Name: 인간 중간엽 줄기세포에서 작은 세포외 소포를 분리하는 간단한 탁상형 여과 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 배우세요 인간 제대 유래 중간엽 줄기세포에서 작은 세포외 소포를 분리하는 간단한 탁상형 여과 방법을. 이 기술은 나노입자 추적 분석과 전자현미경을 활용하여 고품질 소포를 효율적으로 얻을 수 있습니다.

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이 비디오의 출판은 My CytoHealth Sdn. Bhd.

알림: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 인간 탯줄 중간엽 줄기세포 및 배양
<ol><li>hUC-MSC를 DMEM에서 5 ×10 3/cm2 의 파종 밀도로 배양하고, 8% 인간 혈소판 용해물 및 1% Pen-Strep으로 보충하였다. 세포를 5%CO2에서 37°C에서 인큐베이션한다. 적절한 세포 성장을 보장하기 위해 3일마다 세포 배양 배지를 교체하십시오.</li>
	<li>sEV 분리를 위해 T175 플라스크의 계대 5까지 세포를 확장합니다. 참고: 높은 수율의 sEV를 수확하려면 많은 플라스크가 필요합니다(수율은 세포 수에 따라 증가함).</li>
</ol>2. hUC - MSCs에서 작은 세포외 소포 분리
<ol><li>배양이 계대 5에서 70%-80% 밀도에 도달하면 배양 배지를 1% Pen-Strep[조건부 배지(CM)]이 보충된 신선한 페놀-적색 유리 DMEM으로 교체합니다. 주의 : 기본 매체만 사용하십시오. 외부 sEV에 의한 오염을 피하기 위해 FBS 및 인간 혈소판 용해물 보충제를 피하십시오.</li>
	<li>24시간 후, CM을 200 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 0.22μm 필터를 통해 상청액을 수집하고 여과하여 220nm보다 큰 입자를 제거합니다.</li>
	<li>0.2μm 필터로 여과된 30mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 원심 필터 장치를 채웁니다. 원심 필터 장치를 3,500 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리합니다.</li>
	<li>여과된 CM을 원심 필터 장치에 채웁니다(각 장치의 최대 부피는 70mL). CM을 4°C에서 3,500 × g 으로 원심분리한다. 알림: 용액이 필터 표면에 도달할 때까지 원심분리 기간을 수시로 모니터링해야 합니다.</li>
	<li>여과액 용액 컵에 용액을 버립니다. 4°C에서 1,000 x g의 농축액 수집 컵으로 샘플 필터 컵을 2분 동안 역원심분리합니다.</li>
	<li>농축된 CM을 원심 필터 장치로 다시 옮깁니다. 여과된 PBS 30mL를 원심분리 필터 유닛에 넣고 4°C에서 3,500×g으로 원심분리한다.</li>
	<li>여과액 용액 컵에 용액을 버립니다. 필터부에 농축액 채취컵을 설치하고 1,000× g 에서 4°C에서 2분간 역원심분리하여 정제된 sEVs를 얻었다.</li>
	<li>0.22μm 주사기 필터를 통해 sEV를 필터링합니다.</li>
	<li>샘플을 새 튜브로 옮기고 추가 분석을 위해 -80°C에서 보관합니다.</li>
</ol>3. hUC-MSC-sEV의 특성화
<ol><li>나노 입자 추적 분석<ol><li>여과된 PBS에서 분리된 hUC-MSC-sEV를 20-100 입자/프레임으로 희석합니다.</li>
		<li>희석된 샘플 1mL를 1mL 일회용 주사기를 사용하여 NTA 챔버에 넣습니다.</li>
		<li>그에 따라 측정 설정을 지정합니다: 카메라 레벨을 레벨 14로 조정하고, 10-100개의 적십자 카운트를 제한하여 가능한 한 많은 입자를 포함하도록 감지 임계값을 결정하고, 블루 크로스 카운트는 5개로 제한합니다.</li>
		<li>각 측정에 대해 5개의 1분 분량의 비디오를 녹화하고 감지 임계값이 5인 NanoSight 소프트웨어를 사용하여 분석합니다.</li>
		<li>각 샘플에 대해 세 번 측정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>웨스턴 블로팅 분석<ol><li>hUC-MSC-sEV를 얼음-차가운 방사성 면역침전 분석법(RIPA) 용해 완충액으로 용해하고, 4°C에서 30분 동안 인큐베이션하고, 4°C에서 5분 동안 200× g 에서 원심분리한다. 상청액을 수집합니다.</li>
		<li>Bicinchoninic Acid(BCA) Protein Assay Kit를 사용하여 단백질을 정량합니다. 그에 따라 설정된 겔 전기영동을 조립하고 단백질이 스태킹 겔의 끝에 도달할 때까지 90V에서 겔 전기영동을 수행합니다. 전압을 200V로 변경하여 분해 겔이 끝날 때까지 단백질을 분리합니다.</li>
		<li>반건조 전사를 수행하여 단백질을 겔에서 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 1시간 동안 15V로 옮깁니다.</li>
		<li>실온의 셰이커에서 3% 소 혈청 알부민(BSA)/트리스 완충 식염수-0.1% v/v 트윈 20(TBS-T)으로 PVDF 막을 1시간 동안 차단합니다. PVDF 막을 다음과 같이 1차 항체와 함께 인큐베이션한다: 마우스 항-CD 9 단일클론 항체 (1:500), 마우스 항-CD 81 단일클론 항체 (1:500), 마우스 항-GRP 94 단일클론 마우스 항-TSG 101 단일클론 항체 (1:500)를 4°C에서 하룻밤 동안 일정한 진탕.</li>
		<li>다음날, PVDF 멤브레인을 TBS-T로 5 x 5분 세척하고 2차 항체인 양 고추 냉이 과산화효소 접합 마우스 IgG 카파 결합 단백질(m-IgGκ BP-HRP)(1:5,000)과 함께 실온에서 교반하면서 1시간 동안 추가로 배양합니다.</li>
		<li>다시, TBS-T로 PVDF 멤브레인을 5회 세척하고, 화학발광 검출 시약을 사용하여 CCD(charge-coupled) 이미저에서 멤브레인을 시각화한다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 단백질의 발현 수준을 분석합니다. 먼저 ImageJ에서 이미지 파일(파일 | 열기...). 밝기와 대비를 조정하여 이미지 품질 향상(Image | 조정 | 밝기/대비). 얼룩이 선명하게 보일 때까지 이미지를 조정하고 적용 버튼을 클릭한 다음 이미지를 TIFF 형식(파일 | 다른 이름으로 저장 | TIFF...)입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>투과 전자 현미경<ol><li>hUC-MSC-sEVs 샘플의 한 부분을 여과된 PBS의 4개 부분으로 총 부피 10μL로 희석하고 탄소 코팅된 구리 그리드에서 15분 동안 배양합니다.</li>
		<li>실험실 물티슈를 사용하여 과도한 샘플을 제거하고 3분 동안 자연 건조시킵니다.</li>
		<li>1% 포스포텅스텐산(PTA) 용액 10μL를 배양하여 샘플을 3분 동안 염색합니다.</li>
		<li>실험실 물티슈를 사용하여 과도한 1% PTA 용액을 제거하고 3분 동안 자연 건조시킵니다.</li>
		<li>투과 전자 현미경 이미징을 위해 샘플을 사용하십시오. 알림: 요약된 개략도 실험 단계는 그림 1 을 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross+talk+between+adipose+tissue+and+placenta+in+obese+and+gestational+diabetes+mellitus+pregnancies+via+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 239(2017).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+derived+from+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+alleviate+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis.</a> Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cell-derived+small+extracellular+vesicles+induce+ischemic+neuroprotection+by+modulating+leukocytes+and+specifically+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils.</a> Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC-derived+sEVs+enhance+patency+and+inhibit+calcification+of+synthetic+vascular+grafts+by+immunomodulation+in+a+rat+model+of+hyperlipidemia%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC-derived+small+extracellular+vesicles+overexpressing+miR-20a+promoted+the+osteointegration+of+porous+titanium+alloy+by+enhancing+osteogenesis+via+targeting+BAMBI%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI.</a> Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).</li>
<li>Li, F. X. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mesenchymal+stromal+cells-derived+small+extracellular+vesicles+in+diabetes+and+its+chronic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 1741(2021).</li>
<li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJayabalan%2C+N+%22Frontiers+in+Endocrinology%22">Frontiers in Endocrinology</a>. 8, Front Endocrinol. Lausanne. (2017).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWei%2C+Y+%22Biomaterials%22">Biomaterials</a>. 204, Biomaterials. 13-24 (2019).</li>
<li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. 133, 70-81 (2017).</li>
<li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+exosome+isolation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li>
<li>Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+extracellular+vesicles%2C+their+origin%2C+composition%2C+purpose%2C+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727(2019).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).</li>
<li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+isolation+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocol%22%5BJournal%5D)">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).</li>
<li>Kırbaş, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+isolation+of+extracellular+vesicles+from+various+organic+sources+using+aqueous+two-phase+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Ev, B., Ms, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+exosomes%2C+naturally-equipped+nanocarriers%2C+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%3A+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).</li>
<li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+syncytiotrophoblast+microvesicles+and+exosomes+and+their+characterisation+by+multicolour+flow+cytometry+and+fluorescence+Nanoparticle+Tracking+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Methods. 87, San Diego, Calif. 64-74 (2015).</li>
<li>Tan, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchtop+isolation+and+characterisation+of+small+extracellular+vesicles+from+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells.</a> Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

EV는 MSC에서 시크릿톰의 중요한 하위 집합 중 하나이며 정상 및 병리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 그러나 30nm에서 200nm 사이의 크기 범위를 가진 sEV는 지난 10년 동안 무세포 치료를 위한 잠재적인 도구로 부상했습니다. MSC에서 sEV를 분리하기 위해 다양한 기술이 개발되었습니다. 그러나, 차등 초원심분리, 한외여과, 고분자 기반 침전, 면역친화성 포획 및 미세유체 기반 침전은 서로 다른 장점과 단점을 가지고 있다17. 이러한 분리 기술 중 어느 것도 높은 회수율과 특이성을 달성할 수 없습니다. 따라서 연구자들은 높은 회수율 또는 높은 특이성을 기반으로 선호도에 따라 적절한 방법을 선택해야 합니다. 
중간엽 줄기세포 sEV를 분리하기 전에, 중간엽 줄기세포를 앞서 설명한 바와 같이 유세포 분석에 의해 양성 표면 마커 (CD90, CD105, CD73) 및 음성 마커 (CD34, CD11b, CD19, CD45 및 ...

MISEV 2018에 따르면 sEV는 기능적 핵이 존재하지 않는 비복제 지질 이중층 입자로 크기가 30-200nm1입니다. MSC 유래 sEV에는 microRNA, 사이토카인 또는 단백질과 같이 조직 재생에 중요한 역할을 하는 중요한 신호 분자가 포함되어 있습니다. 그들은 점점 더 재생 의학 및 무세포 요법의 연구 "핫스팟"이 되었습니다. 많은 연구에 따르면 중간엽 줄기세포에서 추출한 sEV는 면역조절 2,3,4,5, 골형성 강화 6, 당뇨병7,8 또는 혈관 재생 9,10과 같은 다양한 질환을 치료하는 데 중간엽 줄기세포만큼 효과적이다. 초기 단계 시험이 진행됨에 따라 MSCs-EV의 임상 번역과 관련된 세 가지 주요 주요 문제, 즉 EV의 수율, EV의 순도(세포 파편 및 단백질 및 사이토카인과 같은 기타 생물학적 오염 물질이 없음), 분리 후 EV의 인지질 이중층 막의 무결성이 강조되었습니다.
sEV를 분리하기 위한 다양한 방법이 개발되었으며, sEV의 밀도, 모양, 크기 및 표면 단백질을 이용한다(11). sEV 분리에서 가장 일반적인 두 가지 방법은 초원심분리 기반 및 한외여과 기반 기술입니다.
초원심분리 기반 방법은 sEV 분리에서 표준이 되는 방법으로 간주됩니다. 일반적으로 사용되는 두 가지 유형의 초원심분리 기술은 차동 초원심분리와 밀도 구배 초원심분리입니다. 그러나 초원심분리 방법은 종종 수율이 낮고 고속 초원심분리기(100,000-200,000 × g)를 위한 고가의 장비가 필요합니다11. 또한, 초원심분리 기술만으로는 EV 아형(sEV 및 대형 EV)을 분리하는 데 비효율적이며, 그 결과 불순한 퇴적물층(11)이 생성된다. 마지막으로, 밀도 구배 초원심분리는 또한 시간이 많이 소요될 수 있으며 가속 및 감속 단계12 동안 구배 손상을 억제하기 위해 자당 완충액 추가와 같은 추가 예방 단계가 필요할 수 있습니다. 따라서, 초원심분리는 일반적으로 상대적으로 낮은 수율을 초래하고,EVs13의 상이한 집단을 구별할 수 없으며, 이는 대규모 EV 준비(11)에 대한 적용을 제한한다.
EV 격리의 두 번째 방법은 크기 여과를 기반으로 하는 한외여과를 통한 것입니다. 한외여과는 고가의 장비나 긴 처리 시간을 필요로 하지 않기 때문에 초원심분리에 비해 상대적으로 시간 및 비용 효율적이다14. 따라서, 한외여과는 앞서 언급한 두 가지 초원심분리 방법보다 더 효과적인 분리 기술인 것으로 보인다. 분리된 생성물은 기공 크기와 더 높은 수율에 기초하여 보다 구체적일 수 있다15. 그러나, 여과 과정 동안 발생하는 추가적인 힘은 EV(16)의 변형 또는 분출을 초래할 수 있다.
현재 논문은 다운스트림 분석 및 치료 목적을 위해 MSC 유래 sEV를 분리하기 위한 비용 및 시간 효율적인 벤치탑 프로토콜을 제안했습니다. 이 논문에 설명된 방법은 입자 크기 분석, 바이오마커 분석 및 전자 현미경 이미징을 포함한 다운스트림 분석을 위해 hUC-MSC에서 고수율 및 고품질 EV를 분리하기 위해 벤치탑 원심분리와 간단한 여과 방법을 결합했습니다.

<table><tbody><tr><td>40 % 아크릴 아미드</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06121-95</td><td>웨스턴 블롯</td></tr><tr><td>95 % 에탄올</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14710-25</td><td>소독제</td></tr><tr><td>절대 메탄올</td><td>Chemiz</td><td>45081</td><td>PVDF 멤브레인 (웨스턴 블롯)을 활성화하기 위해</td></tr> <tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7920</td><td>세포 해리 효소</td></tr><tr><td>과황산 암모늄</td><td>Chemiz</td><td>14475</td><td>겔 중합 촉매 (Gel electrophoresis</td></tr><tr><td>anti-CD 81 (B-11)Santa</td> <td>Cruz Biotechnology</td><td>sc-166029</td><td>항체 sEV marker</td></tr><tr><td>anti-TSG 101 (C-2)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7964</td><td>항체 sEV marker</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Nacalai Tesque</td><td>00653-31</td><td>PVDF 멤브레인 블로</td></tr><tr><td>킹 브로모페놀 블루</td><td>Nacalai Tesque</td><td>05808-61</td><td>전기영동 컬러 마커</td></tr><tr><td>Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)</td><td>Millipore</td><td>UFC710008</td><td>sEVs 절연</td></tr><tr><td>ChemiLumi One L</td><td>Nacalai Tesque</td><td>7880</td><td>화학발광 검출 시약</td></tr><tr><td>CryoStor 냉동 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3124-100ML</td><td>Cell cryopreserve</td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 된 독수리' s medium</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08458-45</td><td>세포 배양 매체</td></tr><tr><td>ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker</td><td>SMOBIO</td><td>PM2610</td><td>단백질 분자량 마커</td></tr><tr><td>매우 두꺼운 블로팅 페이퍼</td><td>ATTO</td><td></td><td>버퍼 예비군 (웨스턴 블롯)</td></tr> <tr><td>Glycerol</td><td>Merck</td><td>G5516</td><td>웨스턴 블롯 용 화학 물질</td></tr><tr><td>글리신</td><td>1st Base</td><td>BIO-2085-500g</td><td>완충액 (웨스턴 블롯)</td></tr> <tr><td>양 고추 냉이 과산화 효소 접합 마우스 IgG 카파 결합 단백질 (m-IgG &kappa; BP-HRP)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-516102</td><td>2차 항체 (Western Blot)</td></tr><tr><td>Human Wharton' s 젤리 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)</td><td>말레이시아 국립 대학교</td><td></td><td></td>의과대학 조직 공학 및 재생 의학 센터</tr><tr><td>마우스 항체 항CD 9 (C-4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>&nbsp; sc-13118</td><td></td></tr><tr><td>CMOS 카메라, 20 &times; 대물 렌즈, 블루 레이저 모듈 (488&thinsp; nm) 및 NTA 소프트웨어 v3.2</td><td>Malvern Panalytical, 영국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Nacalai Tesque</td><td>02890-45</td><td>TEM</td></tr><tr><td>페니실린 중 샘플 고정; 스트렙토마이신</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td>매체 페</td></tr><tr><td>닐메틸설포닐 플루오라이드</td><td>Nacalai Tesque</td><td>27327-81</td> lysis buffer phosphate-buffered saline Gibco 10010023 Washing, sample dilution polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size ATTO <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>첨가 후 sEV 샘플에서 프로테아제 억제단백질 전달 중 단백질 보유 (웨스턴 블롯)</td></tr> <tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25955-11</td><td>용해 완충액 첨가 후 sEV 샘플에서 프로테아제 억제</td></tr><tr><td>단백질 분석 Bicinchoninate Kit</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06385-00</td><td></td></tr><tr><td>2-ME</td><td>Nacalai Tesque</td><td>30566-22</td><td>웨스턴 블롯 나트륨 환원제를</td>사용한 단백질 측정 샘플 버퍼 솔루션</tr><tr><td> 염화물</td><td>Nacalai Tesque</td><td>15266-64</td><td>웨스턴 블롯 용 화학 물질</td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이트</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31606-62</td><td>젤 전기 영동 중 이온 성 계면 활성제</td></tr><tr><td>Tecnai G2 F20 S-TWIN 투과 전자 현미경</td><td>FEI, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>테트라 메틸 에틸렌 디아민</td><td>Nacalai Tesque</td><td>33401-72</td> 젤 트리스 염기를 <td>제조하는 화학 물질</td></tr><tr><td></td><td>1st Base</td><td>BIO-1400-500g</td><td>완충용 화학물질 (웨스턴 블롯)</td></tr><tr><td>&nbsp; Tween 20</td><td>GeneTex</td><td>GTX30962</td><td>Chemicals for western blot</td></tr><tr><td>UVP(Ultra Vision Product) CCD 이미저</td><td></td><td></td><td>웨스턴 블롯 신호 감지를 위한 CCD 이미저</td></tr></tbody></table>

인간 중간엽 줄기세포에서 작은 세포외 소포를 분리하는 간단한 탁상형 여과 방법

A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells

초원심분리 기반 공정은 작은 세포외 소포(sEV) 분리를 위한 일반적인 방법으로 간주됩니다. 그러나 이 분리 방법의 수율은 상대적으로 낮고 이러한 방법은 sEV 아형을 분리하는 데 비효율적입니다. 이 연구는 hUC-MSC의 조건화된 배지에서 한외여과에 의해 성공적으로 분리된 인간 탯줄 유래 MSC 작은 세포외 소포(hUC-MSC-sEV)를 분리하는 간단한 탁상형 여과 방법을 보여줍니다. 분리된 hUC-MSC-sEV의 크기 분포, 단백질 농도, 엑소좀 마커(CD9, CD81, TSG101) 및 형태는 각각 나노입자 추적 분석, BCA 단백질 분석, 웨스턴 블롯 및 투과 전자 현미경으로 특성화되었습니다. 분리된 hUC-MSC-sEV의 크기는 30-200nm였으며 입자 농도는 7.75 ×10 10 particles/mL이고 단백질 농도는 80μg/mL였습니다. 엑소좀 마커 CD9, CD81 및 TSG101에 대한 양성 밴드가 관찰되었습니다. 이 연구는 hUC-MSC-sEV가 hUC-MSC 조건 배지에서 성공적으로 분리되었음을 보여주었고, 특성화는 분리된 생성물이 세포외 소포 연구를 위한 최소 정보 2018(MISEV 2018)에서 언급한 기준을 충족함을 보여주었습니다.

그림 2 는 hUC-MSC-sEV가 53nm에서 입자 크기 모드를 갖는 반면 입자 크기의 다른 중요한 피크는 96nm 및 115nm임을 보여줍니다. NTA에 의해 측정된 hUC-MSC-sEVs의 농도는 7.75 ×10 10 particles/mL였다. BCA 분석으로 측정한 hUC-MSC-sEV의 단백질 농도는 약 80μg/mL였습니다.
웨스턴 블랏팅 분석에서 hUC-MSC-sEV는 엑소좀 마커 CD9, CD81 및 TSG101에 대해 양성 밴드를 나타내었지만 GRP94에 대해서는 음성이었습니다(그림 3). GRP94는 sEV의 음성 마커로 일반적으로 사용되는 소포체 마커입니다. 분리된 hUC-MSC-sEV를 TEM 하에서 시각화하여 크기와 형태를 결정했습니다. hUC-MSCs-sEVs 크기는 ~100nm이며 컵 모양의 이중층 막 구조를 보여주었습니다(<...

이 프로토콜은 간단한 실험실 규모의 벤치탑 설정으로 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포의 작은 세포외 소포(hUC-MSC-sEV)를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 hUC-MSC-sEV의 크기 분포, 단백질 농도, sEV 마커 및 형태는 각각 나노입자 추적 분석, BCA 단백질 분석, 웨스턴 블롯 및 투과 전자 현미경으로 특성화됩니다.

The ultracentrifugation-based process is considered the common method for small extracellular vesicles (sEVs) isolation. However, the yield from this ...

이것은 중간엽 줄기 세포에서 작은 세포외 소포를 분리하고 농축하기 위한 간단하고 시간 효율적인 프로토콜입니다. 이 기술은 벤치탑 저울이고 작업을 위한 간단한 기기만 필요하기 때문에 대부분의 실험실에서 쉽게 채택할 수 있습니다. 작은 세포외 소포를 분리하려면 최소 1억 개의 세포를 얻기 위해 대규모로 세포를 성장시키는 것이 좋습니다.간단하게 들리지만 이 기술의 특정 중요한 단계는 시각적 데모를 통해 더 잘 알 수 있습니다. 우리는 연구원들이 우리의 경험에서 배우고 자신있게 기술을 습득 할 수 있기를 바랍니다. 박사 과정 학생인 Mr.Chan, Hong Hao는 중간엽 줄기 세포에서 작은 세포외 소포의 분리 및 특성화에 대한 경험을 안내할 것입니다.먼저, 컨디셔닝된 배지를 200g에서 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 0.22 마이크로 미터 필터를 통해 상청액을 수집하고 여과하여 220 나노 미터보다 큰 입자를 제거합니다. 원심 필터 유닛을 30 밀리리터의 0.2 마이크로미터 여과된 인산염-완충 식염수로 채웠다.그 후 원심분리기를 3, 500g에서 섭씨 4도에서 5분간 원심분리한다. 여과액 용액 컵에 용액을 버립니다. 여과 된 컨디셔닝 된 매체 70 밀리리터를 원심 필터 장치에 넣고 섭씨 4도에서 3, 500g으로 원심 분리합니다.여과액 용액 컵에 용액을 버립니다. 여과 된 인산염 완충 식염수 30 밀리리터를 첨가하고 섭씨 4도에서 3, 500g에서 장치를 원심 분리한다. 필터부에 농축액 채취컵을 설치하고 섭씨 4도에서 2분 동안 1, 000g에서 역원심분리하여 정제된 세포밖 소포체를 얻었다.작은 세포외 소포체를 0.22마이크로미터 주사기 필터를 통해 걸러냅니다. 샘플을 새 튜브로 옮기고 추가 분석을 위해 섭씨 80도에 보관하십시오. 나노 입자 추적 분석을 시작하기 위해, 분리 된 인간 탯줄 유래 중간 엽 줄기 세포의 작은 세포 외 소포를 여과 된 인산염 완충 식염수에서 프레임 당 20-100 개의 입자로 희석합니다.1 밀리리터의 일회용 주사기를 사용하여 희석 된 샘플 1 밀리리터를 anti-A 챔버에 주입합니다. 그에 따라 측정 설정을 지정하십시오. 카메라 레벨을 레벨 14로 조정합니다.각 측정에 대해 표준 측정을 클릭하고 그에 따라 희석을 설정합니다. 그런 다음 캡처(Capture), 카메라 시작(Start Camera)을 클릭하고 카메라 레벨(Camera Level) 을 14 로 설정하여 소형 EV를 시각화합니다. 측정을 시작하려면 Create(생성)를 클릭한 다음 Run Script(스크립트 실행)를 클릭하고 파일을 저장해야 하는 위치를 선택합니다.샘플의 필요한 세부 정보를 입력하고 확인을 클릭합니다. OK(확인) 설정을 클릭하여 스크립트를 계속하고 OK(확인)를 클릭하여 측정을 시작합니다. 측정이 기록되면 프레임당 10-100개의 적십자 표시를 포함하도록 감지 임계값 5로 결과를 분석합니다. 그리고 파란색 십자 수는 5개로 제한됩니다.설정 확인(Setting OK)을 클릭하여 스크립트를 계속하고 해석을 시작합니다. 스크립트 완료 알림 및 내보내기에서 확인을 클릭하여 데이터를 설정된 위치로 내보냅니다. 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 소소포를 얼음처럼 차가운 방사성면역침전 분석법 용해 완충액으로 용해하고 섭씨 4도에서 30분간 배양한다.섭씨 4도에서 5분 동안 200g에서 원심분리한 후 상층액을 채취한다. BCA 분석을 사용하여 단백질을 정량화합니다. 그에 따라 설정된 겔 전기영동을 조립하고 단백질이 스태킹 젤의 끝에 도달할 때까지 90볼트에서 겔 전기영동을 수행합니다.전압을 200볼트로 변경하여 분해 젤이 끝날 때까지 단백질을 분리합니다. 1시간 동안 15볼트에서 젤에서 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 단백질을 옮기기 위해 반건식 전사를 수행합니다. PVDF 멤브레인을 트리스 완충 식염수 0.1% 트윈 20에 3% 소 혈청 알부민으로 차단하고 실온에서 1시간 동안 쉐이커에서 차단합니다.PVDF 멤브레인을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 지속적으로 흔들면서 1차 항체와 함께 배양합니다. 다음날, PVDF 멤브레인을 TBST로 각각 5회씩 5분씩 세척하고, 상온에서 교반하면서 1시간 동안 2차 항체와 함께 더 배양한다. 다시, PVDF 멤브레인을 TBST로 5회 세척하고 화학발광 검출 시약을 사용하여 전하 결합 이미저에서 멤브레인을 시각화합니다.ImageJ 소프트웨어를 사용하여 단백질의 발현 수준을 분석합니다. 먼저 ImageJ에서 이미지 파일을 엽니다. 밝기와 대비를 조정하여 이미지의 품질을 향상시킵니다.얼룩이 선명하게 보일 때까지 이미지를 조정합니다. 적용 버튼을 클릭하고 이미지를 TIFF 형식으로 저장합니다. 투과 전자 현미경 기반 분석을 위해, 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포 작은 세포외 소포 샘플의 한 부분을 여과된 인산염 완충 식염수 4부로 총 부피 10마이크로리터로 희석하고, 탄소-코팅된 구리 그리드 상에서 15분 동안 인큐베이션한다.실험실 물티슈를 사용하여 여분의 샘플을 제거하고 3분 동안 자연 건조시킵니다. 10 마이크로 리터의 1 % 포스 포 텅스텐 산 용액을 배양하여 샘플을 3 분 동안 염색합니다. 실험실 와이프를 사용하여 과량의 1 % 포스 포 텅스텐 산 용액을 제거하고 3 분 동안 자연 건조시켜 투과 전자 현미경으로 이미지를 만듭니다.인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 작은 세포외 소포체는 53 나노미터의 입자 크기 모드를 갖는 반면, 입자 크기의 다른 중요한 피크는 96 및 115 나노미터였다. NTA에 의해 측정된 인간 탯줄 유래 MSC 소세포밖 소포체의 농도는 밀리리터 당 10 내지 10번째 입자의 7.75배였다. BCA 분석으로 측정한 인간 탯줄 유래 MSC 작은 세포외 소포의 단백질 농도는 밀리리터당 약 80마이크로그램이었습니다.웨스턴 블랏팅 분석에서, 인간 탯줄 유래 MSC 작은 세포외 소포체는 엑소좀 마커 CD9, CD81 및 TSG101에 대해 양성 밴드를 나타내었지만 GRP94에 대해서는 음성이었습니다. 분리된 인간 탯줄 유래 MSC 작은 세포외 소포체를 TEM 하에서 시각화하여 크기와 형태를 결정했습니다. 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포는 크기가 약 100 나노미터인 작은 세포밖 소포체로서 컵 모양의 이중층 막 구조를 나타내었다.프로토콜의 성공적인 개발로 우리는 이제 재생 의학에서 중간엽 줄기 세포 유래 작은 세포외 소포의 치료 가능성을 밝힐 수 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 신선 조직 또는 냉동 조직에서 세포 외 소포를 추출하는 기술에 대해 설명합니다. 분리된 세포외 소포체는 질병 발병기전에서 중요한 역할을 밝히기 위한 추가 분석에 사용할 수 있습니다.

Extracellular Vesicle Extraction: 차등 원심분리를 사용하여 전체 조직 표본에서 세포외 소포를 분리하는 기술

이 프로토콜에서는 작은 RNA 도서관 건설 및 다음 세대 시퀀싱에 대 한 세포 배양에서 세포 외 microRNAs 정화 하는 방법을 보여 줍니다. 다양 한 품질 관리 검사점 작업 exRNAs 같은 낮은 입력된 샘플을 할 때 기대 하는 것을 이해 하는 독자 수 있도록 기술 된다.

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

여기서 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 세포외 소포가 컨디셔닝 세포 배양 배지로부터 적절하게 분리될 수 있음을 보여줍니다.

조절된 세포 배양 배지에서 세포외 소포를 분리하기 위한 크기 배제 크로마토그래피

본 프로토콜은 배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 대표적인 EV(엑소좀 및 마이크로베시클)를 분리하고 특성화하기 위한 차등 원심분리를 설명합니다. 이러한 EV의 추가 응용 프로그램도 이 기사에서 설명합니다.

배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용

세포외 소포체는 생물의학 응용 분야에 엄청난 가능성을 가지고 있지만, 현재의 분리 방법은 시간이 많이 걸리고 임상적으로 사용하기에는 비실용적입니다. 이 연구에서는 최소한의 단계로 연속적으로 많은 양의 생체 유체에서 세포외 소포체를 직접 분리할 수 있는 미세유체 장치를 제시합니다.

분기된 A4F 미세유체 장치를 사용한 대용량 시료에서 세포외 소포의 단일 단계 분리

이 프로토콜은 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포(ADSC) 배양 및 상층액 수집부터 초원심분리를 사용한 세포외 소포체(EV) 추출에 이르기까지 모든 절차를 설명합니다.

Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells의 세포외 소포체의 정제 및 특성 분석

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인간 모유 유래 세포외 소포의 신속한 분리

이 프로토콜은 효소 소화 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 소변 골격근과 골수에서 작은 세포외 소포를 분리하여 구조적으로 복잡하고 저수율 조직에서 소포 농축 분획을 재현 가능하게 회수하여 하위 분자 분석에 활용할 수 있도록 합니다.

크기 배제 크로마토그래피를 이용한 쥐 골격근 및 골수에서 작은 세포외 소포 분리

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연안 해수 샘플을 소량 (1 - 3L)은 여과

이 프로토콜은 실험 이식을 위해 autologous 쌍을 생성하는 동물의 혈청을 사용하지 않고 고립과 mesenchymal stromal 세포와 내피 세포의 콜로니 형성 이후의 확장을 설명합니다.

인간 탯줄의 분리 및 동물 혈청 무료 확장 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)을 유래

배우세요 인간 제대 유래 중간엽 줄기세포에서 작은 세포외 소포를 분리하는 간단한 탁상형 여과 방법을. 이 기술은 나노입자 추적 분석과 전자현미경을 활용하여 고품질 소포를 효율적으로 얻을 수 있습니다.

인간 중간엽 줄기세포에서 작은 세포외 소포를 분리하는 간단한 탁상형 여과 방법

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