Name: 조혈 사이토카인을 사용한 종양 백신 접종을 이용한 실험적 흑색종 면역요법 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 배우세요 B16-F10 흑색종 세포를 이용한 조혈 사이토카인 종양 백신 접종 방법으로 면역요법 모델을 구축하는 기술입니다. 이 프로토콜은 종양-면역 상호작용 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

B16-Flt3L 세포를 제공한 Stephen Schoenberger 박사와 LJI 동물 및 유세포분석 시설의 직원들에게 탁월한 지원을 해주셔서 감사합니다.

연구에 사용 된 모든 마우스는 온도와 습도가 제어 된 특정 병원체가없는 조건에서 La Jolla Institute for Immunology (LJI)의 동물 사육장에 보관 및 보관되었습니다. 동물 실험은 LJI 동물 관리 위원회에서 승인한 지침 및 프로토콜에 따라 8-14주령 암컷 C57BL/6 마우스로 수행되었습니다.
1. 이식용 배양된 종양세포의 제조
<ol><li>10% 열 불활성화 FBS, 2mM 글루타민, 1mM 나트륨 피루브산, 1mM MEM 비필수 아미노산 및 각각 100U/mL의 페니실린과 스트렙토마이신을 포함하는 Iscove의 변형된 Dulbecco's 배지(IMDM)에서 B16-F10 흑색종 세포를 배양합니다. 세포주를 5%CO2 하에 37°C에서 유지한다.</li>
	<li>175T 플라스크에 1.5-2 x 106 B16-F10 세포를 시드하고 2일 동안 배양하였다. 세포가 75%-80% 합류할 때 수확합니다.</li>
	<li>배양액을 제거하고 플라스크를 PBS로 1회 세척한다. PBS를 흡입하고 0.25% 트립신-EDTA 5mL를 추가한 다음 배양 플라스크의 가장자리를 세게 두드립니다.</li>
	<li>트립신-EDTA를 중화하기 위해 배양액 15mL를 추가하고 플라스크의 내용물을 50mL 원심분리 튜브에 붓습니다. 10mL의 PBS로 접시 표면을 씻고 동일한 50mL 튜브에 붓습니다.</li>
	<li>세포를 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 튜브 바닥을 손가락으로 두드려 세포 펠릿을 깨뜨립니다.</li>
	<li>차가운 PBS 10mL를 넣고 세포 현탁액을 부드럽게 피펫합니다. 그런 다음 혈구계를 사용하여 수동으로 세포를 계산합니다. 주사하기 전에 세포를 얼음 위에 두십시오.</li>
</ol>2. 종양 이식
<ol><li>가스는 흄 후드에서 분당 1.0L의 가스 유량으로 5% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 유속을 마우스가 완전히 마취되면 2% 이소플루란의 유지 용량으로 변경합니다. 이 프로토콜의 경우 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 수의사가 마취를 수행했습니다.</li>
	<li>생쥐의 왼쪽 옆구리에있는 머리카락을 면도하고 알코올 물티슈를 사용하여 주사 부위를 소독하십시오. 30 G 바늘을 사용하여 왼쪽 옆구리에 5 μL의 차가운 PBS에 B16-F10 종양 세포를 5 x 105 세포에 피내(i.d.) 이식한다. 참고: 이식된 B16-F10 종양 세포의 용량은 성공적인 종양 발달을 위해 0.5-5 x 105 세포 범위에서 조정해야 할 수 있습니다.</li>
	<li>이식 후 전자 디지털 캘리퍼를 사용하여 일주일에 세 번 종양 길이와 너비를 측정합니다. 공식을 사용하여 종양 부피 (mm3)를 계산하십시오. 종양 부피 (mm3) = 폭2 × 길이 × 0.5 종양이 ≥2mm의 크기에 도달하면 종양 백신으로 마우스를 치료하십시오. 참고: 종양은 일반적으로 5 x 105 종양 세포를 이식한 후 3일째에 측정할 수 있습니다. 더 빠른 B16-F10 종양 성장 속도는 수컷 C57BL/6, Rag1-/- 또는 Rag2-/-γc-/-마우스에서 관찰되었습니다. 유사한 관찰이 다른 연구8에서 설명되었다. 마우스의 성별을 일관되게 유지하는 것이 좋습니다. 그러나 NIH는 생물 의학 연구에서 중요한 생물학적 변수로성에 중점을 둡니다.</li>
</ol>3. Flt3L 발현 B16-F10(B16-Flt3L) 세포의 백신 제조 및 주사
<ol><li>B16-Flt3L 세포를 5%CO2 하에 37°C에서 8% 열 불활성화된 FBS, 2mM 글루타민, 및 각각 100U/mL의 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 중에 유지한다.</li>
	<li>1 x 106 B16-Flt3L 세포를 175T 플라스크에 시드하고 2일 동안 배양하였다. 1.3-1.6단계에 설명된 대로 75%-80% 합류할 때 세포를 수확하고 1mL의 차가운 PBS에 현탁합니다.</li>
	<li>160kV 및 25mA 파라미터 설정의 X선 조사기를 사용하여 150Gy 용량의 감마선으로 세포를 조사합니다. 주사 전에 트리판 블루 염색에 의해 세포 생존율을 계수하고 확인하였다.</li>
	<li>가스는 앞에서 설명한대로 마우스를 마취시키고 알코올 물티슈를 사용하여 주사 부위를 멸균합니다. 마우스에 1 x 10 6 조사된 B16-Flt3L 세포를 50μL의 차가운 PBS에 원래 종양 이식과 동일한 측면에 피내 주사하고, 초기 세포 이식 후 3,6 , 9일에 원발성 종양 부위에서 ~1cm 떨어져 있습니다.</li>
	<li>원발성 종양과 구별하기 위해 백신 주사 부위를 컬러 펜으로 표시하십시오. 참고: 0.5 x 105 B16-F10 세포를 처음 이식하는 경우 8, 11, 14일에 백신 치료를 수행하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>4. 종양 내 면역 세포 분리
<ol><li>희생 마우스를CO2 를 사용하여 실험 종료시에 흄 후드에서 자궁 경부 탈구를 (종양 이식 후 15일째; 그림 1).</li>
	<li>각 마우스에서 피부로 종양을 외과적으로 제거하고 1mL 10% FBS/RPMI-1640 배지가 있는 24웰 플레이트에 넣습니다. 무게를 측정하기 전에 종이 타월로 종양을 말리십시오.</li>
	<li>종양을 작은 조각으로 자릅니다. 2mL의 분해 완충액(RPMI-1640 배지에서 100μg/mL TL 리베라제 및 200μg/mL DNase I)을 추가하고 37°C에서 25분 동안 배양합니다.</li>
	<li>소화를 멈추기 위해 10% FBS/RPMI-1640 배지 10mL를 추가합니다. 25mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세포를 옮기고 1mL 주사기의 플런저를 사용하여 40μm 세포 여과기의 조직을 분쇄합니다.</li>
	<li>세포를 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 PBS 중 40% 밀도 구배 특이적 배지 5mL에 재현탁하고 1x 농도로 희석합니다.</li>
	<li>PBS를 함유하는 80% 농도 구배 특이적 배지 5mL 위에 세포 현탁액을 천천히 첨가한다. 실온(RT)에서 23분 동안 낮은 브레이크 설정으로 325 x g 에서 셀을 원심분리합니다.</li>
	<li>원심분리 후, 40 %와 80 % 밀도 구배 특이 적 배지 사이의 계면에서 백혈구 층을 조심스럽게 수집하고 40 μm 세포 스트레이너를 통과시킵니다. 세포를 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>펠릿을 2mL의 적혈구(RBC) 용해 완충액에 RT에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후 10% FBS/RPMI-1640 배지 10mL를 추가하여 RBC 용해 완충액을 퀀칭합니다.</li>
	<li>세포를 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포를 0.5mL의 10% FBS/RPMI-1640 배지에 재현탁하고 추가 분석을 위해 사용하기 전에 총 세포 수를 계산합니다. 참고: 유세포분석 분석에 의한 면역 세포 하위세트의 게이팅 전략을 위한 대조군으로서 비장 또는 dLN을 수집한다. 위에서 설명한 대로 세포 분리 방법을 따르고 다음과 같이 변경합니다. 1mL 주사기의 플런저를 사용하여 70μm 메쉬 필터에서 조직을 분쇄합니다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 10% FBS/RPMI-1640 배지로 조직을 세척합니다. 설명된 대로 RBC를 용해합니다.</li>
</ol>5. 유세포 분석
참고: 백혈구 층에서 채취한 세포에는 면역 세포와 종양 세포가 포함되어 있습니다. 두 개의 독립적 인 염색 패널을 권장합니다.
<ol><li>표면 염색<ol><li>세포를 96웰 V자형 바닥판으로 옮깁니다. 세포를 PBS로 세척하고 RT에서 15분 동안 세포 생존율 염료(50-100μL/웰)로 염색합니다.</li>
		<li>세포를 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 표면 마커를 FACS 완충액(PBS에서 1% FBS 및 0.05%NaN3 PBS)에서 혼합된 항체(재료 표에 제공됨)로 얼음(50-100μL/웰)에서 30분 동안 염색합니다.</li>
		<li>세포를 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 FACS 완충액으로 두 번 세척합니다.</li>
		<li>세포를 세포 고정 완충액(50-100μL/웰)으로 얼음 위에서 35분 동안 고정합니다. 세포를 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 FACS 완충액으로 두 번 세척합니다.</li>
		<li>샘플을 4 ° C에서 FACS 버퍼 (150-200 μL / 튜브)에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오. 유세포분석기에서 샘플을 수집합니다. DC 및 T 세포 집단의 경우 그림 2B 및 그림 3A에 제공된 게이팅 전략을 따릅니다. 참고: 골수성 DC의 염색을 위해, 표면 항체 배양(단계 5.1.2) 전에 얼음 위에서 15분 동안 FC-차단제(쥐 항-마우스 CD16/CD32)를 배양하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>생체 외 재자극 시 사이토카인 분석<ol><li>세포를 완전 배지(10% FBS, 10mM hepes, pH 7.2-7.6, 0.1mM 비필수 아미노산, 1mM 나트륨 피루베이트, 각각 100U/mL 페니실린 및 스트렙토마이신, 50μM 2-메르캅토에탄올 및 2mM L-글루타민으로 보충된 RPMI-1640)에 플레이팅하고 5%CO2 하에 37°C에서 4시간 동안 단백질 수송 억제제가 있는 상태에서 50ng/mL의 PMA와 1μM 이오노마이신으로 자극합니다.</li>
		<li>단계 5.1에서 위에서 설명한 대로 표면 마커에 대한 표면 염색을 수행합니다.</li>
		<li>투과화 용액(50-100 μL/웰)을 추가하고 세포 내 염색을 위해 RT에서 5분 동안 배양합니다. 사이토카인 또는 핵 단백질에 특이적인 항체와 함께 세포를 투과화 용액(50-100μL/웰)에서 얼음 위에서 60분 동안 또는 4°C에서 밤새 배양합니다.</li>
		<li>세포를 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 FACS 완충액으로 두 번 세척합니다. 샘플을 4 ° C에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오. 유세포분석기에서 샘플을 수집합니다. 참고: 항체 희석은 최적의 염색을 위해 필요에 따라 조정해야 할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Zhang, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+advances+in+cancer+immunotherapy%3A+understanding+the+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+and+their+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications.</a> Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li>
<li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+cytotoxic+lymphocytes+kill+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells.</a> Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).</li>
<li>Maraskovsky, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+increase+in+the+numbers+of+functionally+mature+dendritic+cells+in+Flt3+ligand-treated+mice%3A+multiple+dendritic+cell+subpopulations+identified%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified.</a> Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).</li>
<li>Talmadge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral%2C+injection+of+adenoviral+Flt3+ligand+has+therapeutic+activity+in+association+with+increased+intratumoral+levels+of+T+cells+but+not+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells.</a> Blood. 104 (11), 5280(2004).</li>
<li>Curran, M. A., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vaccines+expressing+flt3+ligand+synergize+with+ctla-4+blockade+to+reject+preimplanted+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors.</a> American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).</li>
<li>Simon, S. R., Ershler, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+influences+on+growth+of+B16+murine+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).</li>
<li>Broz, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+tumor+myeloid+compartment+reveals+rare+activating+antigen-presenting+cells+critical+for+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity.</a> Cancer Cell. 26 (6), 938(2014).</li>
<li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+activation+of+CD103%28%2B%29+dendritic+cell+progenitors+at+the+tumor+site+enhances+tumor+responses+to+therapeutic+PD-L1+and+BRAF+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition.</a> Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).</li>
<li>Liu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+the+Treg-intrinsic+CTLA4-PKCeta+signaling+pathway+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+Cancer%22%5BJournal%5D)">Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792(2021).</li>
<li>Kong, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-eta+controls+CTLA-4-mediated+regulatory+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function.</a> Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 Allison 그룹의 연구를 기반으로 합니다. 그들은 B16-Flt3L 백신과 CTLA-4 차단의 조합이 생존율과 종양 성장에 시너지 효과를 보인 반면, B16-Flt3L 백신 또는 항 CTLA-4 항체 단독 치료를받은 마우스에서는 종양 성장의 감소가 보이지 않았 음을 입증했다7. 최근 연구에 따르면 Treg11의 접촉 의존적 억제 활성을 조절하는 데 중요한 필수 역할을하는 새로운 Treg- 내인성 CTLA4-PKCη 신호 전달 경로가 밝혀졌습니다. B16-Flt3L 백신 단독 처리 또는 Treg 특이적 PKCη 결실이 있는 백신 조합 모두 Allison의 연구에서(1 x 104) 세포보다 더 많은 수(0.5-5 x 105)의 B16-F10 흑색종 세포를 이식했을 때 종양의 성장을 유의하게 감소시켰습니다. 흑색 종 세포 또는 생쥐의 출처의 미묘한 차이가이 차이를 설명 할 수 있습니...

암 면역 요법은 독성이 적은 부작용과 더 지속적인 반응을 기반으로 유망한 치료 전략으로 인식되어 왔습니다. 종양 용해 바이러스 요법, 암 백신, 사이토 카인 요법, 단일 클론 항체, 입양 세포 전달 (CAR-T 세포 또는 CAR-NK) 및 면역 체크 포인트 차단1을 포함하는 여러 유형의 면역 요법이 개발되었습니다.
암 백신의 경우 전체 세포 기반 백신, 단백질 또는 펩타이드 백신, RNA 또는 DNA 백신과 같은 다양한 형태의 치료 백신이 있습니다. 백신 접종은 종양 특이 항원을 포함한 종양 항원을 처리하고 T 세포에 면역 원성 형태로 제시하는 항원 제시 세포 (APC)의 능력에 의존합니다. 수지상 세포(DC)는 가장 강력한 APC로 알려져 있으며 항종양 면역에 중요한 역할을 하는 것으로 믿어집니다 2,3. 이 세포는 종양 항원을 흡수하고 처리 한 다음 배수 림프절 (dLN)으로 이동하여 T 세포 수용체 (TCR) 및 공동 자극 분자의 결합을 통해 종양 특이 적 T 이펙터 (Teff) 세포를 프라이밍하고 활성화합니다. 그 결과 종양 특이적 세포독성 T 세포(CTL)의 분화 및 확장이 일어나 종양에 침투하여종양 세포를 사멸시킵니다4. 결과적으로, DC의 활성화 및 성숙은 종양 항원에 대한 면역을 자극하는 매력적인 전략을 나타낸다.
Flt3L은 MHC 클래스 II, CD11c, DEC205 및 CD86 단백질5를 발현하는 기능적으로 성숙한 DC의 성숙 및 확장을 촉진하는 것으로 알려져 있다. Flt3L 유전자(Adv-Flt3L)를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 정맥내 투여는 오르토픽 종양에 대한 면역 치료 활성을 촉진하는 것으로나타났습니다6. Flt3L은 또한 DC에 의한 종양 항원의 교차 제시를 향상시켜 항종양 반응을 증가시키는 방법으로 후방바이러스 형질도입된 Flt3L을 안정적으로 발현하는 방사선 조사된 B16-F10 세포로 구성된 종양 세포 기반 백신에 사용되었습니다. 여기에 설명된 B16-Flt3L 종양 백신 접종 프로토콜은 James Allison 박사의 그룹7에서 발표한 연구를 기반으로 합니다. 이 논문에서 그들은 CTLA-3 차단과 결합 된 B4-Flt4L 백신이 상승적으로 확립 된 흑색 종의 거부를 유도하여 생존율을 증가 시킨다고보고했습니다.
이 프로토콜의 목표는 흑색종에 대한 전임상 면역요법 모델을 제공하는 것입니다. 여기에서는 종양 백신을 제조하고 이식하는 방법과 고형 종양으로부터 종양 내 면역 세포의 구성과 기능을 분석하는 방법에 대한 자세한 절차를 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>0.25% 트립신-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>10% 열 비활성화 FBS</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02&nbsp;</td><td>로트# 209018</td></tr><tr><td>30G 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 V-모양-바닥 플레이트</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3926.500</td><td></td></tr><tr><td>B16 세포주 Fms-like 티로신 키나아제 3 리간드 (B16-Flt3L)를 발현하는 세포주</td> <td>Dr. Stephen Schoenberger, LJI&nbsp;</td><td></td><td>Flt3L cDNA는 참조 5, 보충 그림 1</td></tr><tr><td>B16-F10 세포주</td><td>ATCC</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytofix 고정 완충액&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>BDB554655</td><td>세포 고정 완충액 (4.2% PFA)&nbsp;</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm 키트&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>고정/투과화 솔루션 키트</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 Modified Eagle Medium&nbsp; (DMEM)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>전자 디지털 캘리퍼</td><td>Fisherbrand</td><td>14-648-17</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 소프트웨어&nbsp;</td><td>Tree Star</td><td></td><td>유세포 분석기 데이터 분석</td></tr><tr><td>GolgiStop (단백질 수송 억제제)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td>1:1500 희석</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s 수정된 Dulbecco' Thermo</td> <td>Fisher</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>LSR-II 사이토미터&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>플로우 사이토미터</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 및 스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>GE17-0891-02</td><td>밀도 구배 특정 매체</td></tr><tr><td>PMA</td><td></td><td>Sigma P1585</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액 Hybri-Max 액체</td><td>Sigma</td><td>R7757-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>RS2000 X선 조사기</td><td>Rad Source Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피루브산</td> <td>나트륨Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>멸균 셀 스트레이너 40 &mu; m</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>멸균 세포 여과기 70 &mu; m</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>TL Liberase</td><td>Roche</td><td>477530</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua fixable viability kit</td><td>BioLegend</td><td>423101</td><td></td></tr><tr><td>항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCD45</td><td>BioLegend</td><td>103135</td><td>클론: 30-F11 형광단: BV570 희석: 1:200</td></tr><tr><td>Anti-mCD3&epsilon;</td><td>BioLegend</td><td>100327</td><td>클론: 145-2C11 형광단: PerCP-Cy5.5 희석: 1:200</td></tr><tr><td>Anti-mCD8</td><td>BioLegend</td><td>100730 100724</td><td>클론: 53-6.7 형광단: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 희석: 1:200</td></tr><tr><td>Anti-mCD4</td><td>BioLegend</td><td>100414</td><td>클론: GK1.5 형광단: APC-Cy7 희석: 1:200</td></tr><tr><td>Anti-mFoxp3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11577382</td><td>클론: FJK-16s 형광단: FITC 희석: 1:100</td></tr><tr><td>Anti-m/hGzmB</td><td>BioLegend</td><td>372208</td><td>클론: QA16A02 형광단: PE 희석: 1:100</td></tr><tr><td>Anti-mIFNg</td><td>BioLegend</td><td>505826</td><td>클론: XMG1.2 형광단: PE-Cy7 희석: 1:100</td></tr><tr><td>Anti-mCD19</td><td>BioLegend</td><td>115543</td><td>클론: 6D5 형광단: BV785 희석: 1:100</td></tr><tr><td>Anti-mGr1</td><td>BioLegend</td><td>108423</td><td>클론: RB6-8C5 형광단: APC/Cy7 희석: 1:200</td></tr><tr><td>Anti-mCD11b</td><td>BioLegend</td><td>101223</td><td>클론: M1/70 형광단: Pacific blue 희석: 1:100</td></tr><tr><td>Anti-mF4/80</td><td>BioLegend</td><td>123114</td><td>클론: BM8 형광단: PECy7 희석: 1:100</td></tr><tr><td>Anti-mCD11c</td><td>BioLegend</td><td>117328</td><td>클론: N418 형광단: PerCP Cy5.5 희석: 1:100</td></tr><tr><td>Anti-mMHCII</td><td>BioLegend</td><td>107622</td><td>클론: M5/114.15.2 형광단: AF700 희석: 1:400</td></tr><tr><td>Anti-mCD103</td><td>BioLegend</td><td>121410</td><td>클론: 2E7 형광단: Alexa Fluor 647 희석: 1:200</td></tr><tr><td>Anti-mCD86</td><td>BioLegend</td><td>105007</td><td>클론: GL-1 형광단: PE 희석: 1:200</td></tr><tr><td>FC 차단제(Rat 안티 마우스 CD16/CD32)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>클론: 2.4G2 희석: 1:200</td></tr></tbody></table>

조혈 사이토카인을 사용한 종양 백신 접종을 이용한 실험적 흑색종 면역요법 모델

Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine

Fms 유사 티로신 키나제 3 리간드 (Flt3L)는 수지상 세포 (DCs)의 생존 및 분화를 촉진하는 조혈 사이토 카인이다. 선천성 면역을 활성화하고 항 종양 반응을 향상시키기 위해 종양 백신에 사용되었습니다. 이 프로토콜은 종양 미세 환경 (TME)에서 면역 세포의 표현형 및 기능 분석과 함께 Flt3L 발현 B16-F10 흑색 종 세포로 구성된 세포 기반 종양 백신을 사용하는 치료 모델을 보여줍니다. 배양된 종양 세포 준비, 종양 이식, 세포 조사, 종양 크기 측정, 종양내 면역 세포 단리, 및 유세포분석을 위한 절차가 기재되어 있다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 전임상 고형 종양 면역 요법 모델과 종양 세포와 침윤 면역 세포 간의 관계를 연구하기위한 연구 플랫폼을 제공하는 것입니다. 여기에 기술된 면역요법 프로토콜은 흑색종의 암 치료 효과를 개선하기 위해 면역 체크포인트 차단 (항-CTLA-4, 항-PD-1, 항-PD-L1 항체) 또는 화학요법과 같은 다른 치료 양식과 조합될 수 있다.

이식된 B16-F10 세포의 눈에 보이는 검은 점은 일반적으로 종양 이식 후 ~3일 후에 피부 표면에서 관찰됩니다. 마우스는 종양 결절이 ≥2 mm의 크기에 도달한 후 3, 6, 및 9일 후에 종양 백신으로 치료된다. 우리는 종양 이식 후 ~ 2 주 후에 백신 접종 된 마우스 그룹에서 종양 성장의 현저한 감소를 관찰했습니다 (그림 1). 실험이 끝나면 종양 내 면역 세포를 분리하고 상기와 같이 짧은 시험관 내 자극 후 사이토 카인 생산뿐만 아니라 그 수 및 세포 표면 마커 발현을 분석했습니다. 백혈구 층으로부터 수집된 세포는 여전히 많은 종양 세포를 함유하고, 림프구 집단을 용이하게 정의하는 것을 다소 어렵게 만든다. 따라서 유세포 분석 분석에서 종양 내 면역 세포 하위 세트의 적절한 게이팅을 위해 병렬 비장 세포에서 사용하는 것이 좋습니다 (그림 2A). 여기에서는 보상 매트릭스(표 1 및 ...

이 프로토콜은 Flt3L 발현 B16-F10 흑색종으로 세포 기반 종양 백신 접종을 사용하는 암 면역 요법 모델을 제시합니다. 이 프로토콜은 배양된 종양 세포의 준비, 종양 이식, 세포 조사, 종양 성장 측정, 종양내 면역 세포의 분리 및 유세포 분석을 포함한 절차를 보여줍니다.

Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) is a hematopoietic cytokine that promotes the survival and differentiation of dendritic cells (DCs). It has been ...

이 프로토콜은 종양 세포와 침윤 면역 세포 사이의 관계를 연구하기 위한 임상 고형 종양 면역요법 모델 및 연구 플랫폼을 제공합니다. 이 세포 기반 종양 백신은 편리하고 사용하기 쉬우며 체크포인트 차단과 같은 다른 치료 방식과 결합하여 더 강력하고 높은 종양 면역을 초래할 수 있는 추가 또는 시너지 효과를 달성할 수 있습니다. 절차를 시연하는 데 도움이되는 것은 내 실험실의 연구 기술자 인 Ann Balancio입니다.시작하려면 10 % 열 비활성 FBS, 2 밀리몰 글루타민, 1 밀리몰 나트륨 피루 베이트, 1 밀리몰 MEM 비 필수 아미노산 및 페니실린과 스트렙토 마이신의 밀리리터 당 100 단위를 포함하는 IMDM에서 B16-F10 흑색 종 세포를 배양하십시오. 세포주를 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 유지하십시오. B16-F10 세포를 시드하고 텍스트 원고에 설명 된대로 수확합니다.배양액을 제거하고 PBS로 플라스크를 1회 세척한다. PBS를 흡인하고 0.25% 트립신-EDTA 5밀리리터를 추가한 다음 배양 플라스크의 가장자리를 거칠게 두드립니다. 15 밀리리터의 배양 배지를 추가하여 트립신 -EDTA를 중화시키고 플라스크의 내용물을 50 밀리리터 원심 분리 튜브에 붓습니다.10 밀리리터의 PBS로 접시 표면을 씻고 동일한 50 밀리리터 원심 분리기 튜브에 붓습니다. 세포를 200 RCF에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 튜브 바닥을 손가락으로 두드려 세포 펠릿을 깨뜨립니다.차가운 PBS 10 밀리리터를 넣고 세포 현탁액을 부드럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 혈구계를 사용하여 세포를 수동으로 계산합니다. 주사하기 전에 세포를 얼음 위에 두십시오.30 게이지 바늘을 사용하여 왼쪽 옆구리에 50 마이크로리터의 차가운 PBS에 500, 000 세포 B16-F10 종양 세포를 피내 이식한다. 이식 된 B16-F10 종양 세포의 투여 량은 성공적인 종양 발달을 위해 50, 000에서 500, 000 세포의 범위에서 조정되어야 할 수도 있습니다. 시행 후 전자 디지털 캘리퍼를 사용하여 일주일에 세 번 종양 길이와 너비를 측정합니다.종양 부피를 계산하고 종양이 텍스트 원고에 설명 된대로 2 밀리미터의 크기에 도달하면 종양 백신으로 마우스를 치료하십시오. 160킬로볼트 및 25밀리암페어로 설정된 X선 조사기를 사용하여 150회분의 감마선으로 세포를 조사합니다. 주사 전에 트리판 블루 염색에 의해 세포 생존율을 계수하고 확인하였다.원래 종양 이식과 동일한 측면에 50마이크로리터의 차가운 PBS에 100만 개의 조사된 B16-Flt3L 세포를 마우스에 피내 주사합니다. 초기 세포 이식 후 3, 6, 9 일에 원발 종양 부위에서 약 1 센티미터. 백신 주사 부위를 컬러 펜으로 표시하여 원발 종양과 구별하십시오.50, 000 개의 B16-F10 세포를 처음 이식 한 경우 8, 11 및 14 일에 백신 치료를 수행하는 것이 좋습니다. 안락사된 각 마우스에서 피부와 함께 종양을 외과적으로 제거하고 10% FBS RPMI 1640 배지 1 밀리리터가 있는 24웰 플레이트에 넣었다. 2 밀리리터의 소화 완충액에서 종양을 작은 조각으로 자르고 섭씨 37도에서 25 분 동안 배양하십시오.소화를 멈추기 위해 10% FBS RPMI 1640 배지 10ml를 추가합니다. 25 밀리리터 혈청 학적 피펫을 사용하여 세포를 40 마이크로 미터 세포 여과기로 옮깁니다. 그런 다음 1 밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 조직을 연마하십시오.셀을 섭씨 4도에서 5분 동안 500RCF로 원심분리합니다. 1x 농도로 희석된 PBS의 40% 밀도 구배 특이적 배지 5ml에 펠릿을 재현탁합니다. PBS를 함유하는 80% 밀도 구배 특이적 배지 5밀리리터 위에 세포 현탁액을 천천히 첨가한다.실온에서 23분 동안 낮은 브레이크 설정으로 325 RCF에서 셀을 원심분리합니다. 원심분리 후 40%와 80% 밀도 구배 특정 배지 사이의 계면에서 백혈구 층을 조심스럽게 수집하고 40마이크로미터 세포 스트레이너를 통과시킵니다. 셀을 섭씨 4도에서 5분 동안 500RCF로 원심분리합니다.펠렛을 2 밀리리터의 적혈구 용해 완충액에 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 배양 후 10% FBS RPMI 1640 배지 10밀리리터를 추가하여 적혈구 용해 완충액을 퀀칭합니다. 셀을 섭씨 4도에서 5분 동안 400RCF로 원심분리합니다.세포를 0.5 밀리리터의 10%FBS RPMI 1640 배지에 재현탁시키고, 추가 분석을 위해 사용하기 전에 총 세포 수를 계수한다. 비장 또는 배수 림프절을 유세포 분석에 의한 면역 세포 하위세트의 게이팅 전략을 위한 대조군으로서 수집한다. 텍스트 원고에 설명 된 세포 분리 방법을 따르십시오.이식된 B16-F10 세포의 가시적인 검은 점은 일반적으로 종양 이식 후 약 3일 후에 피부 표면에서 관찰되었다. 마우스는 종양 결절이 2 밀리미터의 크기에 도달하거나 초과한 후 3, 6 및 9일 후에 종양 백신으로 처리되었다. 종양 이식 약 2주 후에 백신을 접종한 마우스 그룹에서 유의한 종양 성장 감소가 관찰되었다.백혈구 층에서 채취한 세포에는 많은 종양 세포가 포함되어 있어 림프구 집단을 쉽게 정의하기 어려웠습니다. 따라서, 비장 세포는 유세포 분석 분석에서 종양 내 면역 세포 서브 세트의 적절한 게이팅을 위해 병행하여 사용되었다. CD103 양성, CD11C 양성 DC, CD8 양성, CD4 양성 및 Treg의 게이팅 전략을 보상 매트릭스와 함께 플롯했습니다.획득 한 계정의 대표 데이터와 각 모집단의 빈도도 제공되었습니다. 종양내 CD103 양성, 백신접종된 마우스로부터의 CD11C 양성 DC는 공동자극 리간드 CD86의 유의하게 상승된 발현을 나타내었다. 백신 접종 마우스는 또한 CD8 양성 및 CD4 양성, Foxp3 음성 세포뿐만 아니라 CD8 양성 그랜자임 B 양성 및 인터페론 감마 양성 CTL에서 종양 침윤의 증가를 보였다.원발성 종양과 종양 백신 사이에 충분한 거리를 유지하십시오. 이러한 물리적 분리는 두 종양 임플란트 간의 잠재적인 융합을 방지하는 데 중요합니다.

experimental-melanoma-immunotherapy-model-using-tumor-vaccination

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

조혈 사이토카인을 이용한 종양 백신 접종을 이용한 실험적 흑색종 면역요법 모델

이 비디오에서는 인간 유래 흑색종 세포를 면역이 저하된 마우스의 옆구리에 피하로 이식합니다. PDX 모델을 사용하면 생체 내  조건에서 관찰된 종양 이질성과 흑색종 공격성을 더 잘 요약할 수 있는 흑색종 세포의 전임상 조사를 수행할 수 있습니다.

환자 유래 이종이식 모델링: 흑색종 마우스 모델을 생성하는 기술

이 비디오는 세포 기반 종양 백신 접종 분석을 보여줍니다. 종양 형성을 위해 B16-F10 흑색종 세포를 피내 주입한 마우스는 발병한 종양 근처에서 Flt3L 사이토카인을 분비하는 B16-F10 세포를 접종합니다. 백신에서 분비된 Flt3L은 수지상 세포의 성숙 및 증식을 촉진한 후 림프절의 T 세포에 종양 항원을 제시하여 표적 항종양 면역 반응을 유발합니다.

Tumor Implantation and Injection of a Tumor Vaccine in a Mouse 모델에서의 종양 백신

합성 면역 능력 호스트에서 평가, 암 줄기 세포 (CSC) 기반 수지상 세포 (DC) 백신은 이질 적인 대량 종양 세포와 펄스 전통적인 DC 백신 보다 상당히 높은 항 종양 면역을 입증.

흑색종과 편평상피암 줄기세포를 이용한 새로운 수지상 세포 백신의 생성

예방 및 치료 백신은 종종 노드와 면역 세포의 결과로 가난한 참여 림프로 인해 백신의 주 배수에 강한 면역 반응을 자극하는 데 실패합니다. 림프절 백신의 직접 주사에 의해, 소위 intralymphatic 주입은 백신 효능 강하게 개선 될 수 있으며, 백신의 투여 량을 저감 할 수있다.

마우스의 Intralymphatic 면역 및 예방 접종

이 프로토콜의 목표는 흑색종 종양 침투 림프구를 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는 프로토콜을 보여주는 것입니다.

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜 설명 합니다 자세한 워크플로 생성에 대 한 immunomodulators, 예를 들어 bispecific T 세포 engagers를 인코딩 하는 홍 역 바이러스를 사용 하 여 표현 위한 oncolytic 바이러스의 비보 특성화 전. 응용 프로그램 및 다른 벡터 플랫폼 및 transgenes 적응 임상 번역 소설 immunovirotherapeutics의 개발을 가속화할 것 이다.

종양 대상 Immunomodulation에 대 한 paramyxoviruses: 설계 및 평가 전 비보

체 외 광 화학요법 (ECP)의 핵심 기능을 복제 하기 위해 실험 설정에서 생리 활성, 가변 수지상 생산을 가능 하 게 하는 (TI) 장치 또는 플레이트 및 관련 프로토콜이 개발 되었습니다. 암 면역 요법을 위한 세포 (DCs).

생리 적 면역 원 성 수지상 세포 생성을 위한 새로운 프로토콜

환자 유래 이종이식(PDX) 모델은 흑색종 분자 및 생물학적 특징을 보다 강력하게 회귀하고 기존의 플라스틱 조직 배양 계 세포 에 비해 치료 반응의 더 예측이다. 여기서는 새로운 PDX 모델 의 확립과 기존 PDX 모델의 특성화/실험에 대한 표준 운영 프로토콜에 대해 설명합니다.

흑색종 환자 유래 이종이식 모델

여기에서, 마우스 종양 모델에서 종양 내재 및 주변부 유래 종양 침윤된 림프구의 특성화를 위한 종양 이식 프로토콜을 제시한다. 유세포 분석기를 사용한 수용자 유래 면역 세포의 유입에 대한 특이적 추적은 항종양 면역 반응 동안 이들 세포의 표현형 및 기능적 변화의 역학을 드러낸다.

마우스에서 종양 침윤성 CD8+ T 세포의 역학을 평가하기 위한 종양 이식

여기에서는 신선한 흑색종 조직에서 분리된 세포 현탁액을 배양하여 흑색종 환자 유래 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 오가노이드는 in vitro 에서 환자 특이적 종양을 충실하게 재현하여 종양 면역억제 메커니즘, 약물 스크리닝, 약물 내성 메커니즘 및 암 감시 접근법을 탐구하기 위한 혁신적인 접근 방식을 제공합니다.

흑색종 환자 유래 오가노이드 모델을 통한 치료 기회 발굴

종양 내 면역치료에 대한 관심이 높아짐에 따라, 접근 가능하고 실용적인 종양 모델을 선택하는 것이 필수적입니다. 피하 종양은 쉽게 진단할 수 있지만, 시각화하고 조작하는 것은 어렵습니다. 이 프로토콜에서는 가시성과 접근성을 높이는 피내종양을 생성하는 방법을 설명합니다.

생쥐암 종양 내 면역치료 연구의 강력한 모델로서의 피내종양 이식

배우세요 B16-F10 흑색종 세포를 이용한 조혈 사이토카인 종양 백신 접종 방법으로 면역요법 모델을 구축하는 기술입니다. 이 프로토콜은 종양-면역 상호작용 연구에 활용됩니다.

조혈 사이토카인을 사용한 종양 백신 접종을 이용한 실험적 흑색종 면역요법 모델

더 많은 동영상 탐색