Name: 제브라피쉬의 뇌를 침범하는 교모세포종 세포의 미세소관 역학의 라이브 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 학습하세요 제브라피쉬 뇌 내 교모세포종 세포의 미세소관 역학을 고해상도 라이브 이미징으로 관찰하는 방법을. 이 기술은 암 침윤 메커니즘 연구와 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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우리는 P. Herbomel 박사 (프랑스 파스퇴르 연구소)와 그의 실험실, 특히 Valérie Briolat과 Emma Colucci-Guion에게 제브라 피쉬 라인과 미세 주입 플레이트 용 플라스틱 몰드를 제공하고 제브라 피쉬 실험 절차에 대한 귀중한 전문 지식을 제공해 주셔서 대단히 감사합니다. 우리는 UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, 프랑스 국립 연구 기관 France BioImaging의 지원을 받음) 및 ANR-10-INBS-04; 미래를위한 투자). 이 작업은 리그 콘트레 르 암(EL2017. LNCC), 국립 과학 센터, 파스퇴르 연구소, 그리고 Marguerite MICHEL 부인과 Porquet 씨의 관대 한 기부금으로.

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

단일 세포 분해능에서 종양 이종 이식편을 이미징하는 것은 GBM 생물학에 대한 이해를 향상시키는 데 없어서는 안될 도구가 될 것입니다. 마우스 PDX 모델에서의 라이브 이미징은 GBM이 어떻게 집합적으로 뇌 조직을 침범하는지에 대한 귀중한 발견으로 이어졌습니다(18). 그러나 현재까지 시공간 해상도는 GBM 침입을 제어하는 단백질의 역학을 밝힐만큼 충분히 높지 않습니다. 우리는 투명한 제브라 피쉬 유충에서 GBM 세포의 동종 생착을 고해상도 생체 내 영상과 결합함으로써 MT와 같은 세포 골격 단백질을 현장 GBM 침입 중 역학을 분석하기에 충분히 상세하게 분석 할 수 있다고 추론했습니다.
방법론의 중요한 단계는 GBM 세포의 준비와 미세 주입 절차에 있습니다. 건강에 해롭고 부적절하게 해리 된 세포는 서로 달라 붙거나 모세 혈관 경계에 달라 붙어 주사의 흐름을 차단합니다. 또한 세포는 주입 된 부피를 최소화하고 대량으로 ...

세포 운동성은 극성 축 설정 및 힘 생성 세포 골격 재 배열을 요구하는 고정 관념의 과정입니다. 액틴 중합 및 미오신과의 연관성은 세포 이동에 필요한 돌출 및 수축력의 주요 원인으로 인식됩니다1. 미세소관은 이동 중 세포 분극 및 방향 지속성의 주요 행위자로 간주됩니다2. 최근 몇 년 동안 MT는 3D3에서 세포 침습 중에 기계 압축력을 지원하기 위해 돌출부를 생성하고 안정화하는 것으로 나타났습니다. 보다 최근에, MT는 초점 유착 및 기계 민감성 이동에서 기계 변환에 직접 관여했습니다4. MT-plus 말단 역학을 특징짓는 동적 불안정성은 중합(성장) 및 해중합(수축)의 반복적인 단계로 이루어지며, 이는 과다한 미세소관 결합 단백질 및 RHO-GTPases 5,6,7에 의해 제어되는 것과 같은 세포 내 신호 전달 캐스케이드에 의해 제어됩니다. 세포 이동 및 침습에서 MT 네트워크의 역할로 인해 MT 역학 조사는 면역 세포 유도, 상처 치유 및 암 침습의 메커니즘을 더 잘 이해하기 위한 핵심 요소가 되었습니다.
암세포가 원발성 종양 코어를 탈출하여 조직에 퍼지고 이차 종양을 생성하는 능력은 50년 전에 선언된 암과의 전쟁에서 세계적인 성공을 막는 데 중요한 단계입니다 8,9. 가장 큰 장애물 중 하나는 암세포가 어떻게 적극적으로 조직을 침범하는지 이해하는 것입니다. 주요 침습 메커니즘은 비종양성 세포 이동을 지배하는 것과 동일한 원리에 의존합니다10. 그러나 암세포 이동 특이성이나타났고11, 이러한 유형의 이동에 대한 더 나은 특성화의 필요성을 촉발했습니다. 특히, 종양 미세 환경이 암 진행의 핵심 플레이어로 나타나기 때문에12, 관련 생리학적 맥락에서 암세포 침습을 관찰하고 분석하는 것은 암세포 전파 메커니즘을 밝히는 데 필수적입니다.
MT는 증식과 침습을 모두 유지하기 위해 암 진행의 핵심입니다. 현장 MT 역학의 정확한 분석은 두 공정 모두에서 MT 변경 에이전트(MTA)를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. MT 역학은 환경 변화에 따라 크게 달라집니다. 시험관 내에서 노코다졸과 같은 MT 불안정화제로 처리하면 세포가 3D 겔에 매립될 때 세포 돌출 형성을 방지하는 반면 2D 세포 이동에는 거의 영향을 미치지 않습니다13,14. 기술적으로 어렵지만 생체 내 이미징의 발전으로 암세포 침범 중 MT 역학의 생체 내 분석이 가능합니다. 예를 들어, 마우스의 피하 이종 이식 섬유육종 세포에서 MT를 관찰한 결과, 종양-관련 대식세포가 종양 세포(15)에서 MT 역학에 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다. 그러나 이러한 마우스 모델은 광범위한 수술 절차를 포함하며 고도로 침습성 뇌종양 인 GBM과 같이 접근하기 어려운 암에 대해서는 만족스럽지 않습니다.
15개월의 평균 생존 기간16이라는 암울한 기간에도 불구하고, GBM이 뇌 실질 내에서 전파되는 방식이나 뇌 조직에서 GBM 세포 침습을 유지하는 핵심 분자 요소에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 마우스 동종 이종 이식 (PDX) 모델의 개선과 두개골 창의 확립은 GBM 세포 침습 연구17,18에 대한 새로운 전망을 제공했습니다. 그러나 최적이 아닌 이미징 품질로 인해이 모델은 대부분 표면 이종 이식편의 종 방향 이미징을 허용했으며 지금까지 세포 골격 단백질의 세포 내 이미징을 연구하는 데 성공적으로 사용되지 않았습니다. 또한 설치류의 사용을 줄이고 더 낮은 척추 동물로 대체하라는 "3R"명령에 따라 대체 모델이 확립되었습니다.
제브라피쉬(Danio rerio) 유충에서 관찰된 원시면역을 이용하여, 어류 뇌에 GBM 세포의 동교토픽 주사가 19,20,21 개발되었다. 발달 중뇌에서 심실 부근으로의 주입은 대부분의 인간 GBM 병리생리학(21)을 요약하고, 인간에서와 동일한 바람직한 GBM 침습 패턴-혈관 공동-옵션이 관찰된다(22). 물고기 유충의 투명성 덕분에이 모델은 대부분의 GBM이 발생하는 것으로 생각되는 뇌실 주위 영역에서 뇌를 침범하는 GBM 세포의 시각화를 허용합니다23.
MT는 시험관 내 GBM 세포 침습24,25에 필수적이기 때문에 MT 역학의 더 나은 특성 분석과 세포 침윤 중 주요 조절자의 식별이 필요합니다. 그러나 현재까지 제브라 피쉬 동종 모델로 생성 된 데이터에는 침입 과정 동안 MT 역학의 세포 내 분석이 포함되지 않았습니다. 이 논문은 생체 내에서 MT 역학을 연구하고 뇌암 침범 동안 그 역할을 결정하는 프로토콜을 제공합니다. 안정적인 미세소관 표지에 따라 GBM 세포는 제브라피쉬 유충의 뇌에 3dpf로 미세 주입되고 뇌 조직에서 진행되는 동안 높은 시공간 해상도로 실시간으로 이미징됩니다. 형광 MT의 라이브 이미징을 통해 MT 플러스 엔드 역학의 정성 및 정량 분석이 가능합니다. 또한 이 모델을 통해 MTA가 MT 역학 및 GBM 세포의 침습적 특성에 미치는 영향을 실시간으로 평가할 수 있습니다. 한 번에 처리되는 많은 수의 유충과 결합 된이 비교적 비 침습적 인 프로토콜과 약물 적용의 용이성 (어류에서)은이 모델을 전임상 테스트의 자산으로 만듭니다.

<table><tbody><tr><td>교모세포종 세포 배양</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF00-01</td><td>시약</td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>시약</td></tr><tr><td>수정 독수리 매체</td><td>Eurobio</td><td>CM1MEM18-01</td><td>시약</td></tr><tr><td>페니실린&ndash; 스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>시약</td></tr><tr><td>U-87 MG</td><td>ECACC</td><td>89081402-1VL</td><td>세포</td></tr><tr><td><강한>레니티바이러스 생산</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD 생명과학</td><td></td><td>기기</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 소프트웨어 v8.0</td><td>BD 생명과학</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>HEK-293T</td><td>Merck</td><td>12022001</td><td>세포</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12259</td><td>시약</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12260</td><td>시약</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Optima XPN-80</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Cell passaging and staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Hoechst 34580</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63493</td><td>화학</td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>시약</td></tr><tr><td>Zebrafish 축산</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 실체 현미경 LEICA M165FC</td><td>LEICA</td><td>https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/</td> <td>기구</td></tr><tr><td>메틸렌 블루 수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4159</td><td>화학</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td>화학</td></tr><tr><td>물질 이송 피펫 미세 팁</td><td>Samco Scientific</td><td>232</td><td>장비</td></tr><tr><td>이송 피펫 대형 전구3mL</td><td>Samco Scientific</td><td>225</td><td>장비</td></tr><tr><td>트리카인(에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: A5040</td><td>화학</td></tr><tr><td>볼빅 소스</td><td>물 DUTSCHER DOMINIQUE SAS</td><td></td> 999556 <td>시약</td></tr><tr><td><강력한>이종 이식</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>TPP</td><td>92024</td><td>장비</td></tr>: <tr><td>붕규산 유리 모세관 (1.0 ODx0.58IDx150L mm)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>(#30-0017, GC100-15</td><td>장비</td></tr>: <tr><td>CellTram oil vario microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>5176000.025</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Microloading pipet tips (Microloader) 20&micro; L</td><td>에펜도르프</td><td>&nbsp; 5242956003</td><td>장비</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>NARISHIGE</td><td>https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html</td><td>장비</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma</td><td>M8410-100ml</td><td>장비</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Olympus</td><td>KL 2500 LCD</td><td>기기</td></tr><tr><td>범용 모세관 홀더</td><td>Eppendorf</td><td>5176190002</td><td>장비</td></tr><tr><td>수직 피펫 풀러</td><td>KOPF (Roucaire)</td> <td>모델 720</td><td>기기</td></tr> <tr><td>< 강력 > Intravital 이미징 < / 강력 ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>3.5cm 유리 바닥 비디오 이미징 접시</td><td>MatTek Life Sciences, MA, USA</td><td>P35G-1,5-14-C</td><td>장비</td></tr><tr><td>수집 소프트웨어 : NIS-Elements-AR 버전 5.21</td><td>Nikon</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>열 블록</td><td>Techne</td><td>DRI-BLOCK DB-2D</td><td>장비</td></tr><tr><td>현미경 헤드 Nikon Ti2E</td><td>Nikon</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>sCMOS 카메라 Prime 95B</td><td>광도 기기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sCMOS 카메라 Orca Flash 4</td><td>Hammatsu</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Ultrapure Low melting point agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit</td><td>Hammatsu</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Drug Treatment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404-2MG</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Image Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.5.1 software</td><td>Oxford 악기</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>ImarisFileConverter 9.5.1</td><td>옥스포드 악기</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr></tbody></table>

제브라피쉬의 뇌를 침범하는 교모세포종 세포의 미세소관 역학의 라이브 이미징

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

실제 인구에서 6개월에서 15개월 사이의 암울한 생존 기간을 가진 교모세포종(GBM)은 가장 치명적인 악성 뇌종양입니다. 치료 실패는 주로 GBM 세포의 침습성으로 인한 것이며, 이는 GBM 운동성 특성에 대한 더 나은 이해의 필요성을 말해줍니다. GBM 침입을 지원하는 분자 메커니즘을 조사하려면 침입 중 단백질 역학의 심층적 인 특성화를 가능하게하는 새로운 생리 학적 모델이 필요합니다. 이러한 관찰은 종양 침윤을 차단하고 환자 결과를 개선하기 위한 새로운 표적의 발견으로 가는 길을 열어줄 것입니다. 이 논문은 제브라 피쉬 뇌에서 GBM 세포의 동종 이종 이식이 어떻게 세포 내 생체 내 생체 내 이미징을 허용하는지보고합니다. 미세소관(MTs)에 초점을 맞추어 GBM 세포에서 MT 표지, 수정 후 3일(dpf) 제브라피쉬 유충의 투명한 뇌에 GBM 세포를 미세 주입하는 절차, 전파하는 이종 이식편에서 MT의 생체 내 이미징, GBM 침입 동안 역할을 평가하기 위한 MT 역학 변경 및 획득한 데이터 분석 절차를 설명합니다.

생체 내 GBM 침습 동안 MT가 수행하는 역할을 분석하기 위해 렌티바이러스 감염에 의한 GBM 세포에서 안정적인 MT 표지를 수행하는 주요 단계, 3개의 dpf 제브라피쉬 유충에서 GBM 세포의 동종 이종 이식, MT 역학의 고해상도 생체 내 이미징, MTA 치료 및 GBM 침습에 미치는 영향, MT 역학 및 생체 내 침습의 이미지 분석(그림 1)을 설명합니다. MT 역학은 성장 및 축소되는 MT를 따라 키모그래프를 구축하거나(그림 3C) 시간이 지남에 따라 개별 MT 에지를 수동으로 추적하여(그림 3D) 측정됩니다. 유충 배지에 투여된 약물 처리 및 MT 네트워크 조직에 대한 이의 가역적 효과의 예가 도 4에 주어진다. 저용량의 노코다졸(200nM)로...

우리는 척추 동물의 뇌 조직을 침범하는 교 모세포종 (GBM) 세포에서 미세 소관 역학의 실시간 이미징을 허용하는 기술을보고합니다. 형광 태그가 부착된 GBM 세포를 투명한 제브라피쉬 뇌에 동종 주입하는 것을 고해상도 생체 내 이미징과 결합하면 현장 암 침범 중에 세포 골격 역학을 측정할 수 있습니다.

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

이 방법은 제브라 피쉬의 뇌암 세포의 아토피 주사를 세포 내 생체 내 영상에 결합하여 뇌암 침범 중 미세 소관의 역할을 조사하는 데 전념합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 미세 소관 세포 골격이 획득되는 높은 공간적 시간 분해능에 있습니다. 생체 내 뇌암 침습 모델에 고유하며 심층적인 미세소관 역학 분석이 가능합니다.현장 뇌암 세포 침윤의 세포 내 영상화는 암 침습에 잠재적으로 관여하는 임의의 관심 단백질의 분석에 사용될 수 있다. 시작하려면 섭씨 37도에서 배양한 교모세포종 세포를 PBS로 세척합니다. 0.05% 트립신 EDTA 1밀리리터를 첨가하고 모든 세포가 완전히 분리될 때까지 세포 배양기에서 섭씨 37도에서 5-10분 동안 배양하여 세포를 분리합니다.50 밀리리터 원심분리 튜브에 5 밀리리터의 완전한 교 모세포종 세포 배지에 세포를 재현 탁시킵니다. 얼음처럼 차가운 PBS 45ml를 넣고 G를 134배로 5분간 원심분리한다. 상청액을 버리고 완전히 위아래로 피펫팅하여 얼음처럼 차가운 PBS 1밀리리터로 세포를 재현탁시킵니다.얼음처럼 차가운 PBS 49 밀리리터를 더 넣고 134 배 G에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 버리고 세포를 200 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS에 재현탁시킨다. 이식 절차 기간 동안 얼음 위에 보관하십시오.교모세포종 세포를 제브라피쉬 유충 중뇌에 미세 주입하려면 트리카인 1리터당 160mg이 보충된 E3 배지 6밀리리터로 미세 주입 캐스트 플레이트를 채웁니다. 12 개의 DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED 유충을 미세 주입 판으로 옮깁니다. 유충이 마취되고 접촉에 완전히 반응하지 않으면 측면의 참호에 정렬하고 머리를 위로 향하게하고 난황낭을 크기 00 페인트 브러시로 참호 벽에 밀어 넣습니다.그런 다음 마이크로로딩 팁을 사용하여 5마이크로리터의 교모세포종 세포를 마이크로 모세관에 로드하고 모세관을 범용 모세관 홀더에 삽입합니다. 마취된 유충을 함유하는 미세주입 플레이트를 실체 현미경 스테이지 상에 놓는다. 마이크로 매니퓰레이터 손잡이를 사용하여 마이크로 캐필러리의 끝을 미세 주입 플레이트의 경계에 놓습니다.그런 다음 메스로 부수어 대략 세포 직경 크기의 날카로운 진입 점을 만듭니다. 마이크로 인젝터에서 오일을 부드럽게 흐르게 하고 바늘 끝을 배지에 밀어 넣어 세포가 모세관 밖으로 흘러나오는지 확인합니다. 모세관 끝에 세포를 집중시켜 주입된 부피당 주입된 세포 수를 최대화하고 뇌 조직에 PBS가 채워지지 않도록 합니다.오일이 주입기에 수동으로 주입될 때 미세 모세관에서 나오는 세포를 주의 깊게 검사하십시오. 20-50개의 셀을 전달하기 위해 수동 노브에 필요한 회전 수를 경험적으로 정의합니다. 일반적으로 세포가 충분히 농축되면 한 번의 부드러운 회전으로 약 10 개의 세포를 배출 할 수 있습니다.모세 혈관의 끝 부분을 중간 대뇌 정맥 바로 위의 왼쪽 시신경에 접근하십시오. 피부 막이 부서 질 때까지 모세관을 유충에 부드럽게 누르십시오. 시신경의 적절한 위치에 도달하면 세포를 꺼냅니다.모세관의 끝을주의 깊게 관찰하여 동물 내부로 들어가는 세포의 흐름을 시각화하여 성공적인 주사를 보장합니다. 필요한만큼의 동물에 대해이 절차를 반복하십시오. 실험자가 주입하는 속도에 따라 모세관의 빠른 세포 응집으로 인해 10-20 마리의 유충마다 바늘을 교체해야 할 수 있습니다.이종 이식이 완료되면 미세 주입 플레이트에서 유충을 제거하고 미네랄 공급원 물 PTU와 메틸렌 블루 배지로 채워진 24 웰 플레이트에서 유충을 골라냅니다. 1%저융점 AH-KROH 용액을 준비합니다. 500 마이크로 리터의 끓인 1 % 저 융점 AH-KROH 용액을 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브에 옮기고 열 블록에서 섭씨 37도에서 식히십시오.AH-KROHS에 트리카인 리터당 160마이크로그램을 첨가하고 잘 섞는다. 1-4 개의 이종 이식 유충을 미네랄 공급원 물 PTU와 메틸렌 배지로 채워진 3.5 센티미터의 페트리 접시에 옮기고 트리카인 리터당 160 마이크로 그램을 보충합니다. 유충이 마취되고 접촉에 완전히 반응하지 않으면 미세한 팁 전달 피펫을 사용하여 AH-KROHS와 트리카인이 들어있는 튜브에 조심스럽게 옮깁니다.유충을 AH-KROHS와 부드럽게 섞는다. 큰 전구 이송 피펫을 사용하여 AH-KROHS에 혼합 된 유충을 유리 바닥의 3.5cm 비디오 이미징 접시 중앙에 놓고 실체 현미경으로 유충을 뒤쪽에 빠르게 배치합니다. 마이크로 로딩 팁을 사용하여 여분의 AH-KROHS를 제거하여 가능한 가장 얇은 AH-KROHS 층을 유지합니다.AH-KROHS가 고형화되면 2.5 밀리리터의 이미징 매체를 추가하십시오. 침입하는 교모세포종 세포의 미세소관 역학의 생체 내 라이브 이미징을 위해 AH-KROHS 내장 이종 이식 유충이 포함된 비디오 이미징 접시를 섭씨 32도로 설정된 온도의 도립 컨포칼 현미경의 환경 챔버에 놓습니다. 전동 XY 스테이지를 사용하여 10x 대물렌즈로 비디오 이미징 접시에서 유충을 찾습니다.탈출을 눌러 대물렌즈 포탑을 내리고 60x 오일 대물렌즈에 광유를 추가하고 탈출을 눌러 초기 초점 위치로 돌아갑니다. 561 나노 미터 레이저 소스, 20 % 레이저 출력 및 200 밀리 초의 시간 노출로 설정된 빨간색 채널에서 침입하는 교 모세포종 세포를 관찰하십시오. 그런 다음 미세소관 네트워크가 분산되어 있고 쉽게 구별할 수 있는 미세소관 필라멘트가 있는 세포를 선택합니다.Z 시리즈 설정을 지정합니다. 200 마이크로 미터 범위의 피에조 스테이지를 사용하여 10-30 마이크로 미터 깊이의 Z 스택으로 0.3 마이크로 미터의 Z 슬라이스 단계로 이동하는 세포의 돌출부에서 미생물 네트워크를 시각화하기에 충분한 미세 소관 네트워크의 상단 및 하단 위치를 선택하십시오. 빠른 광 표백을 방지하기 위해 획득 속도, Z 스택 깊이 및 형광 신호 간의 최적 균형을 허용하도록 타임랩스 획득 설정을 지정합니다.몇 분 동안 5-10초마다 미세소관의 이미지를 수집하고 5D 하이퍼 스택을 저장합니다. 미세소관 역학은 성장 및 축소하는 미세소관을 따라 키모그래프를 구축하고 시간이 지남에 따라 개별 미세소관 가장자리를 수동으로 추적하여 측정했습니다. 유충 배지에서 투여 된 약물 치료 및 미세 소관 네트워크 조직에 대한 가역적 효과는 200 나노 몰 용량의 노코다졸로 처리함으로써 평가되었습니다.이로 인해 미세 소관 네트워크가 점진적으로 수축되고 4 시간 후에 교 모세포종 세포 돌출이 사라졌습니다. 약물을 씻어 내면 교 모세포종 세포가 돌출부를 형성 할 수있는 능력이 회복되었습니다. 세포는 세척 후 12시간 후에 혈관구조를 따라 이동을 재개하여 200나노몰 용량의 노코다졸이 미세소관 네트워크를 파괴하고 생체 내 교모세포종 세포 침윤을 신속하게 차단하기에 충분하다는 것을 나타냅니다.전 세계 교모세포종 세포 침습에 대한 동일한 치료법에 대한 3일 간의 분석에서 노코다졸은 대조군에 비해 물고기의 일반적인 건강에 영향을 미치지 않으면서 생체 내에서 장기 교모세포종 세포 침습을 중단시키는 것으로 나타났습니다. 건강한 3 일 후 수정 유충으로 시작하여 세포를 모세 혈관에 집중시키고, 뇌에 주입되는 양을 최소화하고, 독특한 종양 덩어리를 형성하고, 뇌실에 주사를 피하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

초기 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. 우리는 여기서 세포막 타겟 그린 형광 단백질로 전체 zebrafish의 배아에서 세포의 단일 세포 또는 작은 클러스터를 라벨에 대한 기술을 설명합니다.

Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

말초 신경계 (PNS)가 부상 후 중요한 수리 할 수​​ 있지만, 거의가이 현상을 제어하는​​ 세포 및 분자 메커니즘에 대해 잘 알려져 있습니다. 라이브 형질 전환 제브라 피쉬와 재현 신경 절개 분석하여, 우리는 신경 변성과 재생 중에 동적 아교 세포의 행동을 공부할 수 있습니다.

모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

암 세포의 이식은 암 기전과 치료 반응의 확인에 중요한 도구입니다. 현재의 기술은 면역 기능이없는 동물에 달려 있습니다. 여기, 우리는 종양 세포 행동과 생체 내 약물 반응의 장기 분석을위한 면역 능력이있는 배아에 zebrafish 종양 세포를 이식하는 방법을 설명합니다.

종양 세포의 행동과 약물 반응에 대한 장기 연구를 위해 면역 능력이있는 숙주 내로 Zebrafish Pediatric Brain 종양을 이식

여기, 우리가 배아 개발, 운동, 시각화 세포 전기 전압 기자 제 브라 라인을 만드는 과정을 보여 그리고 물고기 종양 vivo에서세포.

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

여기, 양적 측정 마이그레이션 및 시간이 지남에 조건 하에서 여러 치료 세포종 뇌 종양 줄기 세포의 내 습을 라이브 세포 이미징 기술을 설명 합니다.

라이브 셀 이미징 분석 실험 연구 세포종 뇌 종양 줄기 세포 이동과 내 습을

생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

여기서 우리는 생체 내 최대 애벌레와 청소년 단계에서 제브라피시 배아 뇌를 이미지화하는 방법을 제시합니다. 전기 생리학적 접근법에서 채택된 이 미세침습 절차는 성숙한 뉴런의 세포 및 세포 세포 이하 세부 사항에 대한 액세스를 제공하며 뇌 기능 및 약물 개입을 특성화하기 위한 광유전학 및 신경 약리학과 결합될 수 있습니다.

두개골과 피부 제거에 의해 깨어 얼룩말 물고기 애벌레와 청소년에서 완전히 활성 뇌 조직의 생체 내 이미징

여기에 제시된 것은 3차원 형광 현미경을 사용한 유충 제브라피쉬의 생체 내 전뇌 이미징을 위한 프로토콜입니다. 실험 절차에는 샘플 준비, 이미지 획득 및 시각화가 포함됩니다.

생체 내 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 유충의 전뇌 이미징

우리는 빠른 스캐닝 컨포칼 현미경을 활용하여 개발 중인 제브라피시 시신경 구조에서 미세아교세포의 실시간 이미징을 수행하는 방법을 시연하여 생체 내에서 이러한 세포의 역학을 분석할 수 있습니다.

Zebrafish 배아에서 Microglia Dynamics의 실시간 이미징 및 특성 분석

학습하세요 제브라피쉬 뇌 내 교모세포종 세포의 미세소관 역학을 고해상도 라이브 이미징으로 관찰하는 방법을. 이 기술은 암 침윤 메커니즘 연구와 치료 전략 개발에 활용됩니다.

제브라피쉬의 뇌를 침범하는 교모세포종 세포의 미세소관 역학의 라이브 이미징

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