Name: 양자점 매개 면역 표지를 사용한 후 투과 전자 현미경을 사용하여 심장에서 단백질의 세포내 국소화를 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 배우세요 양자점 매개 면역 표지법을 사용하여 심장 조직에서 단백질의 세포내 국소화를 시각화하는 방법을. 이 기술은 초고해상도 이미징을 통해 단백질 기능과 관련 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.

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이 작업은 국립 보건원 보조금의 지원을 받았습니다: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1 및 R01HL152723; LSUHSC-S CCDS 결승선 상, COVID-19 연구 상 및 LARC 연구 상을 MSB에 수여합니다. LSUHSC-S 말콤 페스트 심혈관 및 AHA CSA에 대한 박사후 연구원 (20POST35210789); 및 LSUHSC-S 말콤 페스트 박사 전 연구원 RA에.

이 프로토콜의 동물 취급 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드 (제 8 판, 국립 보건원, 베데스다, MD)를 준수했으며 루이지애나 주립 대학 건강 과학 센터 - 슈 리브 포트의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. FVB/N 배경을 가진 6개월 된 수컷 마우스를 본 연구에 사용하였다. 마우스는 상업적 출처로부터 수득하였다( 재료 표 참조). 사용 된 마우스는 잘 조절 된 환경에서 12 시간의 밝은 어두운주기를 허용하는 케이지에 보관되었으며 물과 규칙적인 차우 다이어트 애드 리비 툼이 제공되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 NIH 가이드에 따라 관리되었습니다. 전체 프로세스는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 동물 준비
<ol><li>마우스를 3% 이소플루란을 사용하여 마취시킨다. 중간 복부 위의 부위를 수평 절개하고 피부를 당겨 가슴을여십시오. 조심스럽게, 다른 장기를 뚫지 않고 흉강을 열기 위해 다른 절개를하십시오21,22,23.<ol><li>24 먼저 정점을 통해 심장을 관류 한 다음 심근 마비 용액 (50mM KCl, PBS의 5 % 덱 스트로스, 보충 파일 1 참조)에서 차가운 3 % 글루 타르 알데히드를 사용하여 우심실을 2 분 동안 관류하여 완전한 심근 이완을 보장합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>0.1M의 나트륨 카코딜레이트 완충액(pH 7.4, 단계 2.1.1)에 얼음처럼 차가운 3% 글루타르알데히드를 사용하여 심장을 2분 더 관류합니다. 중력 압력을 사용하여 25G 5/8" 바늘을 사용하여 고정제를 심장에 주입합니다. 심장이 정착액으로 채워지기 시작한 직후, 심장의 정점을 들어 올리고 심장에서 1-2mm 아래의 혈관을 잘라 압력을 완화하고 액체가 배출되도록합니다.</li>
	<li>심장을 해부하고 심방24를 제거한 다음 심실을 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 3% 글루타르알데히드/0.1M 카코딜산나트륨에 떨어뜨립니다. 30-60분 동안 고정한 후 나비를 자르고 3% 글루타르알데히드/카코딜레이트가 포함된 페트리 접시에 넣습니다( 재료 표 참조). 글루타르알데히드/카코딜레이트 용액에 있는 동안 1mm3 의 작은 입방체로 수술용 칼날을 사용하여 심장을 자릅니다.</li>
	<li>해부된 심장 조직을 글루타르알데히드/카코딜레이트 용액에 4°C에서 24시간 동안 고정/담그십시오.</li>
</ol>2. 심장 조직 처리
<ol><li>24 시간 고정 후, 0.1 M의 나트륨 카코 딜 레이트 완충액에서 20 분 동안 조직을 세척한다.<ol><li>아래 단계에 따라 0.1M 카코딜레이트 완충액을 준비합니다.<ol><li>0.1 M 나트륨 카코딜레이트 완충액을 제조하기 위해, 90 mL의 증류수에 나트륨 카코딜레이트 (21.4 g) 및 1% 염화칼슘 용액 (3 mL)을 용해시켜 1 M 나트륨 카코딜레이트 완충액의 재고를 제조한다. 증류수를 첨가하여 용액을 100 mL로 부피를 높입니다. 용액을 잘 저어주고 밤새 방치하여 용질을 녹입니다.</li>
			<li>다음으로, 1M 나트륨 카코딜레이트 원액 10mL를 취하여 증류수 80mL에 첨가한다. HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정하고 증류수를 추가하여 최대 100mL까지 부피를 조정합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>0.1M 나트륨 카코딜레이트 완충액에서 세척을 20분 더 반복합니다. 나트륨 카코딜레이트 완충액에서 조직을 제거하고 실온에서 4시간 동안 2% 사산화오스뮴 용액에 담그십시오. 이 과정을 진동이라고합니다.<ol><li>아래 단계에 따라 2% 사산화오스뮴 용액을 준비합니다.<ol><li>2% 사산화오스뮴 용액을 제조하기 위해 4% 사산화오스뮴 용액 4mL( 재료 표 참조), 1M 카코딜산나트륨 원액(0.8mL) 및 증류수(3.2mL)를 취하여 총 8mL 용액을 만듭니다. 알림: 이 전체 프로세스와 여기서부터의 단계는 흄 후드에서 수행해야 합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>침투 후 조직을 2 % 아세트산 나트륨 용액에 실온에서 10 분 동안 담그십시오.<ol><li>증류수 20mL에 아세트산 나트륨 4g을 용해시켜 2 % 아세트산 나트륨 용액을 제조한다.</li>
	</ol></li>
	<li>다음으로, 조직을 실온에서 1 시간 동안 2 % 우라 닐 아세테이트 용액에 담그십시오.<ol><li>증류수 20mL에 우라닐아세테이트 4g을 용해시켜 2% 우라닐아세테이트 용액을 제조한다.</li>
	</ol></li>
	<li>우라닐 아세테이트 염색 후, 보충 파일 1에 언급된 순서대로 등급이 매겨진 알코올과 아세톤을 통해 조직을 순차적으로 탈수시킨다.</li>
</ol>3. 심장 조직 임베딩
<ol><li>탈수된 조직을 아래 단계에 따라 저점도 에폭시 수지에 내장합니다.<ol><li>저점도 에폭시 수지를 만들려면 10.24mL 튜브에 비닐 시클로헥센 디옥사이드(ERL 4221) 에폭시 단량체, 6.74mL의 폴리프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르(DER 732) 및 30.05mL의 노네닐 숙신산 무수물(NSA)( 재료 표 참조)을 혼합합니다. 현탁액을 손으로 2분 동안 잘 저어줍니다.</li>
		<li>2- 디메틸 아미노 에탄올 (DMAE, 재료 표 참조) 에폭시 촉진제 18 방울을 넣고 현탁액을 저어 성분을 완전히 혼합합니다.</li>
		<li>에폭시 수지에 조직을 함침시키는 것은 다음과 같은 혼합물 순서이다.<ol><li>100 % 아세톤을 1 : 1 수지 : 아세톤 현탁액으로 교체하고 실온에서 1 시간 동안 조직을 담그십시오.</li>
			<li>1 : 1 수지 : 아세톤 현탁액을 6 : 1 수지 : 아세톤 현탁액으로 교체하고 조직을 3 시간 동안 담그십시오.</li>
			<li>마지막으로 6:1 레진: 아세톤 현탁액을 100% 수지 현탁액으로 교체하고 티슈를 실온에서 밤새 담가 두십시오.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>조직을 8mm 마이크로 몰드( 재료 표 참조)의 새 수지에 넣고 매립된 조직을 70°C에서 밤새 경화시킵니다. 알림: 경화 후 수지가 단단하지만 부서지지 않는지 확인하십시오.</li>
</ol>4. 울트라마이크로톰을 이용한 조직 절편
<ol><li>울트라마이크로톰에 장착하기 전에 티슈가 있는 레진 블록을 1mm 이하로 자릅니다( 재료 표 참조). 울트라마이크로톰의 분할된 암에 가능한 한 정확하게 몰드를 배치하고 샘플 몰드를 다이아몬드 나이프 쪽으로 수동으로 전진시킵니다.</li>
	<li>Histo 나이프( 재료 표 참조)로 500nm(1/2미크론) 두께로 섹션을 자르고 EM 루프 도구를 사용하여 들어 올려 유리 슬라이드에 놓습니다.</li>
	<li>톨루이딘 블루 스테인25 를 위한 핫 플레이트 위에 유리 슬라이드를 놓아 관심 영역을 찾습니다.</li>
	<li>관심 영역을 찾은 후 Ultra 45° 나이프( 재료 표 참조)를 사용하여 옅은 금색 초박형 섹션(100nm)을 생성합니다. 이 초박형 섹션을 200 메쉬 구리 그리드의 둔한면에 놓습니다.</li>
</ol>5. 초박형 심장 부분 염색
<ol><li>에칭 용액, 즉 5% 나트륨 메타피리에이트 용액을 사용하여 항원을 마스킹함으로써 염색을 시작한다.<ol><li>증류수에 500 % 나트륨 메타 요오드 산 염 ( 재료 표 참조) 용액 500 μL를 준비하십시오. 알림: 사용하기 전에 신선한 용액을 준비하십시오.</li>
		<li>깨끗한 파라핀 필름에 메타 피리어드산 나트륨 용액 20μL를 넣으십시오. 조직 섹션이있는 완전히 건조 된 그리드를 에칭 용액의 물방울에 놓습니다. 알림: 조직 섹션이 있는 그리드의 둔한 면은 에칭 용액을 향해야 합니다.</li>
		<li>실온에서 30 분 동안 용액에 섹션 그리드를 그대로 두십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>에칭 된 조직 부분을 증류수 방울에 60 초 동안 놓아 세척하십시오.</li>
	<li>섹션 그리드를 실온에서 10분 동안 0.05 M 글리신 용액의 방울 상에 위치시켜 잔류 알데히드를 차단한다. 그리드의 가장자리를 여과지에 닦아 잔류 글리신 용액을 제거합니다.<ol><li>1x PBS (pH 7.4)의 1mL에 3.75mg의 글리신을 용해시켜 0.05M 글리신 용액 ( 재료 표 참조)을 준비합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>섹션 그리드를 실온에서 25분 동안 10-20μL의 블로킹 용액에 넣습니다. 참고: 블로킹 용액 조성: 2 μL의 1% 정상 염소 혈청(NGS) + 20 μL의 1% BSA(최종 농도: 10%) + 178 μL의 1x PBS(pH 7.4)를 만들어 200 μL의 최종 부피를 만듭니다.</li>
	<li>그리드 가장자리를 여과지에 묻히고 그리드 섹션을 항체 희석제 위에 놓고 실온에서 10분 동안 컨디셔닝합니다.</li>
	<li>그리드 절편을 1차 항체(이 경우 Sigmar1, 재료 표 참조, 항체 희석제에서 1:10 희석)로 가습된 챔버에서 1시간 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>그리드를 블롯 건조시키고, 그리드 섹션을 항체 희석제로 각각 5분 동안 2회 세척한다.</li>
	<li>그리드 섹션을 비오티닐화된 2차 항체(이 경우 비오티닐화된 염소 항-토끼 다클론 2차 항체, 재료 표 참조, 항체 희석제에 1:10으로 희석)와 함께 가습된 챔버에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>그리드를 블롯 건조시키고, 그리드 섹션을 항체 희석제로 각각 5분 동안 2회 세척한다.</li>
	<li>그리드 섹션을 시판되는 스트렙타비딘 접합 QD(QD655nm, 재료 표 참조, 항체 희석제에서 1:10 희석)에서 실온의 가습 챔버에서 1시간 동안 배양합니다. 챔버를 알루미늄 호일로 덮어 빛에 노출되는 것을 방지하십시오.</li>
	<li>여과지를 사용하여 그리드 가장자리를 얼룩 건조시키고 그리드 섹션을 물방울 위에 2분 동안 올려 세척합니다.</li>
	<li>그리드의 가장자리를 닦아 건조시킵니다.</li>
</ol>6. 투과 전자 현미경 (TEM) 이미징
<ol><li>시편 사중주 홀더의 구리 그리드에 초박형 섹션을 놓고 전자 빔에서 그리드를 선택할 수 있는 위치에 고정합니다.</li>
	<li>시편 홀더를 현미경 컬럼에 삽입하고 펌프 스위치를 작동시켜 고니오미터를 비운 다음 시편 홀더를 현미경 컬럼에 완전히 삽입합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>이미지 관찰을 위해 빔을 생성하기 전에 전압을 80kV로 설정하십시오.</li>
	<li>원하는 영역에 초점을 맞추고 고속 디지털 카메라를 사용하여 이미지를 캡처하고 파일을 .tif 형식으로 저장합니다. 참고: 이 연구에서 이미지를 캡처하기 위한 현미경 설정은 가속 전압 또는 80kV의 고압 전압 및 20,000x의 배율이었습니다.</li>
</ol>

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본 연구에서, QD-매개 면역표지는 Sigmar1의 세포내 국소화를 뚜렷하게 보여주기 위해 사용되었다. QD를 사용하여 미토콘드리아 막, 특히 내부 미토콘드리아 막에 대한 Sigmar1의 국소화가 심장 조직에 묘사되었습니다. 또한 Sigmar1은 그림 2A-D와 같이 미세 구조 수준에서 근형/소포체(S/ER) 및 리소좀에 위치하는 것으로 밝혀졌습니다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 글루타르알데히드 고정 및 삼화 후 항원을 언마스킹하기 위해 고농축 나트륨 메타피리오데이트 용액을 사용하는 에칭 또는 항원 마스킹 해제 단계입니다. 이 프로토콜은 실온에서 30분 동안 고농도(5%)의 메타요오드산나트륨을 사용한 단일 처리를 사용했습니다. 나트륨 메타 요오드 배양을위한 더 긴 지속 시간 또는 더 높은 농도는 구조의 응집, 세포 기관에 대한 막 정의의 손실, 섹션의 천공을 유발하여 단백질 또는 구조를 시각화하기 어렵게 만들기 때문에이 단계에서 특별한주의가 필요합니다. 대안적으로, 5% 메타피리오테이트 대신 30분 동안 두 단계로 더 낮은 농도의 (3%) 메타피리오테이트 용액을 사용할 수도 있습니다. 연구에 따르면 이 옵션은 1단계 30분 배양을 위한 5% 메타주기산 용액과 유사한 결과를 나타냅니다. 그러나, 2 회 동안 30 분의 배양을위한 3 % 메타 피리오트 용액은 공정26,27,28에 대한 더 나은 제어를 제공한다. 처음에이 프로토콜은 30 분 동안 10 % 메타 요오드 용액으로 섹션을 배양했습니다. 그러나, 이 농도에 의해 조직 절편에 너무 많은 천공이 생성되었기 때문에, 메타주기산 용액의 최종 농도 및 배양 기간은 테이퍼링되고 30분 동안 5%로 최적화되었다.
또 다른 단계는 글루타르알데히드로 고정 시간을 최적화해야 했습니다. 최적이 아닌 조직 고정은 부적절한 QD 라벨링을 초래하는 반면, 조직을 과도하게 고정하면 더 높은 비특이적 라벨링을 초래합니다. 따라서 단백질의 적절하고 특이적인 표지를 위한 최적의 조직 고정 수준을 결정하고 적정할 때 신중하게 고려해야 합니다. 심장 조직을 사용하는이 방법에서, 글루 타르 알데히드와의 고정 시간은 24 시간 및 48 시간을 시점으로 사용하여 적정되었다. 두 시점 모두에 대해 고정된 섹션의 염색 이미지를 기반으로 24시간 동안 고정된 섹션이 더 나은 결과를 나타내는 것으로 나타났습니다. 현재까지 QD 나노 결정은 525, 565, 585, 605, 655 및 705nm11,29를 포함한 다양한 크기로 제공됩니다. 이러한 각 QD는 자체 방출 스펙트럼을 가지며 서로 다른 파장에서 형광을 방출합니다. 또한 다양한 크기의 상용 QD는 다양한 모양을 표시합니다. 예를 들어, QD 525, 565 및 585는 크기가 다른 거의 구형인 반면 QD 605, 655 및 705는 불규칙한 직사각형 모양입니다. 이들 상이한 QD 나노 결정 중에서, QD 525, 565 및 655는 서로 쉽게 구별가능하다(11, 29). 방출 스펙트럼과 모양의 이러한 차이로 인해 QD는 단백질의 다중 표지 및 형광 및 전자 현미경에 의한 시각화에 적합한 후보입니다. 이 연구에서는 시판되는 QD인 QD 655를 사용하여 Sigmar1 단백질을 표지하여 염색된 절편의 비특이적 배경과 구별했습니다.
고해상도 현미경에서 단백질 표지를 위한 QD의 또 다른 대응물은 면역골드 입자입니다. 면역골드 입자는 전통적으로 고해상도 현미경을 위해 단백질을 표지하는 데 사용됩니다. 이 금 입자는 QD 나노 결정에 비해 전자 밀도가 높고 쉽게 식별 할 수 있습니다. 그러나 QD는 조직 침투 개선, 안정성 및 저장 수명 향상, 미세 구조 구성 요소의 더 나은 유지로 더 나은 효율성을 나타내므로 단백질 라벨링 4,5에 더 나은 후보가 됩니다. QD는 또한 광학 및 전자 현미경으로 검출할 수 있는 고유한 능력을 가지고 있어 면역금 라벨링10에 비해 가치가 추가됩니다.
이 QD 매개 면역표지의 한 가지 한계는 처리 중에 사산화오스뮴을 사용한다는 것입니다. 오스뮴 테트라 옥사이드는 전자 밀도, 전도도 및 그렇지 않으면 덜 전자 밀도가 높고 덜 대조적 인 생물학적 막 구조(5,30)의 대비를 증가시키는 데 사용됩니다. 그러나 사산화오스뮴을 사용하면 QD6으로 표지될 때 형광을 생성하기 위해 시편의 특성이 즉각적이고 비가역적으로 파괴됩니다. 이것은 형광 현미경 검사에서 QD의 사용을 제한합니다. 사산화오스뮴의 사용을 생략하는 대안적인 접근법은 형광 특성을 유지하고 따라서 QD 매개 면역표지의 이중 적용에 유리할 것입니다. TEM의 최신 모델 중 일부에는 재료의 원소 조성을 식별 할 수있는 에너지 분산 형 X 선 분석 (EDX) 시스템을 부착 할 수있는 옵션이 있습니다. 이 연구의 또 다른 한계는 EDX를 사용한 샘플 및 이미지 분석의 원소 매핑이 없다는 것입니다. 따라서 향후 연구는 원소 조성을 분석하기 위해 QD 스펙트럼의 EDX 분석에 초점을 맞춰야 합니다.
단백질의 QD 표지는 최근 많은 관심을 받고 있습니다. QD는 생물학 연구 및 의료 치료 모두에서 여러 응용 분야와 이점을 제공합니다. QD는 폴리덴테이트 리간드로 추가로 랩핑되어 양자 수율을 유지하는 증가된 안정성을 나타낸다. 또한, 이러한 생체-호의적 제제로 QD를 캡슐화하는 것은 또한 조직에서의 생체이용률을 증가시켜 종양 검출, 생세포 영상화, 약물 전달 및 조직 영상화에 잠재적으로 응용하기에 좋은 후보가 된다 3,31,32.

인체는 수많은 신체 기능을 담당하는 많은 단백질로 구성되어 있습니다. 단백질의 기능은 주로 장기 및 세포 소기관에서의 국소화에 달려 있습니다. 세포내 분획화, 면역형광법 및 세제 매개 단백질 추출을 포함한 여러 기술이 단백질의 세포내 국소화를 결정하는 데 일반적으로 사용됩니다1,2. 면역 형광 염료를 사용하는 현미경 검사는 이러한 기술 중에서 가장 널리 사용되는 방법입니다. 그러나, 이 기술에 사용된 형광 염료는 덜 안정하고 광퇴색되기 쉽다3. 다른 기술에는 단백질을 전자 밀도, 중금속 (금, 페리틴) 또는 양자점 나노 결정으로 면역 표지하여 초 구조 수준에서 단백질을 시각화 한 다음 투과 전자 현미경 (TEM)4,5을 사용하여 시각화하는 고해상도 현미경이 포함되었습니다.
QD는 생물학적 시스템에서 큰 의미를 갖는 제어 가능한 광발광 특성을 갖는 반도체 금속 화합물로 구성된 반도체 나노 결정입니다3. QD 나노 결정은 적절한 안정성과 기능을 보장하기 위해 나노 결정 형성시 나노 결정이 캡슐화되는 코어 쉘 형식으로 만들어집니다. 일반적으로 사용되는 코어-쉘 나노 결정 조합은 CdSe / ZnS, CdSe / CdS CdSe / ZnSe, CdTe/CdS, CdTe/ZnS 및 CdTe/CdS / ZnS (코어 / 쉘 / 쉘)3입니다. 이러한 나노 결정 조합 중에서 CdSe / ZnS 및 CdSe / CdS가 가장 활발하게 연구되고 2 차 항체 접합체 3,6으로 자주 사용됩니다. 이러한 QD 나노 입자는 또한 기존의 형광단과 다른 여기 및 방출 스펙트럼을 가진 형광 특성을 가지고 있습니다. QD는 벌크 원자가 밴드에서 전자의 여기를 사용하여 기존 형광단에 비해 더 높은 형광 양자 수율을 나타냅니다. 반도체 금속의 나노 결정 배열은 QD 매개 라벨링을보다 안정하고 광 표백에 내성으로 만듭니다6. 또한, QD 및 그의 결정 구조 내의 나노 결정 코어는 상이한 크기의 QD가 넓은 범위의 흡수 스펙트럼 및 매우 좁은 방출 피크(7)를 가질 수있게한다. 또한, 이러한 QD 입자는 높은 전자 밀도를 산출하기에 충분히 커서 투과 전자 현미경 5,8,9를 포함한 고해상도 현미경 기술에 유용합니다. 이러한 QD 나노 결정은 또한 다양한 형광 방출 스펙트럼 및 모양을 가진 여러 크기로 상업적으로 이용 가능하므로 다중 항체10,11로 표지하기에 좋은 후보입니다.
QD 기술은 살아있는 세포 이미징, 세포의 수송 메커니즘 연구, 단백질 확산 운동의 막 수송, 세포의 기능적 이질성 및 세포 내 소기관의 마킹 3,12,13,14,15,16 . QD는 또한 암 조직을 표적화 및 검출하고, 종양의 분자 프로파일 및 면역 상태를 특성화하고, 유리체 및 망막 상막을 시각화하기 위한 분자 진단에도 유용합니다 3,17,18. 또한 QD는 광역학 요법을 통해 종양 악성 종양을 치료하고 눈에 약물을 전달하여 안과 기형을 치료하는 의료 요법에도 사용할 수 있습니다 3,17,18,19.
이러한 매우 유용한 QD 나노 결정을 사용하여 본 연구는 Sigma 1 수용체 (Sigmar1)라는 단백질의 세포 내 국소화를 결정했습니다. Sigmar1은 유비쿼터스 발현 멀티 태스킹 분자 샤페론 단백질입니다. 다양한 조직 및 기관에서 Sigmar1의 세포하 국소화에 초점을 맞춘 광범위한 연구에서 분자 기능20을 유도하는 세포 및 조직 유형 특이적 세포하 국소화가 보고되었습니다. 서로 다른 생화학적 접근법을 사용하는 다양한 세포(신경세포, 광수용체 및 면역 세포)와 조직(간 및 뇌)에서 소포체(ER), 미토콘드리아 관련 ER 막(MAM), 핵 외피, 원형질막, 핵소포체, 핵 및 미토콘드리아에 대한 Sigmar1의 국소화가 보고되었습니다. 이러한 모든 연구에도 불구하고, 심장에서 Sigmar1의 세포 내 국소화는 알려지지 않았습니다20. 따라서, 심장 조직에서 Sigmar1의 세포내 국소화는 QD-매개 면역표지에 이어 TEM 영상화를 이용하여 결정하였다.

<table><tbody><tr><td>200 메쉬 구리 그리드</td><td>Ted Pella</td><td>G200HH</td><td></td></tr><tr><td>FVB/N 배경을 가진 6개월 된 수컷 마우스</td><td>잭슨 연구소, 바 하버, ME</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세톤 100%</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A949</td><td></td></tr><tr><td>항체 희석제</td><td>Dako</td><td>S3022</td><td></td></tr><tr><td>anti-Sigmar1 항체</td><td>세포 신호</td><td>61994S</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated goat anti-rabbit IgG 항체</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7389</td><td></td></tr><tr><td>BSAc (10%)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>25557</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal Xyl</td><td>Thermo fisher</td><td>8312-4</td><td></td></tr><tr><td>DER 732C36AA10:C33</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>13010</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마 알드리치</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 나이프</td><td>디아토메</td><td>히스토; Ultra 450</td><td></td></tr><tr><td>DMAE</td><td>전자 현미경 과학</td><td>13300</td><td></td></tr><tr><td>전자 현미경</td><td></td><td>JEOL JEOL-1400 플래시</td><td></td></tr><tr><td>ERL 4221</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15004</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 100%</td> <td>피셔 화학</td><td>A405P</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 3%</td> <td>전자 현미경 과학</td><td>16538-15</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td>, <td>Alfa Aesar</td><td>A13816</td><td></td></tr>, <tr><td>염산</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA56</td><td></td></tr><tr><td>Micromolds,</td><td>Ted Pella</td><td>10505</td><td></td></tr>, <tr><td>Microtome</td><td>Leica Microsystem</td><td>EM UC7</td><td></td></tr>, <tr><td>Normal goat serum</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>NSA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19050</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>Genesse Scientific</td><td>16-101</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마 알드리치</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td>성 <td>시그마 알드리치</td><td>71640</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 655 스트렙타비딘 접합체</td><td>인비트로겐</td><td>Q10121MP</td><td></td></tr><tr><td>아세트산나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP334</td><td></td></tr><tr><td>카코딜산나트륨</td><td>전자 현미경 과학</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>메타주기산나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마 알드리치</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>수술용 블레이드(크기 10)</td><td>Aspen surgical</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>TEM&nbsp; 이미지 소프트웨어</td><td>AMT-V700</td><td>AMT TEM 이미징 시스템</td> TEM 이미징 카메라 <td></td></tr><tr><td></td><td>XR80 TEM 시리즈</td><td>AMT TEM 이미징 시스템</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue O 솔루션 (0.5%)</td><td>Fisher Scientic</td><td>S25612</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetate</td><td>Polysciences</td><td>21447</td><td></td></tr></tbody></table>

양자점 매개 면역 표지를 사용한 후 투과 전자 현미경을 사용하여 심장에서 단백질의 세포내 국소화를 시각화

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy

세포 내 국소화는 적절한 기능을 묘사하고 특정 단백질의 분자 메커니즘을 결정하는 데 중요합니다. 단백질의 세포 내 국소화를 결정하기 위해 몇 가지 정성 및 정량적 기술이 사용됩니다. 단백질의 세포하 국소화를 결정하는 새로운 기술 중 하나는 단백질의 양자점(QD) 매개 면역 표지와 투과 전자 현미경(TEM)으로 이미징하는 것입니다. QD는 결정 구조와 높은 전자 밀도의 이중 특성을 가진 반도체 나노 결정으로 전자 현미경에 적용 할 수 있습니다. 이 현재 방법은 초구조적 수준에서 심장 조직에서 QD-TEM을 사용하여 시그마 1 수용체(Sigmar1) 단백질의 세포내 국소화를 시각화했습니다. 야생형 마우스의 심장 조직 절편의 작은 입방체를 3 % 글루 타르 알데히드로 고정시킨 후, 삼진화시키고, 우라 닐 아세테이트로 염색 한 다음, 에탄올과 아세톤으로 순차적으로 탈수시켰다. 이 탈수 된 심장 조직 절편을 저점도 에폭시 수지에 매립하고 500nm 두께의 얇은 절편으로 절단하고 그리드에 올려 놓은 다음 5 % 메타 요오드 나트륨으로 항원 마스킹을 한 다음 잔류 알데히드를 글리신으로 담금질했습니다. 조직을 차단한 후, 1차 항체, 비오티닐화된 2차 항체 및 스트렙타비딘-접합된 QD에서 순차적 인큐베이션하였다. 이들 염색된 절편을 블롯 건조시키고 TEM을 사용하여 고배율로 이미징하였다. QD-TEM 기술은 심장의 미세 구조 수준에서 Sigmar1 단백질의 세포 내 국소화를 시각화 할 수있었습니다. 이러한 기술은 모든 장기 시스템에서 단백질의 존재 및 세포 내 국소화를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.

현재의 QD-TEM 방법론은 성인 마우스 초박형 심장 절편에서 anti-Sigmar1 표적 QD 라벨링을 수행하여 Sigmar1의 존재와 세포하 심장 구획에서의 국소화를 시각화했습니다. 미토콘드리아 막(내부 및 외부), 리소좀 및 소포체/근형질 세망(ER/SR) 막-미토콘드리아 계면(그림 2A,B)에 전자 조밀한 anti-Sigmar1 표지된 QD를 QD-TEM 이미지로 설명했습니다. 또한, 심장 절편은 항-Sigmar1 토끼 1차 항체에 대한 이소형 대조군으로서 토끼 IgG 및 QD로 표지되었다(그림 2C,D). 따라서 QD-TEM 이미징은 내인성 Sigmar1의 국소화와 주로 리소좀과 미토콘드리아 막에서의 농축을 강조했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64085/64085fig01.jpg"> 그림 1: QD-TEM을 수행하는 데 사용되는 순차적 단계 및 절차를 보여주는 개략도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64085/64085fig02.jpg"> 그림 2: 성체 마우스 심장 조직에서 Sigmar1 면역 표지된 QD. (A,B) 미토콘드리아(외부 및 내부 막), 미토콘드리아 관련 소포체(ER)/근형질 세망(SR) 막 및 리소좀에서 Sigmar1 표지된 QD를 보여주는 대표적인 TEM 이미지. (씨,디) QD 및 토끼 IgG로 표지된 이소형형 대조군의 심장 절편의 TEM 이미지. 스케일 바: 200 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1 : 조직 탈수에 사용되는 PBS 및 기타 용액의 조성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

본 프로토콜은 양자점을 사용하여 심장 조직 절편에서 단백질을 면역표지하는 방법을 기술한다. 이 기술은 미세 구조 수준에서 모든 단백질의 세포 내 국소화 및 발현을 시각화하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

The subcellular localization is critical to delineating proper function and determining the molecular mechanisms of a particular protein. Several ...

단백질의 세포 내 국소화를 결정하는 것은 단백질의 적절한 기능과 관련된 메커니즘을 설명하는 데 중요합니다. 이 방법은 울트라 구조 수준에서 단백질의 세포 내 국소화를 시각화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 양자점 매개 면역 표지는 더 안정적이고 광퇴색에 내성이 있으며 자체 방출 스펙트럼을 가지며 높은 전자 밀도를 생성하며 조직에 더 나은 침투로 조직에 더 높은 효율성과 유지력을 나타냅니다.공정의 여러 단계, 즉 고정, 에칭, 블로킹 및 최적의 퀀텀닷 농도는 최적화하기 어려운 단계입니다. 사용 된 시약의 여러 시점과 농도를 시도하는 것이 좋습니다. 또 다른 과제는 인내와 물론 연습 만이 효과가있는 그리드를 처리하는 것입니다.이 절차를 시연하는 것은 우편 연구원 인 Chowdhury Abdullah, 내 실험실의 대학원생 인 Naznin Remex, 전자 현미경 서비스의 전자 현미경 감독자 인 Brandon Hartman입니다. 마우스를 마취시키고 흉강을 연 후, 0.1 몰의 나트륨 카코 딜 레이트 완충액에 얼음처럼 차가운 3 % 글루 타르 알데히드를 사용하여 2 분 동안 심장을 풍부하게합니다. 5 x 8인치의 25게이지 바늘을 사용하여 중력 압력을 사용하여 고정액을 심장에 도입합니다.심장이 정착액으로 채워지기 시작한 직후, 심장의 정점을 들어 올려 압력을 완화하십시오. 심장에서 1-2 밀리미터 떨어진 혈관을 자르고 액체가 배출되도록하십시오. 심장을 해부하십시오.심방을 제거하고 심실을 얼음처럼 차가운 3 % 글루 타르 알데히드와 0.1 몰 나트륨 카코 딜레이트가 들어있는 페트리 접시에 떨어 뜨립니다. 고정 30-60 분 후에 나비를 자르고 심실을 페트리 접시에 다시 넣으십시오. 1 입방 밀리미터의 작은 입방체로 수술 용 칼날을 사용하여 심장을 자릅니다.해부 된 심장 조직을 글루 타르 알데히드에 고정하고 담그고 섭씨 4도에서 24 시간 동안 카코 딜 레이트합니다. 24 시간의 고정 후, 조직을 0.1 몰 나트륨 카코 딜레이트 완충액에서 20 분 동안 두 번 세척한다. 나트륨 카코딜레이트 완충액에서 조직을 제거하고 실온에서 4시간 동안 2%오스뮴 사산화칼슘 용액에 담그십시오.침투 후 조직을 2% 아세트산나트륨 용액에 실온에서 10분 동안 담그십시오. 다음으로, 조직을 실온에서 1 시간 동안 2 % 우라 닐 아세테이트 용액에 담그십시오. 우라닐 아세테이트 염색 후, 등급이 매겨진 알코올과 아세톤을 통해 조직을 순차적으로 탈수시킨다.탈수된 조직을 원고에 설명된 대로 저점도 에폭시 수지에 매립합니다. 조직을 8mm 마이크로 몰드의 새 수지에 넣고 내장된 조직을 섭씨 70도에서 밤새 경화시킵니다. 관심 영역을 찾은 후 울트라 45도 나이프를 사용하여 옅은 금색 초박형 섹션을 생성합니다.이 초박형 섹션을 200 메쉬 구리 그리드의 둔한면에 놓습니다. 깨끗한 파라핀 필름에 20 마이크로 리터의 에칭 용액 메타 피리오데이트를 넣어 항원을 마스킹하여 염색을 시작합니다. 조직 섹션이있는 건조 된 그리드를 에칭 용액의 물방울 위에 놓습니다.실온에서 30 분 동안 용액에 섹션 그리드를 그대로 두십시오. 에칭 된 조직 섹션을 증류수 방울에 60 초 동안 놓아 세척하십시오. 섹션 그리드를 0.05 몰의 글리신 용액 액적 위에 놓고 실온에서 10분 동안 침상시켜 잔류 알데히드를 차단한다.그리드의 가장자리를 여과지에 닦아 잔류 글리신 용액을 제거합니다. 단면 그리드를 실온에서 25분 동안 10 내지 20 마이크로리터의 블로킹 용액에 둔다. 그리드 가장자리를 여과지에 묻히고 그리드 섹션을 항체 희석제 위에 놓고 실온에서 10분 동안 컨디셔닝합니다.그리드 절편을 1차 항체와 함께 가습된 챔버에서 1시간 30분 동안 인큐베이션한다. 그리드를 블롯 건조시키고, 그리드 섹션을 항체 희석제로 각각 5분 동안 2회 세척한다. 그리드 절편을 비오티닐화된 2차 항체와 함께 가습된 챔버에서 1시간 동안 인큐베이션한다.그리드가 블롯 건조되면, 그리드 섹션을 항체 희석제로 각각 5분 동안 2회 세척한다. 그리드 절편을 시판되는 스트렙타비딘 컨쥬게이트된 QD에서 실온의 챔버에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 챔버를 알루미늄 호일로 덮어 빛에 노출되는 것을 방지하십시오.여과지를 사용하여 그리드 가장자리를 얼룩 건조시킨 후 격자 부분을 물방울에 2 분 동안 두어 세척하고 그리드 가장자리를 닦아 건조시킵니다. 시편 홀더를 현미경 컬럼에 삽입하고 펌프 스위치를 작동시켜 고니오미터를 평가한 다음 시편 홀더를 현미경 컬럼에 완전히 삽입합니다. 원하는 영역에 잘 집중하십시오.고속 디지털 카메라를 사용하여 이미지를 캡처하고 파일을 tif 형식으로 저장합니다. 미토콘드리아 막, 리소좀, 및 소포체 또는 근질 세망 막 미토콘드리아 계면은 Sigmar1 표지 양자점의 존재를 보여주었습니다. 심장 절편은 항-Sigmar1 토끼 1차 항체에 대한 이소형형 대조군으로서 토끼 면역글로불린 G 및 양자점을 사용하여 시각화하였다.이 프로토콜에서 작업하는 동안 고려해야 할 한 가지 중요한 사항은 항원에 대한 마스킹 해제 시간입니다. 조직 절편이 너무 오랫동안 에칭되면, 메타주기 용액은 얇은 조직 절편에 천공을 생성합니다. 퀀텀닷 매개 라벨링은 종양 검출, 종양 분자 및 면역 상태 프로파일링, 조직 이미징 분야에서 주목을 받고 있어 의료 진단을 위한 새로운 길을 열어주고 있습니다.퀀텀닷은 또한 광역학 요법을 통해 종양을 치료하고 눈에 약을 전달하여 안과 기형을 치료하는 데 유용합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

성인 심장 myocytes 동물 마음으로부터 격리하고 며칠 동안 교양 수있는 기본 세포입니다. 이 문화가 기간 내에 adenoviral 유전자 전송은 유전자 인코딩 bi​​osensors (GEBs) 또는 형광 융합 단백질을 표현하는 데 사용할 수 있습니다. 두 접근 방법 공촛점 현미경에 의해 세포 조사를 허용합니다.

공촛점 이미징에 대한 분리 및 성인 심장 Myocytes의 유전자 조작

이 비디오는 양자점을 사용하여 쥐 심장 조직 절편에서 시그마-1 수용체의 면역 표지 기술을 보여줍니다. 심장 조직은 고정되고, 진동화되고, 염색되고, 탈수되고, 수지에 삽입된 다음 절단됩니다. 그런 다음 절편을 항체로 처리하고 양자 점으로 표시하여 전자 현미경을 사용하여 Sigma-1 수용체의 세포 내 국소화를 구분합니다.

단백질의 세포 내 국소화를 시각화하기 위한 면역 라벨링 기법

선천성 심장 결함으로 이어지는 돌연변이는 발달 중 심장 구조에 대한 생체 내 조사의 이점을 얻지만, 마우스 배아 심장에 대한 고해상도 구조 연구는 기술적으로 어렵습니다. 여기에서는 발달 중인 마우스 심장의 심근세포 특이적 구조를 평가하기 위한 강력한 면역형광 및 이미지 분석 방법을 제시합니다.

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

우리는 온전한 배아 및 출생 후 심장 내부 깊숙한 곳에서 형광 단백질로 표지된 세포를 체적 측정으로 이미지화하는 프로토콜을 설명합니다. 전체 산 염색과 함께 조직 제거 방법을 사용하면 배아 또는 출생 후 심장 내부의 단일 형광 단백질 표지 세포를 명확하고 정확하게 이미지화할 수 있습니다.

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

양자점(QD) 나노입자를 에폭시 포매 인간 병리학 조직의 상관 면역세포화학적 연구에 사용할 수 있는 방법을 설명합니다. 당사는 광시야 형광 현미경 및 투과 전자 현미경으로 시각화되는 상용 항체 단편 접합 QD를 사용합니다.

양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

중심부에 위치한 분자 이벤트는 기관의 전기 및 수축 기능을 조정. 여기에 제시된 지역 필드 형광 현미경 기술의 집합은 그대로 마음에 휴대 변수의 기록을 할 수 있습니다. 심장 기능을 정의하는 메커니즘을 확인하면 마음이 병적 인 상황에서 어떻게 작동하는지 이해에 중요하다.

지역 필드 형광 현미경 : 본래 마음의 세포 신호 이미징

여기, 우리는 전체 마운트 면역 형광 검사 및 초기 단계 마우스 배아의 양적 volumetric 분석 이미지 기반에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 질적 및 양적 개발, 심장 구조를 평가 하 고 다른 기관 체계에 광범위 하 게 적응할 수 있을 수 있습니다 제안에 대 한 강력한 접근으로이 방법을 제시.

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

여기, 우리 살아있는 세포의 세포에 단일 막 단백질의 다 색 지역화에 대 한 프로토콜을 제시. Fluorophores 연결할 자체 라벨 단백질 사용 됩니다. 단백질, 세포 기관이 동일한의 다른 막 구획에 있는 ~ 18의 정밀도로 지역화할 수 nm.

살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

이 프로토콜은 APEX2 태그가 달린 막 단백질이 최적으로 보존된 세포 초음파 구조 내에서 전송 전자 현미경검사법에 의해 국한될 수 있는 cryoAPEX 방법을 설명합니다.

초구조적으로 보존된 세포 내 막 단백질 국소화의 전자 현미경 분석을 위한 CryoAPEX 방법

재관류 급성 심근경색증(repAMI)에서 심장 손상의 3차원(3D) 재구성은 관련 질병에 영향을 미치는 패턴의 충실한 정량화 및 공동 국소화를 가능하게 합니다. 여기에서는 심장 손상, 위험 영역 및 면역 세포 반응의 동시 측정을 위해 자동화 가능한 라이트 시트 유도 이미징 접근 방식이 제공됩니다.

라이트 시트 형광 현미경을 이용한 재관류 급성 심근경색증의 심장 손상 및 면역 반응의 동시 3D 분석

배우세요 양자점 매개 면역 표지법을 사용하여 심장 조직에서 단백질의 세포내 국소화를 시각화하는 방법을. 이 기술은 초고해상도 이미징을 통해 단백질 기능과 관련 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.

양자점 매개 면역 표지를 사용한 후 투과 전자 현미경을 사용하여 심장에서 단백질의 세포내 국소화를 시각화

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