조혈 사이토카인을 사용한 종양 백신 접종을 이용한 실험적 흑색종 면역요법 모델

이 프로토콜은 종양 세포와 침윤 면역 세포 사이의 관계를 연구하기 위한 임상 고형 종양 면역요법 모델 및 연구 플랫폼을 제공합니다. 이 세포 기반 종양 백신은 편리하고 사용하기 쉬우며 체크포인트 차단과 같은 다른 치료 방식과 결합하여 더 강력하고 높은 종양 면역을 초래할 수 있는 추가 또는 시너지 효과를 달성할 수 있습니다. 절차를 시연하는 데 도움이되는 것은 내 실험실의 연구 기술자 인 Ann Balancio입니다.

시작하려면 10 % 열 비활성 FBS, 2 밀리몰 글루타민, 1 밀리몰 나트륨 피루 베이트, 1 밀리몰 MEM 비 필수 아미노산 및 페니실린과 스트렙토 마이신의 밀리리터 당 100 단위를 포함하는 IMDM에서 B16-F10 흑색 종 세포를 배양하십시오. 세포주를 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 유지하십시오. B16-F10 세포를 시드하고 텍스트 원고에 설명 된대로 수확합니다.

배양액을 제거하고 PBS로 플라스크를 1회 세척한다. PBS를 흡인하고 0.25% 트립신-EDTA 5밀리리터를 추가한 다음 배양 플라스크의 가장자리를 거칠게 두드립니다. 15 밀리리터의 배양 배지를 추가하여 트립신 -EDTA를 중화시키고 플라스크의 내용물을 50 밀리리터 원심 분리 튜브에 붓습니다.

10 밀리리터의 PBS로 접시 표면을 씻고 동일한 50 밀리리터 원심 분리기 튜브에 붓습니다. 세포를 200 RCF에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 튜브 바닥을 손가락으로 두드려 세포 펠릿을 깨뜨립니다.

차가운 PBS 10 밀리리터를 넣고 세포 현탁액을 부드럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 혈구계를 사용하여 세포를 수동으로 계산합니다. 주사하기 전에 세포를 얼음 위에 두십시오.

30 게이지 바늘을 사용하여 왼쪽 옆구리에 50 마이크로리터의 차가운 PBS에 500, 000 세포 B16-F10 종양 세포를 피내 이식한다. 이식 된 B16-F10 종양 세포의 투여 량은 성공적인 종양 발달을 위해 50, 000에서 500, 000 세포의 범위에서 조정되어야 할 수도 있습니다. 시행 후 전자 디지털 캘리퍼를 사용하여 일주일에 세 번 종양 길이와 너비를 측정합니다.

종양 부피를 계산하고 종양이 텍스트 원고에 설명 된대로 2 밀리미터의 크기에 도달하면 종양 백신으로 마우스를 치료하십시오. 160킬로볼트 및 25밀리암페어로 설정된 X선 조사기를 사용하여 150회분의 감마선으로 세포를 조사합니다. 주사 전에 트리판 블루 염색에 의해 세포 생존율을 계수하고 확인하였다.

원래 종양 이식과 동일한 측면에 50마이크로리터의 차가운 PBS에 100만 개의 조사된 B16-Flt3L 세포를 마우스에 피내 주사합니다. 초기 세포 이식 후 3, 6, 9 일에 원발 종양 부위에서 약 1 센티미터. 백신 주사 부위를 컬러 펜으로 표시하여 원발 종양과 구별하십시오.

50, 000 개의 B16-F10 세포를 처음 이식 한 경우 8, 11 및 14 일에 백신 치료를 수행하는 것이 좋습니다. 안락사된 각 마우스에서 피부와 함께 종양을 외과적으로 제거하고 10% FBS RPMI 1640 배지 1 밀리리터가 있는 24웰 플레이트에 넣었다. 2 밀리리터의 소화 완충액에서 종양을 작은 조각으로 자르고 섭씨 37도에서 25 분 동안 배양하십시오.

소화를 멈추기 위해 10% FBS RPMI 1640 배지 10ml를 추가합니다. 25 밀리리터 혈청 학적 피펫을 사용하여 세포를 40 마이크로 미터 세포 여과기로 옮깁니다. 그런 다음 1 밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 조직을 연마하십시오.

셀을 섭씨 4도에서 5분 동안 500RCF로 원심분리합니다. 1x 농도로 희석된 PBS의 40% 밀도 구배 특이적 배지 5ml에 펠릿을 재현탁합니다. PBS를 함유하는 80% 밀도 구배 특이적 배지 5밀리리터 위에 세포 현탁액을 천천히 첨가한다.

실온에서 23분 동안 낮은 브레이크 설정으로 325 RCF에서 셀을 원심분리합니다. 원심분리 후 40%와 80% 밀도 구배 특정 배지 사이의 계면에서 백혈구 층을 조심스럽게 수집하고 40마이크로미터 세포 스트레이너를 통과시킵니다. 셀을 섭씨 4도에서 5분 동안 500RCF로 원심분리합니다.

펠렛을 2 밀리리터의 적혈구 용해 완충액에 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 배양 후 10% FBS RPMI 1640 배지 10밀리리터를 추가하여 적혈구 용해 완충액을 퀀칭합니다. 셀을 섭씨 4도에서 5분 동안 400RCF로 원심분리합니다.

세포를 0.5 밀리리터의 10%FBS RPMI 1640 배지에 재현탁시키고, 추가 분석을 위해 사용하기 전에 총 세포 수를 계수한다. 비장 또는 배수 림프절을 유세포 분석에 의한 면역 세포 하위세트의 게이팅 전략을 위한 대조군으로서 수집한다. 텍스트 원고에 설명 된 세포 분리 방법을 따르십시오.

이식된 B16-F10 세포의 가시적인 검은 점은 일반적으로 종양 이식 후 약 3일 후에 피부 표면에서 관찰되었다. 마우스는 종양 결절이 2 밀리미터의 크기에 도달하거나 초과한 후 3, 6 및 9일 후에 종양 백신으로 처리되었다. 종양 이식 약 2주 후에 백신을 접종한 마우스 그룹에서 유의한 종양 성장 감소가 관찰되었다.

백혈구 층에서 채취한 세포에는 많은 종양 세포가 포함되어 있어 림프구 집단을 쉽게 정의하기 어려웠습니다. 따라서, 비장 세포는 유세포 분석 분석에서 종양 내 면역 세포 서브 세트의 적절한 게이팅을 위해 병행하여 사용되었다. CD103 양성, CD11C 양성 DC, CD8 양성, CD4 양성 및 Treg의 게이팅 전략을 보상 매트릭스와 함께 플롯했습니다.

획득 한 계정의 대표 데이터와 각 모집단의 빈도도 제공되었습니다. 종양내 CD103 양성, 백신접종된 마우스로부터의 CD11C 양성 DC는 공동자극 리간드 CD86의 유의하게 상승된 발현을 나타내었다. 백신 접종 마우스는 또한 CD8 양성 및 CD4 양성, Foxp3 음성 세포뿐만 아니라 CD8 양성 그랜자임 B 양성 및 인터페론 감마 양성 CTL에서 종양 침윤의 증가를 보였다.

원발성 종양과 종양 백신 사이에 충분한 거리를 유지하십시오. 이러한 물리적 분리는 두 종양 임플란트 간의 잠재적인 융합을 방지하는 데 중요합니다.