Name: 생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 학습하세요 멤브레인 형태가 세틴 단백질 어셈블리 조직에 미치는 영향을 연구하는 방법을. 지질 이중층과 단백질 상호작용을 분석하여 세포생물학 및 생물물리학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 국립 보건원 (NIH) 그랜트 No의 지원을 받았다. R01 GM-130934 및 NSF (National Science Foundation) 그랜트 MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V., K.S.C.는 T32 GM119999 어워드에 따라 국립 일반 의료 과학 연구소의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

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<li>Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+septin+assemblies+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers.</a> Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).</li>
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<li>Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+supported+phospholipid+bilayers+on+molecular+surfaces%3A+Role+of+surface+charge+density+and+electrostatic+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).</li>
<li>Andrews, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+supported+lipid+bilayers+%28SLBs%29+from+buffers+containing+low+concentrations+of+group+I+chloride+salts%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts.</a> Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).</li>
<li>Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+NaCl+and+KCl+on+phosphatidylcholine+and+phosphatidylethanolamine+lipid+membranes%3A+Insight+from+atomic-scale+simulations+for+understanding+salt-induced+effects+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).</li>
<li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).</li>
<li>Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+membrane+systems+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li>
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저자는 이해 상충이 없습니다.

세포막은 다양한 모양, 곡률 및 물리 화학적 특성을 취합니다. 세포가 마이크로미터 규모의 어셈블리를 구축하는 나노미터 규모의 기계를 연구하기 위해서는 멤브레인 모방체의 최소 재구성 시스템을 설계할 필요가 있다. 이 프로토콜은 막 곡률과 조성을 정밀하게 제어하면서 사용자가 널리 이용 가능한 현미경 기술을 사용하여 정량적 형광 측정을 쉽게 수행 할 수있게 해주는 기술을 제시합니다.
이 프로토콜의 가장 중요한 구성 요소는 적절한 표면에 우물을 조립하고 지질을 처리하는 것입니다. 여기에 설명 된 웰은 PCR 튜브 및 UV 활성화 접착제를 사용하여 수작업으로 제작되었습니다. 조립 중에 반응 영역 내부에 접착제가 생기지 않는 것이 중요합니다. 이것은 우물의 가장자리를 따라 이미징하고 커버 글라스 상에 고단백질 흡착을 찾음으로써 실험 중에 확인할 수 있습니다. 사용자는 상업적으로 주문할 수 있는 실리콘과 같은 웰에 대체 재료를 사용하도록 선택할 수 있지만, 제시된 방법은 이동하거나 누출되지 ...

세포의 모양과 많은 내부 구획은 그들을 둘러싸고있는 지질 막에 의존합니다. 막은 단백질과의 상호작용, 지질 분류 및 내외부 힘의 작용을 통해 변형되어 다양한 형상 1,2,3,4을 생성할 수 있는 점탄성 구조이다. 이러한 형상은 종종 막 곡률의 관점에서 설명된다. 세포는 세포 밀매, 사이토카인증 및 이동5,6을 포함하는 과정에 대해 정의된 시공간적 제어를 보장하기 위해, 특정 막 곡률에 우선적으로 조립하거나 "감지"할 수 있는 다양한 단백질 세트를 사용한다. 멤브레인에서 세포 기계의 역학은 시간과 공간 분해능과 세포 건강의 균형을 맞추는 것이 어렵 기 때문에 관찰하기가 특히 어렵습니다. 초분해능 기술은 이러한 구조에 대한 자세한 보기를 제공할 수 있지만, 대부분의 기계류에서 조립/분해의 시간 척도에 부합하지 않는 긴 인수가 필요합니다. 또한, 이러한 어셈블리의 기본 환경에서 분자 복잡성과 단일 구성 요소가 수행 할 수있는 다양한 역할은 최소한의 재구성 시스템을 분자의 기능적 능력을 연구하는 데 유용한 도구로 만듭니다.
세포 외부의 막 특성 및 단백질-막 상호작용을 연구하기 위해 최소한의 막 모조물이 개발되었다. 막 모조물은 리포솜 또는 거대한 유니라멜라 소포와 같은 독립형 지질 이중층으로부터 지지된 지질 이중층(SLBs)7,8,9,10에 이르기까지 다양하다. SLB는 기본 지지체에 앵커링된 생체모방 막으로, 전형적으로 유리, 운모 또는 실리카11,12로 구성된다. 평면 표면, 구체, 막대, 심지어 오목한 곡률과 볼록한 곡률 모두에서 단백질-막 상호작용을 동시에 조사하기 위해 기복 또는 미세패턴화된 기판을 포함한 다양한 형상을 사용할 수 있습니다1 3,14,15,16,17,18 . 이중층 형성은 친수성 표면 상에 소낭 흡착으로 시작하고, 이어서 융합 및 파열이 뒤이어 연속적인 이중층을 형성한다(도 1)19. 지지되는 이중층은 특히 빛과 전자 현미경에 적합하며, 세포에서 종종 달성할 수 있는 것보다 더 나은 시간과 공간 분해능을 제공한다. 곡선형 SLB는 특히 상당한 막 변형이 없을 때 단백질 곡률 감도를 프로브하는 매력적인 수단을 제공하여 곡률 감지와 곡률 유도를 구별할 수 있으며, 이는 종종 독립 시스템에서 분리할 수 없습니다.
셉틴은 필라멘트-형성 세포골격 단백질의 부류로서 양성 곡선 막(6,18,20)에 조립하는 능력으로 잘 알려져 있다. 효모에서 세포 주기의 과정에 걸쳐, 셉틴은 고리로 조립하고, 새싹 출현 및 사이토카인증과 관련된 모래시계 및 이중 고리 구조를 형성하기 위해 재배열되어야 한다(21). 다양한 세포주기 단계22에서 셉틴 구조를 관찰하기 위해 백금 복제 전자 현미경을 사용하여 아름다운 작업이 수행되었지만 효모에서 광 현미경을 사용하여 시간이 지남에 따라 셉틴 조립을 관찰하는 것은 제한된 공간 해상도를 충족했습니다. 투과 전자 현미경 (TEM)에 의해 시각화 된 지질 단층을 사용하는 셉틴에 대한 이전의 연구는 고리, 번들 및 거즈23과 같은 몇 가지 흥미로운 셉틴 구조를 재구성 할 수있었습니다. 그러나, EM 기술은 형광 현미경과 달리 그들의 시간적 분해능에서 마찬가지로 제한된다. 셉틴 어셈블리의 다중 스케일 공정의 운동 파라미터를 더 잘 해결하기 위해, 우리는 멤브레인 지오메트리, 샘플 조건 및 이미징 양식을 신중하게 제어 할 수있는 지원되는 멤브레인 모방체로 전환했습니다.
여기에 설명된 프로토콜은 평면 또는 곡선형 SLB, 정제된 단백질 및 현미경 기술의 조합을 사용합니다. 정량적 형광 공초점 현미경 및 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)을 사용하여 다양한 막 곡률에 대한 벌크 단백질 결합을 측정하고 단일 분자의 결합 동역학을 측정했습니다. 또한,이 프로토콜은 주사 전자 현미경 (SEM)과 함께 사용하여 다른 막 곡률에서 단백질 울트라 구조를 검사하도록 조정되었습니다. 이러한 프로토콜의 초점은 셉틴 세포 골격에 있지만, 프로토콜은 독자가 흥미를 느끼는 모든 단백질의 곡률 감도를 조사하기 위해 쉽게 변형 될 수 있습니다. 추가적으로, 엔도사이토시스 또는 수포 밀매와 같은 분야에서 일하는 사람들은 다중 단백질 복합체의 곡률 의존성 어셈블리를 프로빙하는데 유용한 이들 기술을 발견할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>플랫 캡이 있는 0.2mL PCR 튜브, Natural</td><td>Watson</td><td>137-211C(EX)</td><td></td></tr><tr><td>0.5mL 저접착 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1405-2600</td><td></td></tr><tr><td>베타 메르캅토에탄올(BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4612-25G</td><td></td></tr><tr><td>PEGylated coverslips Thermo 제작용 커버 글라스</td><td> Scientific</td><td>152450</td><td>Richard-Allan Scientific SLIP-RITE 커버 글라스 24x50 #1.5</td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>계란 리스 로다민 PE</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>810146</td><td></td></tr><tr><td>EMS 글루타르알데히드 수성 25%, EM 등급</td><td>VWR</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>EMS 카코딜레이트 나트륨 버퍼</td><td>VWR</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-223EA</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-1KG</td><td></td></tr><tr><td>헥사메틸디실라잔</td><td>시그마-알드리치</td><td>440191</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>VWR</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>메틸 셀룰로오스 4000cp</td><td>시그마-알드리치</td><td>M052-100G</td><td></td></tr><tr><td>평면 이중층용 마이크로글라스 커버슬립</td><td>Matsunami</td><td>단종된</td><td>22x22</td></tr><tr><td>미니 원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>비기능성 실리카 마이크로스피어</td><td>Bangs Laboratories, Inc.</td><td>크기에 따라 다름 : SS0200 * -SS0500 *</td> <td>수성 현탁액의 실리카</td></tr><tr><td>광학 접착제</td><td>Norland Thorlabs</td><td>NOA 68</td><td>유리 또는 플라스틱 용 유연한 접착제</td></tr><tr><td>Osmium tetroxide</td><td>Millipore Sigma</td><td>20816-12-0</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>플라즈마 에칭</td><td>PE-25</td><td>전압 : 120V, 60Hz. 전류 : 15 AMPS</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>VWR</td><td>0395-1kg</td><td></td></tr><tr><td>원형 커버글라스, #1.5 12mm&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>64-0712</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator 욕조</td><td>Branson</td><td>1510R-MT</td><td>Bransonic 초음파 세척기. 50-60 Hz. 출력: 70W</td></tr><tr><td>대두 PI</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>840044</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>UV 램프</td><td>Spectroline</td><td>ENF-260C</td><td>115 볼트, 60 Hz, 0.20 AMPS</td></tr><tr><td>WhatmanGlass 마이크로파이버 여과지</td><td>VWR</td><td>28455-030</td><td>직경 42.5mm, 등급 GF/C</td></tr></tbody></table>

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 septin 어셈블리의 재구성

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

대부분의 세포는 근본적인 세포 과정을 수행하기 위해 모양을 감지하고 변경할 수 있습니다. 많은 진핵생물에서, 셉틴 세포골격은 사이토카인증, 편광된 성장 및 이동과 같은 형태 변화를 조정하는데 필수적인 성분이다. 셉틴은 다양한 고차 구조를 형성하기 위해 조립하는 필라멘트 형성 단백질이며, 많은 경우 원형질막의 다른 영역, 특히 미크론 규모의 양성 곡률 영역에서 발견됩니다. 생체 내에서 셉틴 조립 과정을 모니터링하는 것은 세포의 광 현미경 검사의 한계뿐만 아니라 막 및 세포 골격 요소와의 상호 작용의 복잡성으로 인해 방해를 받아 살아있는 시스템에서 셉틴 역학을 정량화하기가 어렵습니다. 다행스럽게도, 지난 십 년 동안 높은 공간 및 시간적 해상도에서 셉틴 어셈블리를 제어하는 메커니즘을 해부하기 위해 세포없는 시스템에서 셉틴 세포 골격을 재구성하는 데 상당한 진전이있었습니다. 셉틴 조립의 핵심 단계는 셉틴 헤테로올리고머 회합 및 막과의 해리, 필라멘트로의 중합, 필라멘트 간의 상호작용을 통한 고차 구조의 형성을 포함한다. 여기에서는 다른 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 방법을 제시합니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대. 이러한 방법은 조립의 여러 단계에서 셉틴의 생물 물리학 적 매개 변수를 결정하는 데 사용할 수 있습니다 : 멤브레인을 결합하는 단일 옥타머로서, 필라멘트로서, 필라멘트의 어셈블리로. 우리는 곡률 샘플링 및 우대 흡착의 측정과 함께 이러한 매개 변수를 사용하여 곡률 감지가 다양한 길이 및 시간 척도에서 어떻게 작동하는지 이해합니다.

각각의 SLB의 제조에 이어서, 셉틴 또는 관심있는 단백질은 원하는 지지체와 함께 인큐베이션되고 TIRFM, 공초점 현미경 또는 SEM을 통해 영상화될 수 있다. 여기에 나타낸 결과는 대장균17로부터 재조합적으로 발현되고 정제된 셉틴을 사용한다. 평면 SLB에서 TIRFM을 사용하면 필라멘트의 길이와 유연성을 결정하고 확산 계수를 측정하며 시간28,29에 따른 조립을 관찰 할 수 있습니다. 최고 품질의 측정을 수집하기 위해서는 먼저 이중층의 품질을 확인해야하며, 특히 처음으로 준비하거나 지질 조성을 변경할 때 특히 그렇습니다. TIRFM에 의한 이중층에서의 단백질 분포를 육안으로 검사하면 긁혔거나 기형화된 이중층의 영역을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 단백질 분포는 균질해야 하며(그림 3A), 이중층에 구멍...

무세포 재구성은 세포 골격 어셈블리를 이해하는 핵심 도구였으며, 지난 십 년 동안의 연구는 최소한의 시스템에서 셉틴 역학을 연구하는 접근법을 확립했습니다. 여기에 제시된 것은 서로 다른 막 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 보완적인 방법입니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대.

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

이 프로토콜은 막 결합 단백질을 연구하는 사람들을 안내하여 막 모양이 단백질 어셈블리 조직에서 어떻게 역할을 하는지 결정합니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 유형, 막 구성 및 막 형상에 대한 다양성입니다. 또한 지질 이중층이 관련 단백질의 특성을 어떻게 변화시킬 수 있는지에 대한 질문을 허용합니다.실험에 적합한 막을 식별하려면 지질 확산 속도, 관심 단백질의 이동성, 표면에 붙어 있는 파열되지 않은 리포좀 또는 융합된 리포좀이 있는지 여부를 포함할 수 있는 체크리스트를 설정하는 것이 좋습니다. 슬라이드의 플라즈마 청소를 시작하려면 플라즈마 클리너를 산소로 5 분 동안 퍼지하여 라인과 챔버에서 공기를 제거하십시오. 건식 커버 유리 슬라이드를 세라믹 크래들에 배열합니다.퍼지하는 동안 마이크로 커버 유리 슬라이드 위로 불활성 가스를 흘려 먼지와 미립자를 제거합니다. 커버 슬립이 챔버의 긴 가장자리와 평행이 되도록 크래들을 플라즈마 챔버 뒤쪽에 놓습니다. 최대 전력의 산소로 플라즈마 클리너를 15 분 동안 작동하십시오.챔버 준비를 위해 0.2 밀리리터 PCR 튜브의 젖빛 부분 바로 아래의 캡을 잘라냅니다. 튜브 내부를 피하면서 UV 활성화 접착제로 PCR 튜브의 가장자리를 칠합니다. PCR 튜브 접착제를 플라즈마 세척 커버슬립의 중앙에 부드럽게 놓은 다음 챔버를 장파장 자외선 아래에 5-7분 동안 놓아 접착제를 경화시킵니다.이중층을 형성하려면 시약을 웰에 첨가하십시오. 챔버를 좌우로 부드럽게 흔들어 SUV를 방해 한 다음 섭씨 37도에서 20 분 동안 배양합니다. 배양 후, 과도한 지질을 씻어내기 위해 피펫팅하여 150마이크로리터의 SLBB로 이중층을 6회 헹구고, 이중층을 150마이크로리터의 반응 완충액으로 6회 세척한 후 셉틴과 함께 배양합니다.마지막 세척 단계에서 반응 완충액을 제거하고 웰에 75 마이크로리터를 남깁니다. SSB에 희석 된 25 마이크로 리터의 셉틴을 추가하고 TIRF 현미경으로 이미지화하십시오. 먼저, 실리카 마이크로스피어가 들어 있는 병을 15초 동안 와동시킨 다음, 1분 동안 초음파 처리하고 15초 동안 다시 와동시켜 클러스터를 파괴합니다.저접착 미세 원심분리 튜브에 비드를 SLBB 및 10마이크로리터의 5밀리몰 SUV와 혼합합니다. 비드 지질 혼합물을 침전을 방지하기 위해 쉐이커에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 그 동안 페길화된 커버슬립을 해동하고 절단된 0.2밀리리터 PCR 튜브를 붙입니다.배양 후, 지정된 RCF에서 30초 동안 비드를 원심분리한다. 첫 번째 스핀 후 50 마이크로리터의 상청액을 제거한 다음 200 마이크로리터의 PRB를 추가하고 격렬한 피펫팅으로 혼합합니다. 다음 라운드를 위해 200 마이크로 리터의 PRB를 제거하고 두 번째 및 세 번째 스핀 후에 200 마이크로 리터를 추가하고 네 번째 스핀 후에 220 마이크로 리터의 PRB를 추가합니다.여러 비드 크기로 경쟁 분석을 수행하는 경우 각 비드 크기의 동일한 부피를 혼합하고 이 비드 혼합물 29마이크로리터를 721마이크로리터의 반응 완충액으로 희석하여 반응을 준비한 다음 75마이크로리터의 희석된 비드와 SSB에 희석된 단백질 25마이크로리터를 웰에 추가하고 혼합합니다. 정상 상태에서 셉틴을 측정하는 경우 혼합물을 실온에서 1시간 동안 배양한 다음 TIRF 근처 또는 컨포칼 현미경으로 이미지화합니다. 녹색으로 표시된 셉틴과 함께 배양 된 평면 SLB의 TIRF 현미경 사진은 균일 한 단백질 분포를 보였다.제대로 청소되지 않은 유리 커버슬립으로 만든 SLB는 낮은 셉틴 영역의 이중층에 구멍이나 틈이 있었습니다. 파열되지 않고 관형 리포좀은 오래된 리포좀을 사용하거나 세척이 엄격하지 않은 경우 표면에 축적될 수 있습니다. 로다민 PE를 사용하여 시각화된 지질 코팅된 마이크로스피어의 현미경 사진에서 부드러운 이중층 침착을 보여주었습니다.구형 지지체는 멤브레인에 의해 고르게 코팅되었으며 비드 클러스터가 거의 없었습니다. 과도한 지질의 불충분한 세척은 지질 덩어리에 의해 관찰되는 고르지 않은 막 코팅을 유발하고 부적절한 취급은 이중층에 틈을 일으켰습니다. 비드의 불충분한 혼합은 총 단백질 흡수를 측정하는 데 이상적이지 않은 응집을 일으켰습니다.여기에 제시된 지지된 지질 이중층을 사용하여 형광 수명 이미징 현미경, 막의 질량 세포분석 및 고속 원자력 현미경과 같은 다른 방법을 수행하여 다양한 단백질-단백질 또는 단백질-막 역학을 검사할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오에서는 전반사 형광 현미경을 사용하여 유리로 지지된 지질 이중층의 체외에서 셉틴 조직을 조사하는 절차를 보여줍니다.

Planar Supported Lipid Bilayer Assay: 생물학적 막 모방체에 대한 셉틴 어셈블리를 조사하기 위한 현미경 기반 체외 기술

이 비디오는 지질 이중층으로 코팅된 미세구에서 셉틴 단백질 어셈블리를 연구하는 기술을 설명합니다. 이 기술은 곡면에 있는 단백질의 곡률 의존적 어셈블리를 이해하는 데 도움이 됩니다.

Spherical Supported Lipid Bilayer Assay: 마이크로스피어에서 Septin 어셈블리를 관찰하는 기술

지질 세포막에 프로토 타입 전압 문이 칼륨 채널의 완전한 재구성에 대한 절차를 설명합니다. 재구성 채널은 생화학 적 분석, 전기 녹음, 리간​​드 스크리닝 및 전자 결정학 연구에 적합합니다. 이러한 방법은 다른 막 단백질의 구조 및 기능 연구에 일반적으로 응용 프로그램이있을 수 있습니다.

구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 Kv 값 채널의 재구성

유사분열 방추체의 조립 및 위치는 미세소관 역학, 운동 단백질 및 가교제에 의해 생성된 결합된 힘에 따라 달라집니다. 여기에서 우리는 구형 에멀젼 방울의 기하학적 구속이 기본 유사 분열 방추체의 상향식 재구성에 사용되는 최근에 개발 된 방법을 제시합니다.

구형 에멀젼 방울의 기본 유사 분열 스핀들의 재구성

여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

세포골격 단백질의 체외 재구성은 이러한 단백질의 기본 기능적 특성을 이해하는 데 필수적인 도구입니다. 본 논문은 세포 분열 및 이동에 중심적인 역할을 하는 재조합 셉틴 복합체의 품질을 정제하고 평가하는 프로토콜을 설명합니다.

무세포 재구성을 위한 재조합 셉틴 복합체의 정제 및 품질 관리

셉틴은 세포골격 단백질이다. 그들은 지질 막과 상호 작용하고 미크론 규모에서 막 곡률을 감지 할 수 있습니다. 우리는 막 변형, 곡률에 민감한 셉틴 결합 및 셉틴 필라멘트 초 구조를 분석하기위한 상향식 시험관 내 방법론을 설명합니다.

Bottom-Up In Vitro Methods to assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

이 프로토콜은 형광 현미경을 사용하여 재구성된 막 연결 세포골격 네트워크의 역학을 연구하기 위해 지지된 지질 이중층의 형성과 세포골격 필라멘트 및 운동 단백질의 추가를 설명합니다.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

Bacillus anthracis 는 치명적인 흡입 탄저의 병원성 물질이기 때문에 유전자와 단백질에 대한 연구가 엄격히 규제됩니다. 또 다른 접근법은 orthologous 유전자를 연구하는 것이다. B. cereus 의 B. anthracis ortholog (bc1531)에 대한 생물학적 물리 화학적 연구는 최소한의 실험 장비를 필요로하며 심각한 안전 문제가 없다고 설명합니다.

재조합 단백질 발현, 결정화 및 생물 물리학 연구<em&gt; 바실러스</em&gt; 보존 된 뉴클레오티드 피로 인산화 효소, BcMazG

이 방법에서는 여러 개의 마우스 조직에서 중간 필라멘트 (IF) 단백질을 신속하고 효율적으로 분리하기위한 생화학 적 절차를 제시합니다. 분리 된 IF는 질량 분광법 및 기타 생화학 적 분석법에 의한 번역 후 변형의 변화를 연구하는데 사용될 수 있습니다.

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생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

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