사이토네메 분석을 위한 배아 마우스 조직의 고정

여기서, 배아의 고정, 면역 염색 및 절편화를 위해 최적화된 단계별 프로토콜이 제공되어 마우스 조직에서 사이토네임(cytonemes)이라고 불리는 특수한 신호전달 필로포디아(filopodia)를 검출한다.

따라서이 프로토콜을 사용하여 표준 광 현미경으로 전체 배아에 걸쳐 고정 된 마우스 조직의 시토네임을 시각화 할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 형광 태깅 단백질을 사용하는 유전적으로 조작된 마우스 모델에 의존하기보다는 사이토네임을 따라 이동하는 내인성 신호전달 단백질을 조사할 수 있다. 이 프로토콜을 시도하는 동안, 사이토네임의 최적 보존을 위해 조직 절편을 부드럽게 처리하는 것이 중요하다.

이 절차를 시연하는 것은 우리 그룹의 수석 연구원 인 Miriam Dillard와 St.Jude 대학원생 인 Christina Daly가 될 것입니다. 시작하려면 해부 가위와 포셉을 사용하여 복강을 절개합니다. E 9.5 배아가 들어있는 자궁을 절제하십시오.

배아를 완전한 DMEM 성장 배지에서 해부한다. 포셉을 사용하여 노른자 SAC, 태반 및 주변 막을 제거하십시오. 분리된 배아를 HBSS로 헹구어 잔류 양수 조직 및 혈액을 제거합니다.

다음으로, 4 % 파라포름 알데히드의 작동 농도에 대해 HBSS에 파라포름 알데히드를 첨가하여 고정제를 준비하십시오. 이 용액 한 밀리리터를 24웰 플레이트의 각 웰에 첨가하십시오. 배아를 개별 우물에 넣으십시오.

로커에서 부드러운 교반으로 배아를 45 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후, 고정제를 제거하고 배아를 세 번 세척하고, 칼슘, 마그네슘 및 0.1%트리톤을 첨가한 PBS로 30분 동안 세척한다. 그런 다음 배아를 블로킹 용액에서 두 번 부드럽게 교반하여 각각 한 시간 동안 배양하십시오.

두 번째 배양 후, 신선한 차단 용액을 사용하여 배아를 헹구십시오. 그 동안, 항체를 보충된 PBS에 희석하여 일차 항체 용액을 준비한다. 헹굼이 완료된 후, 블로킹 용액을 제거하고 각 웰에 일차 항체 용액 한 밀리리터를 첨가하십시오.

플레이트를 섭씨 네 도에서 사흘 동안 부드럽게 회전시켜 배양하십시오. 일차 항체 인큐베이션에 이어서, 배아를 보충된 PBS로 다섯 번 20 RPM의 로커 상에서 한 시간 동안 세척한다. 그런 다음 각 웰에 한 밀리리터의 보조 항체 용액을 첨가하십시오.

사흘 동안 어둠 속에서 섭씨 네 도에서 부드럽게 흔들면서 접시를 배양하십시오. 이차 항체 용액을 제거하고 배아 삼배를 보충된 PBS에서 30분 동안 세척한다. PBS 중의 저융점 아가로오스 4중량% 용액을 칼슘 및 마그네슘으로 제조하였다.

동시에 섭씨 55 도의 구슬 욕조에 12 웰 플레이트를 놓고 각 웰에 3 밀리리터의 아가로스를 넣으십시오. 다음으로, 플레이트를 벤치 상단에 놓고 구멍이 뚫린 숟가락을 사용하여 배아를 개별 웰로 옮깁니다. 피펫 팁을 사용하여 배아가 용액 내에 집중되도록 배아를 부드럽게 삽입하고 방향을 정하십시오.

배아가 배아 방향이 잡히면 플레이트를 섭씨 영하 20도에 10 분 동안 놓고 응고시킵니다. 그런 다음 메스를 사용하여 우물에서 전체 아가로스 블록을 제거하십시오. 배아 주위에 직사각형 블록을 자르고 양쪽에 약 0.3 센티미터의 블록을 남겨 둡니다.

배아의 꼬리 끝을 따라 블록의 여분의 길이를 남겨 두십시오. 비브라톰에 배아를 장착하려면 먼저 시편 홀더에 테이프 스트립을 바르십시오. 배아를 블록의 윗부분에있는 직립 위치에 배치하고 아가로스 블록을 테이프에 슈퍼 접착제로 붙여서 블레이드가 전방에서 후부 시퀀스에 축 방향 섹션을 생성하도록하십시오.

다음으로, 비브라톰 챔버를 차가운 HBSS로 채워 샘플을 완전히 담근 다음 챔버를 얼음으로 둘러 쌉니다. vibratome에 매개 변수를 설정하고 배아의 직렬 축 단면화를 수행하십시오. 포셉을 사용하여 개별 섹션을 HBSS로 채워진 별도의 접시로 옮깁니다.

조직 손상과 사이토네임의 파괴를 피하기 위해 아가로오스만을 잡기 위해 포셉을 사용하는 것을 잊지 마십시오. F-액틴 염색을 수행하기 위해, HBSS를 제거하고, 절편을 액틴레드 및 DAPI 용액이 보충된 PBS 중의 40분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 절편을 보충된 PBS에서 20분 동안 세 번 세척한다.

소수성 마커 펜을 사용하여 충전된 현미경 슬라이드의 가장자리 주위에 장벽을 그리고 채우기 영역에 소량의 HBSS를 추가합니다. 그런 다음 포셉을 사용하여 섹션을 슬라이드로 전송합니다. 포셉을 사용하여 과도한 아가로스를 제거하십시오.

모든 섹션이 슬라이드로 옮겨지면 피펫팅하고 흡수성 타월렛의 모서리를 사용하여 과도한 액체를 제거하십시오. 그런 다음 슬라이드에 장착 매체 몇 방울을 추가합니다. 덮개 슬립을 슬라이드에 부드럽게 올려 장착합니다.

분석을 위해, 공초점 또는 임의의 고해상도 현미경 상에서 유전자형당 최소 세 개의 배아에 대한 조직 절편의 이미징을 수행한다. 이 프로토콜을 사용하여 준비된 올바른 지향 섹션이 여기에 나와 있습니다. 비브라톰 절편화와 비교하여, 조직의 냉동 절편은 세포 확장을 보존하지 않았다.

몇 개의 GFP 양성 막 단편이 노토코드와 신경관의 세포 사이에서, 그리고 cryostat 절편에서 인접한 신경관 세포 사이에서 검출되었다. 그러나, 신경관을 둘러싸고 있는 중간엽 세포에서의 세포 확장의 F-액틴 염색은 냉동 절편에서 손상되었다. Vibratome 절편은 전체 배아 및 개별 조직 절편의 중단을 최소화했습니다.

최적으로 처리된 절편은 인접하게 국소화된 바닥판 신경 상피 세포와 중간엽 세포 사이의 ctyonemes의 검출을 허용했다. 접히거나 구부러진 부분은 신경관의 notochord와 복부 바닥 판 사이의 큰 분리에 의해 분명했습니다. 및 상피 세포 사이로 이동하는 세포막 확장의 손실을 포함한다.

F-액틴 및 DAPI-염색된 절편은 신경관 및 노토코드를 둘러싸고 있는 중간엽 세포 및 ctyonemes의 일관된 간격을 가졌다. 절편에 대한 사소한 왜곡으로 인해 액틴 기반 확장의 단편화와 세포 사이에 큰 틈이 형성되어 섬세한 처리의 필요성을 강조 할 수 있습니다. 배아 절편 후, 조직 절편의 굽힘이나 접힘을 최소화하는 것이 필수적입니다.

사이토 네임의 침입을 방지하기 위해. 이 기술을 사용하여 모르포겐과 같은 신호 분자가 조직에 어떻게 확산되는지 직접 시각화 할 수 있습니다. 이것은 우리에게 조직과 장기가 어떻게 패턴화되는지에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.