필 블롯 기법: 다층 또는 농축된 생물학적 시료에서 단층을 분리하는 Cryo-EM 시료 전처리 방법

필 블롯 기술을 사용하면 다층 및 농축된 생물학적 Cryo-EM 샘플을 단일 레이어로 분리하여 두께를 줄이고 농도를 높이며 이미지 처리를 용이하게 할 수 있습니다. 그리드 준비 전에 시료 농도를 높일 수 있으며, 필 블롯을 조정하여 매우 효율적인 데이터 수집을 위해 단층 표본을 조밀하게 분포시킬 수 있습니다. 시작하려면 20-25 마이크로 미터 기공 크기의 여과지 두 장을 쌓고 종이가 위를 향하도록 긴 파라핀 필름을 옆에 놓습니다.

두 개의 추가 여과지 위에 서브미크론 여과지 한 장을 놓습니다. 구부러진 다리가 위를 향하고 직선 다리가 아래를 향하도록 모세관 방지 집게를 놓고 매끄럽거나 반짝이는 면이 위로 향하도록 600메쉬 그리드를 선택합니다. 깨끗한 그리드가 다른 품목과 접촉하지 않도록 집게를 페트리 접시 또는 기타 융기된 표면에 놓습니다.

파라핀 필름에서 용지를 제거하고 측면을 당겨 작은 테두리를 만듭니다. 피펫 두 개의 150 마이크로 리터 방울 그래서 파라핀 필름의 한쪽 짧은 면으로부터 약 1-2 센티미터에서 4 % 트레할로스 용액. 두 방울은 약 1cm 떨어져 있어야합니다.

그런 다음 별도의 벤치 또는 바닥에 액체 질소를 작은 폴리스티렌 폼 용기에 붓고 작은 cryo-EM 그리드 용기를 액체 질소에 놓습니다. 폴리스티렌 폼 용기를 보푸라기가없는 물티슈로 덮으십시오. 운모에서 탄소 필름을 띄우려면 Dumont 5 집게를 사용하고 트레할로스 용액 방울 중 하나에서 운모의 한쪽을 아래쪽으로 약간 비스듬히 만집니다.

운모를 아래쪽으로 움직여 물의 장력이 탄소 필름에서 천천히 들어 올려지도록합니다. 탄소 필름이 물방울 표면에 떠 있으면 운모를 방출하십시오. 균열 형태의 손상이있는 탄소를 사용하지 않도록 탄소 필름을 육안으로 검사하십시오.

모세관 방지 집게가 잡고 있는 그리드를 20-30도 각도로 인접한 위치의 트레할로스 드롭에 삽입한 다음 그리드를 탄소 필름 아래 중앙에 놓습니다. 탄소 필름을 집어 들고 그리드를 같은 방향으로 유지하고 방울의 표면 장력을 깨지 않고 그리드를 트레할로스 두 번째 방울 표면으로 천천히 내립니다. 이렇게 하면 그리드 가장자리를 거친 쪽으로 감았을 수 있는 불필요한 탄소 필름이 제거됩니다.

모세관 방지 집게를 회전시켜 그리드의 탄소 면이 아래를 향하도록 페트리 접시에 놓습니다. 1.3 마이크로리터의 샘플을 그리드 상단의 약간의 트레할로스 메니스커스에 피펫팅합니다. 그런 다음 용액을 약 8-10회 피펫팅하여 트레할로스와 샘플을 그리드의 양쪽에 혼합하고 분배합니다.

하나 이상의 트레할로스 용액을 파라핀 필름 상에 떨어뜨리고 1분 동안 그리드 상에서 샘플 트레할로스 용액을 인큐베이션한다. 탄소 필름이 위를 향하도록 그리드를 원래 위치로 다시 회전시키고 모세관 방지 집게를 사용하여 그리드를 서브미크론 여과지에 누릅니다. 용액이 여과지에 흡수되고 탄소 필름이 평평하게 놓이면 그리드를 들어 올려 1.7 마이크로 리터의 트레할로스 용액 방울에 수직으로 이동하기 전에 3 초 동안 기다리십시오.

이러한 단계는 샘플에 따라 1-3회 이상 반복할 수 있습니다. 두 개의 여과지에 그리드를 닦아낸 다음 그리드를 필터 페이퍼에서 들어 올립니다. 습도 및 시료 버퍼에 따라 약 13초 후에 그리드를 작은 스티로폼 용기의 액체 질소에 넣고 Cryo-EM 그리드 용기에 넣거나 Cryo-EM 스크리닝 또는 데이터 수집을 위해 직접 옮깁니다.

필 블롯 방법을 거친 인간 류코트리엔 C4 합성 효소의 2D 결정 샘플이 여기에 표시됩니다. 화살표의 왼쪽 영역은 탄소 필름과 그리드 막대 사이의 접촉 영역에서 단층 2D 결정으로 크게 축소되어 박리 블롯 된 다음 이동되었습니다. 화살표 오른쪽 영역은 필 블롯의 영향을 받지 않았습니다.

이미지의 아래쪽 절반은 필 블롯의 적용으로 인해 발생하는 크고 대부분 단층 인 지질 이중층이있는 영역을 나타냅니다. 상반부는 그리드 바와 탄소 필름 사이의 접촉 영역에 있지 않았고, 따라서 두 개의 인지질 이중층을 갖는 완전한 리포좀을 함유하였다. 400 메쉬 그리드의 그리드 사각형은 그리드 막대의 풋프린트와 결과 필 블롯된 영역뿐만 아니라 그리드 바와 접촉하지 않았거나 더 적은 필 블롯 반복을 거친 영역을 보여줍니다.

이들 이미지는 매우 얇은 탄소 필름을 사용하여 서브마이크론 여과지에 다시 주입하여 제조된 EM 그리드의 블롯팅을 보여주었다. 이미지는 멤브레인과의 초기 접촉시 단일 프레임, 접촉 후 1, 000 밀리 초 및 접촉 후 2, 000 밀리 초입니다. 화살표는 모세관 압력이 탄소 막을 파열시킨 격자 사각형을 나타냅니다.

탄소 필름의 파손을 방지하고 서브미크론 여과지와 1.7마이크로리터 트레할로스 드롭을 결합하여 흡입한 다음 층을 분리하는 것이 핵심 단계입니다. 필 블롯된 샘플은 고해상도 Cryo-EM 데이터 수집에 사용되며, 구조 결정을 위한 이미지 처리가 이루어집니다. 필 블롯을 사용하면 이전에는 Cryo-EM에 비해 너무 두꺼웠던 단층 단백질 2D 결정을 구조화할 수 있습니다.

또한 다양한 샘플을 탄소 필름의 단일 층으로 농축 할 수 있습니다.