생체 내 마우스 해마에서 미세아교세포의 만성 이광자 이미징
July 6th, 2022
이 논문은 정밀하게 제어된 수술과 이광자 현미경을 사용하여 마우스 해마 CA1에서 휴식 미세아교세포를 만성적으로 생체 내에서 관찰하는 방법을 설명합니다.
해마에서 미세 아교 세포의 역할은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 이 프로토콜은 미세아교세포가 뉴런과 접촉하고 조절하는 방법을 직접 이미지화할 수 있습니다. 해마에서 쉬고 있는 미세아교세포와 뉴런의 생체 내 이미징은 매우 어려웠습니다.
이 방법으로이 문제를 해결할 수 있습니다. 관찰 창을 이식하려면 피부 펀치를 사용하여 두개골에 3 밀리미터 원형 홈을 만들어 홈이 이전에 표시된 영역과 정렬되도록합니다. 피부 펀치가 밑에 있는 경막에 닿기 전에 두개골의 가장 안쪽 층에 도달하면 30게이지 바늘을 사용하여 중앙 뼈 섬을 부드럽게 들어 올립니다.
그런 다음 경막 피커를 사용하여 경막을 조심스럽게 제거합니다. 표면에서 pia, pial 혈관 및 피질 조직을 흡인합니다. 노출된 조직 표면의 깊이를 전체 두개골 창에 걸쳐 균일하게 유지하고 외부 캡슐의 섬유가 노출될 때까지 점차적으로 흡인을 깊게 합니다.
흡입 팁을 두개골 창의 외측 끝에서 외측 심실 근처의 외부 캡슐에 배치한 후 꼬리 내측에서 외측 방향으로 달리는 외부 캡슐의 표면층을 제거합니다. 그런 다음 내측 방향으로 실행되는 내부 레이어를 제거합니다. 폐포 표면의 전체 노출과 등쪽 해마 교합을 확인하여 전체 외부 캡슐의 제거를 확인하십시오.
출혈이 완전히 멈췄는지 확인한 후 두개골 표면의 높이까지 멸균 식염수로 구멍을 채 웁니다. 그런 다음 유리 바닥이 폐포를 가볍게 누르고 밑에 있는 CA1을 부분적으로 평평하게 할 때까지 튜브 측면에서 넘쳐흐르는 과도한 물을 흡입하면서 유리 바닥 금속 튜브를 구멍에 수직으로 삽입합니다. 치과용 레진 시멘트를 사용하여 삽입된 튜브의 벽을 주변 두개골에 고정합니다.
마우스를 이광자 현미경의 대물 렌즈 아래 헤드 고정 장치에 놓고 전동 XY 스캐닝 s에 놓습니다.tage. 그런 다음 기포를 생성하지 않고 유리 바닥과 대물 렌즈 사이의 공간을 물로 채웁니다. 펄스 레이저에 의한 지속적인 조명 하에서 뇌 실질에서 방출되는 형광과 금속 튜브 가장자리에서 반사된 빛의 안내로 초점을 CA1로 조정합니다.
유리 바닥이 이미징 평면과 평행이 되도록 헤드 고정 장치를 기울여 마우스 헤드의 각도를 조정합니다. 그런 다음 대물렌즈의 보정환을 조정하여 CA1의 대상 구조 깊이에서 가장 높은 해상도를 얻습니다. 다음으로, 유리 바닥으로부터 500 마이크로미터 깊이에 있는 치아이랑 또는 DG의 분자층에 있는 형광 세포가 전체 시야에서 이미지화되어 있는지 확인한다.
수술이 성공한 경우에만 DG 신호를 즉시 감지할 수 있습니다. 몇 주 동안 개별 하우징에서 수술 후 마우스를 들어 올립니다. 마취된 마우스를 이광자 현미경으로 설정합니다.
해마의 이미징을 수행하십시오. 수술 후 부종 감소 후 촬영한 영상의 품질과 강도가 수술 당일 촬영한 영상과 비슷하거나 비슷한지 확인합니다. 미세아교세포가 파급된 형태를 회복했는지 확인하십시오.
그런 다음 CA1의 관심 레이어에 대한 생체 내 이미징을 수행합니다. 수술 직후 포획된 CX3CR1-GFP 마우스의 미세아교세포는 눈에 띄는 활성화를 나타내지 않았습니다. 부종 유도 없이 성공적인 수술 후, 이광자 이미징 깊이는 전체 CA1 층을 초과하고 수술 표면에서 500마이크로미터에 도달했습니다.
수술 후 3주 이상의 만성기의 미세아교세포는 부종과 염증 감소로 인해 더 높은 형광 강도와 분해능 및 더 균질한 분포를 나타냈습니다. 모든 층의 미세아교세포는 이미 파급된 형태를 복원하고 움직이지 않는 세포체와 고도의 모달 과정을 나타냈습니다. 전체 CA1에 대한 고해상도 이미지는 몇 달 동안 제공되었습니다.
형광 미세아교세포의 신호는 해마층을 식별하는 데 도움이 됩니다. alveus의 Microglia는 축삭 관을 따라 뻗어있는 길쭉한 세포체와 과정을 가졌습니다. 피라미드 지층의 미세 아교 세포는 공정의 밀도가 낮기 때문에 구별 될 수 있습니다.
CA1과 DG 사이의 경계는 경계를 따라 흐르는 두꺼운 혈관에 의해 인식될 수 있으며, 이는 설포로다민 101로 혈관을 표시함으로써 더 잘 인식되었습니다. 적용 예로, GFP 양성 미세아교세포와 tdTomato 표지된 피라미드 뉴런을 동시에 이미지화했습니다. 뉴런 라벨링은 CA1의 정확한 층 구조를 이해하는 데 도움이 되었습니다.
가장 중요한 점은 수술 손상을 줄이는 것입니다. 흡인에 의한 조직 손상을 피하십시오. 유리 바닥을 삽입할 때 부드러운 압력을 가하고 치과용 시멘트가 뇌 표면에 닿지 않도록 합니다.
이 접근법은 해마에서 미세아교세포의 역할을 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 예를 들어, 미세아교세포가 뉴런과 어떻게 상호 작용하는지, 뉴런이 학습에 어떻게 관여하는지, 뇌 질환을 어떻게 제어하는지.
개요
이 연구는 수술적 접근과 이광 현미경을 활용하여 마우스 해마 CA1 영역의 휴식 상태 소교세포에 대한 만성 생체 내 이미징 방법을 제시합니다. 이는 소교세포가 뉴런과 어떻게 상호작용하며 뇌 과정에서 어떤 역할을 하는지를 조사합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 신경영상학
배경
- 해마에서 소교세포의 기능은 완전히 이해되지 않았습니다.
- 휴식 상태의 소교세포와 뉴런의 생체 내 이미징은 중요한 도전 과제를 제기했습니다.
- 이 프로토콜은 소교세포 이미징의 확인된 격차를 메우는 것을 목표로 합니다.
연구 목적
- 소교세포 행동과 뉴런과의 상호작용을 관찰하는 방법을 개발합니다.
- 관찰 과정에서 수술적 손상을 줄입니다.
- 학습과 뇌 질환에서의 소교세포 역할에 대한 통찰력을 제공합니다.
사용된 방법
- 이광 현미경이 이미징에 사용되었습니다.
- 만성 생체 내 이미징은 마우스 해마 CA1 영역에 중점을 두었습니다.
- 이 방법은 조직 손상을 최소화하기 위한 정밀한 수술 기술을 포함했습니다.
- 광학 접근과 안정성을 위해 유리 바닥 금속 튜브가 사용되었습니다.
- 수술 후 마우스의 회복 상태를 모니터링하고 몇 주 후에 이미징을 수행했습니다.
주요 결과
- 수술 후 소교세포는 분지 형태와 과정을 회복했습니다.
- 향상된 이미징 해상도를 통해 소교세포 행동을 상세하게 관찰할 수 있었습니다.
- 해마 층을 통해 다양한 소교세포 형태가 확인되었습니다.
- GFP 표지된 소교세포와 tdTomato 표지된 피라미드 뉴런의 이중 이미징을 통해 뉴런 상호작용을 조사했습니다.
결론
- 이 방법은 생체 내 장기간 소교세포 동태를 관찰할 수 있게 합니다.
- 연구 결과는 학습 및 질병 맥락에서 소교세포-뉴런 상호작용에 대한 이해를 뒷받침합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Chronic in vivo two-photon imaging of microglia in the mouse hippocampus enables direct, longitudinal observation of microglia-neuron interactions in a disease-relevant brain region. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for neuroinflammation and neurodegeneration portfolios. High-resolution, minimally invasive imaging across hippocampal layers advances predictive confidence in early discovery and translational neuroscience programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of microglial process dynamics and neuron contact in situ.
- Supports functional target validation by correlating microglial morphology with neuronal states.
- Facilitates mechanistic de-risking for microglia-targeted therapeutic hypotheses.
- Provides spatial and temporal resolution to clarify pathway involvement in hippocampal circuits.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated in vivo platform for quantifying microglial responses to candidate compounds.
- Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization.
- Enables screening of interventions affecting microglia-neuron interactions in a native tissue context.
- Supports scalability for longitudinal studies and cross-comparison of experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for neurodegeneration and neuroinflammation research.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking microglial behavior over time.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on in vivo functional readouts.
- Provides translational biomarker insights by correlating imaging phenotypes with disease progression.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging method integrates from early discovery through preclinical research, bridging mechanistic studies and translational validation in neurobiology pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial roles in synaptic remodeling and neuronal regulation.
- Screening: Provides quantitative, reproducible imaging data for compound evaluation in live tissue.
- Analytics: Enables measurement of microglial morphology, process motility, and cell-cell interactions across hippocampal layers.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease models and longitudinal biomarker development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable in vivo imaging platform adaptable to multiple neurobiological targets and interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroimmune target validation.
- Operational Value: Standardizes chronic imaging workflows and enhances reproducibility across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-content, longitudinal data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroinflammation and neurodegeneration programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, two-photon microscopy, and animal handling.
- Demands access to advanced imaging infrastructure and fluorescence labeling capabilities.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of surgical and imaging protocols.
- Adaptation to other brain regions or disease models may require protocol optimization.
- Transient postoperative inflammation limits immediate imaging and requires recovery periods for optimal data quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
Implantation of the Observation Window
2:34
Two‐Photon Microscopy Immediately After Surgery for Quality Check
3:55
In Vivo Chronic Two‐Photon Imaging of Microglia Using CX3CR1‐GFP Mice
4:29
Results: In Vivo Imaging of Microglia in CX3CR1‐GFP Mice
6:20
Conclusion
