생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

이 프로토콜은 막 결합 단백질을 연구하는 사람들을 안내하여 막 모양이 단백질 어셈블리 조직에서 어떻게 역할을 하는지 결정합니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 유형, 막 구성 및 막 형상에 대한 다양성입니다. 또한 지질 이중층이 관련 단백질의 특성을 어떻게 변화시킬 수 있는지에 대한 질문을 허용합니다.

실험에 적합한 막을 식별하려면 지질 확산 속도, 관심 단백질의 이동성, 표면에 붙어 있는 파열되지 않은 리포좀 또는 융합된 리포좀이 있는지 여부를 포함할 수 있는 체크리스트를 설정하는 것이 좋습니다. 슬라이드의 플라즈마 청소를 시작하려면 플라즈마 클리너를 산소로 5 분 동안 퍼지하여 라인과 챔버에서 공기를 제거하십시오. 건식 커버 유리 슬라이드를 세라믹 크래들에 배열합니다.

퍼지하는 동안 마이크로 커버 유리 슬라이드 위로 불활성 가스를 흘려 먼지와 미립자를 제거합니다. 커버 슬립이 챔버의 긴 가장자리와 평행이 되도록 크래들을 플라즈마 챔버 뒤쪽에 놓습니다. 최대 전력의 산소로 플라즈마 클리너를 15 분 동안 작동하십시오.

챔버 준비를 위해 0.2 밀리리터 PCR 튜브의 젖빛 부분 바로 아래의 캡을 잘라냅니다. 튜브 내부를 피하면서 UV 활성화 접착제로 PCR 튜브의 가장자리를 칠합니다. PCR 튜브 접착제를 플라즈마 세척 커버슬립의 중앙에 부드럽게 놓은 다음 챔버를 장파장 자외선 아래에 5-7분 동안 놓아 접착제를 경화시킵니다.

이중층을 형성하려면 시약을 웰에 첨가하십시오. 챔버를 좌우로 부드럽게 흔들어 SUV를 방해 한 다음 섭씨 37도에서 20 분 동안 배양합니다. 배양 후, 과도한 지질을 씻어내기 위해 피펫팅하여 150마이크로리터의 SLBB로 이중층을 6회 헹구고, 이중층을 150마이크로리터의 반응 완충액으로 6회 세척한 후 셉틴과 함께 배양합니다.

마지막 세척 단계에서 반응 완충액을 제거하고 웰에 75 마이크로리터를 남깁니다. SSB에 희석 된 25 마이크로 리터의 셉틴을 추가하고 TIRF 현미경으로 이미지화하십시오. 먼저, 실리카 마이크로스피어가 들어 있는 병을 15초 동안 와동시킨 다음, 1분 동안 초음파 처리하고 15초 동안 다시 와동시켜 클러스터를 파괴합니다.

저접착 미세 원심분리 튜브에 비드를 SLBB 및 10마이크로리터의 5밀리몰 SUV와 혼합합니다. 비드 지질 혼합물을 침전을 방지하기 위해 쉐이커에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 그 동안 페길화된 커버슬립을 해동하고 절단된 0.2밀리리터 PCR 튜브를 붙입니다.

배양 후, 지정된 RCF에서 30초 동안 비드를 원심분리한다. 첫 번째 스핀 후 50 마이크로리터의 상청액을 제거한 다음 200 마이크로리터의 PRB를 추가하고 격렬한 피펫팅으로 혼합합니다. 다음 라운드를 위해 200 마이크로 리터의 PRB를 제거하고 두 번째 및 세 번째 스핀 후에 200 마이크로 리터를 추가하고 네 번째 스핀 후에 220 마이크로 리터의 PRB를 추가합니다.

여러 비드 크기로 경쟁 분석을 수행하는 경우 각 비드 크기의 동일한 부피를 혼합하고 이 비드 혼합물 29마이크로리터를 721마이크로리터의 반응 완충액으로 희석하여 반응을 준비한 다음 75마이크로리터의 희석된 비드와 SSB에 희석된 단백질 25마이크로리터를 웰에 추가하고 혼합합니다. 정상 상태에서 셉틴을 측정하는 경우 혼합물을 실온에서 1시간 동안 배양한 다음 TIRF 근처 또는 컨포칼 현미경으로 이미지화합니다. 녹색으로 표시된 셉틴과 함께 배양 된 평면 SLB의 TIRF 현미경 사진은 균일 한 단백질 분포를 보였다.

제대로 청소되지 않은 유리 커버슬립으로 만든 SLB는 낮은 셉틴 영역의 이중층에 구멍이나 틈이 있었습니다. 파열되지 않고 관형 리포좀은 오래된 리포좀을 사용하거나 세척이 엄격하지 않은 경우 표면에 축적될 수 있습니다. 로다민 PE를 사용하여 시각화된 지질 코팅된 마이크로스피어의 현미경 사진에서 부드러운 이중층 침착을 보여주었습니다.

구형 지지체는 멤브레인에 의해 고르게 코팅되었으며 비드 클러스터가 거의 없었습니다. 과도한 지질의 불충분한 세척은 지질 덩어리에 의해 관찰되는 고르지 않은 막 코팅을 유발하고 부적절한 취급은 이중층에 틈을 일으켰습니다. 비드의 불충분한 혼합은 총 단백질 흡수를 측정하는 데 이상적이지 않은 응집을 일으켰습니다.

여기에 제시된 지지된 지질 이중층을 사용하여 형광 수명 이미징 현미경, 막의 질량 세포분석 및 고속 원자력 현미경과 같은 다른 방법을 수행하여 다양한 단백질-단백질 또는 단백질-막 역학을 검사할 수 있습니다.