 림프구의 동정을 위한 세포 염색(그림 2 및 보충 그림 3)<ol><li>폐 샘플당 800μL를 4.10.14단계에서 1.5mL 튜브(약 14.6 x 106 세포)로 옮깁니다. 4 °C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오.</li>
		<li>림프절 샘플의 경우, 400 μL의 세포 현탁액을 단계 4.11.3 (종격동 및 장간막 림프절 샘플에 대해 각각 대략 5.6 x 106 및 17.5 x 10 6 세포)을 96-웰 원뿔형 바닥 플레이트에 2단계로 플레이트한다.<ol><li>먼저 200 μL를 옮기고, 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 버린다.</li>
			<li>또 다른 200 μL를 해당 웰로 옮깁니다. 4°C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리하고, 상청액을 버린다.</li>
		</ol></li>
		<li>세포 펠릿을 항체/염색 칵테일 50-400μL에 재현탁하고(표 3), 빛으로부터 보호된 4°C에서 30분 동안 배양합니다. 참고: 폐 샘플은 400μL, 종격동 림프절 샘플은 50μL, 장간막 림프절 샘플은 염색 칵테일 100μL에 재현탁해야 합니다.</li>
		<li>150 μL의 FACS 완충액을 종격동 림프절 샘플에 추가하고 100 μL의 장간막 림프절 샘플을 추가합니다. 4°C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리하고, 상청액을 버린다.</li>
		<li>펠릿을 각각 1 mL 및 200 μL의 FACS 완충액에 재현탁하여 폐 및 림프절 샘플을 세척한다. 4 °C에서 5분 동안 450 xg 로 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세척을 반복하십시오.</li>
		<li>폐 샘플을 600μL의 FACS 완충액에 재현탁하고 유세포 분석으로 분석합니다. 림프구, 단세포, 살아있는 세포, 조혈 세포, CD4+TCRβ+ 세포 및 IL-9+ 세포와 같은 게이팅 전략을 사용합니다(그림 2A).</li>
		<li>림프절 샘플을 300μL의 FACS 완충액에 재현탁하고 유세포 분석으로 분석합니다. 림프구, 단일 세포, 살아있는 세포, CD4+ TCRβ+ 세포 및 IL-9+ 세포와 같은 게이팅 전략을 사용합니다(그림 2B 및 보충 그림 3A).</li>
	</ol></li>
</ol>6. 단세포 현탁액에서 세포의 절대 수 측정
<ol><li>4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 및 4.11.3 분리 단계의 샘플을 PBS로 1:20 비율로 희석합니다(샘플 10μL + PBS 190μL).</li>
	<li>6.1단계에서 희석된 각 샘플 10μL를 트리판 블루 10μL와 혼합합니다. 혈구계에 10 μL를 넣고 각 희석을 고려하여 살아있는 세포를 계수합니다.</li>
	<li>유세포 분석에 의해 결정된 살아있는 세포(생존율 염료 음성 세포)로부터 관심 대상 집단의 백분율에 분리 후 단세포 현탁액의 총 살아있는 세포 수를 곱하고, 이 수를 100으로 나누어 세포의 절대 개수를 구한다(보충도 4, 보충도 5 및 보충도 6). 절대 수 = (유세포 분석에 의해 결정된 살아있는 세포에서 관심 모집단의 백분율 x 단일 세포 현탁액의 총 살아있는 세포 수)/100</li>
</ol>

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장내 기생충-숙주 상호 작용 및 기생충 감염에 대한 면역 반응에 대한 완전한 이해는 조직 리모델링 및 벌레 퇴학 유도에 핵심적인 다양한 세포 집단 및 이펙터 분자의 식별 및 분석이 필요합니다. 토양 매개 기생충 감염은 전 세계 개발 도상국에서 큰 문제입니다. 그러나 최근까지 이 감염의 영향을 받는 주요 기관인 소장에 존재하는 희귀 세포 집단을 분석할 수 있는 프로토콜은 사용할 수 없었습니다5. 이 프로토콜은 N. brasiliensis 감염 동안 폐, 종격동 및 장간막 림프절에서 IL-9 발현 림프 세포의 유세포 분석을 허용하는 이전에 설명한 방법을 다루며, 소장에서 처음으로 이 집단을 식별하는 추가 이점이 있습니다.
이 프로토콜의 성공 여부는 조직 처리 시간에 크게 좌우됩니다. 한 사람당 최대 6 개의 소장 샘플을 한 번에 처리하는 것이 필수적입니다. 다른 장기를 처리해야 하는 경우 다른 사람이 병행하여 처리하는 것이 ...

십이지장충은 전 세계적으로 약 7억 명의 사람들을 감염시키는 장내 기생충으로, 주로 저개발국의 열대 지역에서 발생합니다. 인간에게 가장 흔한 십이지장충 기생충인 십이지장 충 및 Necator americanus에 의한 고강도 감염은 빈혈과 단백질 결핍을 유발하여 성장과 정신 발달을 지연시킬 수 있습니다1. N. americanus 와 설치류 기생충 Nippostrongylus brasiliensis 는 숙주에서 원형의 제2형 면역 반응을 유도하고 수명 주기에서 유사성을 공유합니다. 따라서 N. brasiliensis 에 의한 생쥐의 감염은 인간 십이지장충 감염에 가장 일반적으로 사용되는 모델입니다. 3 단계 (L3) N. brasiliensis 감염성 유충은 감염 후 처음 몇 시간 동안 피부에서 폐로 이동합니다. 일단 폐에 들어가면 L4가 되어 기관을 따라 이동하여 삼키고 위를 통과하여 장에 도달하여 4-5일 이내에 성인(L5)이 됩니다. 장에서 L5 벌레는 기생충 수명 주기2를 다시 시작하기 위해 대변으로 배설되는 알을 낳습니다.
N. brasiliensis에 의해 유도된 면역 반응은 호산구 증가증, 호염구증, 잔 및 비만 세포 증식증과 함께 IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 및 IL-13을 포함한 여러 제2형 사이토카인의 증가, IgG1 및 IgE 생산 증가를 특징으로 합니다. N. brasiliensis 감염에 대한 면역 반응을 확인하고 정의하려는 대부분의 연구는 이 모델3에서 IL-4 또는 IL-13의 역할에 중점을 두고 있습니다. 그러나 IL-9 발현 세포의 식별 및 특성화와 이 사이토카인의 기능은 Licona-Limón et al. N. brasiliensis에 대한 면역 반응에서 IL-9의 중요한 역할을 입증하는 첫 번째 연구를 발표했습니다. 이 연구는 리포터 마우스를 사용하여 T 세포(대부분 T 헬퍼 9)와 제2형 선천성 림프 세포(ILC2s)를 감염 시 IL-9를 발현하는 주요 세포 하위 집합으로 설명했습니다4.
기생충에 감염된 폐에서 면역 세포의 분리 및 특성화가 가능하며 광범위하게 보고되었습니다 3,4. 그러나 내재된 조직 리모델링 및 점액 생성으로 인해 감염된 장에서 그렇게 하는 것은 Ferrer-Font et al.5의 최근 발표까지 기술적인 도전으로 판명되었습니다. 이 그룹은 Heligmosomoides polygyrus에 감염된 쥐 내장에서 면역 하위 집합의 단일 세포 현탁액을 분리하고 분석하는 프로토콜을 설명했습니다. 이를 기반으로 우리는 이제 N. brasiliensis에 감염된 장에서 IL-9 발현 림프 세포의 분리 및 세포 분석을 위한 프로토콜을 표준화했습니다. 또한, 우리는 감염 전반에 걸쳐 다양한 세포 소스와 해부학적 위치에서 IL-9 동역학을 확립했습니다.
이 감염과 관련된 뚜렷한 세포 집단을 특성화하는 것은 기생충에 대한 면역 반응과 숙주와의 상호 작용에 대한 더 넓은 이해에 매우 중요합니다. 이 포괄적인 프로토콜은 관심 질병 단계에서 원하는 기관에서 IL-9 생성 세포를 분리하고 분석하는 명확한 경로를 제공하여 N. brasiliensis 감염 및 일반적으로 기생충 감염에서 이러한 세포의 역할에 대한 지식을 급격히 향상시킬 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>ACK 버퍼</td><td>홈메이드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Attune Nxt 사이토미터</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B220</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>CD11c&nbsp;</td><td>바이오레전</td><td>드 117304</td><td></td></tr><tr><td>CD19&nbsp;</td><td>바이오레전</td>드 <td>115504</td><td></td></tr><tr><td>CD4</td><td>바이오레전</td><td>드 100404</td><td></td></tr><tr><td>CD4 (BV421)</td><td>바이오레전</td><td>드 100443</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2</td><td>바이오레전</td><td>드 109846</td><td></td></tr><tr><td>CD8&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>100703</td><td></td></tr><tr><td>CD90.2</td><td>Biolegend</td><td>105314</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td>특정 활성도: &ge; 10 000 단위/mg&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Facs ARIA II 분류기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Melody 세포 분류기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fc-Block</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>Fc & epsilon; RI</td><td>eBioscience</td><td>13589885</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td></td><td>유세포 분석 데이터 소프트웨어</td></tr><tr><td>Gr-1</td><td>Tonbo</td><td>305931</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Homemade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-9</td><td>biolegend</td><td>514103</td><td></td></tr><tr><td>NK1.1& 주의;</td><td>Biolegend</td><td>108704</td><td></td></tr><tr><td>나일론 메쉬</td><td>&nbsp; &lrm; lba</td><td>B07HYHHX5V</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep 밀도 그라디언트 중간</td><td>시그마</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수&nbsp;</td><td>집에서 만든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Siglec F&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>155512</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Biolegend</td><td>405206</td><td></td></tr><tr><td>TCR-&beta; &nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>109203</td><td></td></tr><tr><td>TCR-&베타; (체육/싸이7)</td><td>Biolegend</td><td>109222</td><td></td></tr><tr><td>TCR-&감마; &델타; &nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>118103</td><td></td></tr><tr><td>Ter119</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Tricine buffer&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>수제</tr><tr><td>좀비 아쿠아 고정식 생존 가능성 염료</td><td>Biolegend</td><td>423101</td><td></td></tr></tbody></table>

nippostrongylus brasiliensis 감염 모델에서 il-9 생성 림프 세포 연구를 위한 전략

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9는 항 종양 면역, 알레르기 병리의 유도 및 기생충 감염에 대한 면역 반응을 포함한 다양한 과정과 관련된 다면발현 사이토 카인으로 기생충 퇴학에 중요한 역할을합니다. Nippostrongylus brasiliensis 감염의 쥐 모델에서 IL-9는 주로 폐, 소장 및 배액 림프절에서 발견되는 CD4+ T 림프구 및 선천성 림프 세포에 의해 생성됩니다. IL-9의 세포내 염색과 관련된 기술적 어려움과 감염 시 소장에서 조혈 세포를 분리하는 복잡성을 감안할 때, 이 모델의 다양한 림프 및 비림프 조직에서 IL-9의 발현을 분석하기 위한 포괄적이지만 간단한 프로토콜이 절실히 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 감염 전반에 걸쳐 종격동 및 장간막 림프절뿐만 아니라 N. brasiliensis가 표적으로 하는 주요 기관인 폐 및 소장에서 CD4+ T 세포와 선천성 림프 세포에 의해 생성되는 IL-9의 동역학을 설명합니다. 또한 관심 있는 세포 유형과 기관에 따라 감염에 필요한 유충의 수를 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 N. brasiliensis 감염 모델에서 관심 있는 특정 세포, 기관 및 질병 단계에 집중할 수 있는 기회를 제공함으로써 시간과 자원을 절약하기 위한 분석의 표준화를 지원하는 것을 목표로 합니다.

마우스에 200 L3 단계 N. brasiliensis 유충 또는 가짜 대조군을 위한 PBS를 피하 주사했습니다. 이 프로토콜에 사용된 유충의 수는 림프 조직과 폐의 세포를 검출하는 데 더 많은 양의 벌레가 사용된 이전 보고서와 달리 폐, 림프 조직 및 소장에서 생존 가능한 세포를 분리하기 위해 조정되었습니다. 폐, 종격동 림프절, 장간막 림프절 및 소장을 감염 후 0, 4, 7 및 10일에 채취하여 림프구 분리 및 IL-9 생산 집단의 특성화를 수행했습니다. 총 27마리의 마우스를 분석된 시점 당 9개의 대조군 및 4 내지 6개의 N. 브라질리엔시스-감염된 마우스를 포함하는 2개 이상의 독립적인 실험에 사용하였다. 가짜 감염 대조군은 기저 수를 얻기 위해 모든 실험에 포함되었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 IL-9 생성 CD4+ T 세포(이 모델의 대부분 Th9 세포)를 정량화 및 추가 분석을 위해 폐, 장간막 및 종격동 림프절에서 분리할 수 있습니다....

IL-9 발현 T 및 ILC2 세포는 N. brasiliensis 감염 동안 유도되지만, 이들의 특성화는 낮은 빈도 및 차등 동역학으로 인해 감염된 장에서 크게 간과되었습니다. 이 프로토콜은 서로 다른 표적 기관에서 이러한 세포를 분리하고 서로 다른 감염 단계에서 유세포 분석을 통해 신원을 확인하는 방법을 설명합니다.

Nippostrongylus brasiliensis 감염 모델에서 IL-9 생성 림프 세포 연구를 위한 전략

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

이 프로토콜은 최근에 기술적으로 보이지 않았던 감염된 절단을 포함하여 N.brasiliensis에 감염된 비림프 조직에서 IL-9를 발현하는 림프 세포의 분리 및 특성화를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 또한 이러한 해부학적 부위에서 세포를 분리하는 본질적인 어려움으로 인해 이전에는 감염에서 인식되지 않았던 말초 조직의 세포 집단을 분석하기 위한 대안을 제공합니다. 이 방법을 사용하면 N.brasiliensis 감염 상처로부터 격리하기 어려운 개체군을 연구할 수 있으며 다른 기생충 감염에도 적용할 수 있어 인간의 십이지장충 감염에 대한 이해를 넓힐 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 Ofelia Mu입니다.

a-strategy-for-study-il-9-producing-lymphoid-cells-nippostrongylus

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Trichuris muris 감염은 모성 쥐가 보호 Th2 반응을 생성하고 민감한 쥐가 병적인 Th1 반응을 생성하는 Th2 면역의 창자 모델입니다.

Trichuris muris 감염 : 굿에서 2 형 내성 및 염증의 모델

Schistosoma mansoni 달걀은 T 도우미 유형 2 (Th2) 면역 반응, 기생충 감염의 특징, 천식과 알레르기 염증의 강력한 stimulators 있습니다. 이 프로토콜은 S.을 활용 CD4 Th2 시토킨 유도된 염증성 계란 주위에 폐 granuloma 형성을 특징으로 폐에 반응, eosinophilia와 대식 세포 대안 활성화를 생성하는 mansoni 계란 분사.

에서 계란을 사용하여<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; 등<em&gt; 생체내에서</em기생충 유도된 폐 염증의&gt; 모델

Heligmosomoides의 polygyrus 밀접 높은 널리 인간의 기생충 감염의 것과 유사 강력한 면역 조절 기능이있는 쥐의 선충이다. 여기에서는 H.의 장기적인 유지 관리 프로토콜을 기술 polygyrus 라이프 사이클.

재배<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus :</em&gt; 면역 선충 기생충과 은닉하는 제품

여기에서는 제브라피시 귀 소포에서 국소 박테리아 감염의 생성 및 이미징을 위한 프로토콜을 제시합니다.

의 Zebrafish의 애벌레 모델의 선천성 면역 반응의 비 침습적 영상<em&gt; 연쇄상 구균 iniae</em&gt; 감염

여기에서는 Plasmodium sporozoites의 피내 주사 후 마우스 피부에서 골수성 세포를 분리하고 림프절을 배출하는 프로토콜을 설명합니다. 수집된 세포의 유세포 분석은 기생충에 대한 피부 및 배액 림프절 염증 반응을 특성화하기 위한 신뢰할 수 있는 분석을 제공합니다.

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리<em&gt; 변형체</em&gt; 포자 소체

이 원고는 다양한 질병 단계에서 각각 유세포 분석 및 정량적 PCR을 사용하여 림프절, 비장, 혈액 및 척수의 면역 세포 분포 및 mRNA 사이토카인 수치를 평가하는 방법과 함께 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델의 유도 및 채점 방법을 설명합니다.

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

이 프로토콜에 붙일 레이블된 T. cruzi 투명 zebrafish 애벌레로 주입 했다 그리고 기생충 운동 성에서 관찰 되었다 vivo에서 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여.

조사 Trypanosoma cruzi 운동 비보 를 동물 모델로 서 애벌레 Zebrafish의 설립

이 원고는 마우스에서 활성 실험자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 중추신경계(CNS)에서 침투된 림프구의 분리 및 특성화 방법도 림프구가 CNS 자가면역 질환의 발병에 어떻게 관여하는지 보여주기 위해 제시된다.

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

microsporidian 기생충 Nematocida parisii에 의한 Caenorhabditis elegans의 감염은 웜이 동일한 병원균에 매우 저항력이있는 자손을 생산할 수있게합니다. 이것은 유전 된 면역의 예이며, 잘 이해되지 않는 후성 유전 적 현상입니다. 본 프로토콜은 유전적으로 견인성 웜 모델에서 유전된 면역의 연구를 기술한다.

Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection에서 유전 된 면역 연구

스트롱길로이드 라티(Strongyloides ratti )는 기생 선충으로 실험실 쥐에서 일시적인 감염을 일으켜 조직 이동 및 장 생활 단계를 나타냅니다. 여기에서는 쥐의 기생충 주기 유지와 머리, 폐 및 장의 기생충 정량화를 포함하여 쥐의 실험적 감염을 위한 프로토콜을 제시합니다.

기생 선충 Strongyloides ratti 에 의한 생쥐의 실험적 감염

배우세요 Nippostrongylus brasiliensis 감염 모델에서 IL-9 생성 T 세포와 ILC2 세포를 분리하고 유세포 분석으로 특성화하는 방법입니다. 이 기술은 면역 반응 연구에 필수적입니다.

Nippostrongylus brasiliensis 감염 모델에서 IL-9 생성 림프 세포 연구를 위한 전략

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