Name: 렌티바이러스 매개 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 이용한 녹아웃 근육 세포주 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 학습하세요 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 이용한 근육 세포 녹아웃 기법으로, iPS 세포에서도 적용 가능한 효율적인 유전자 기능 연구 방법입니다. 이 프로토콜은 근육 질환 관련 유전자 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 협회 Française contre les myopathies (AFM-Téléthon)와 Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA)의 보조금으로 지원되었습니다.

<ol><li>Claussnitzer, M., Susztak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+insight+into+metabolic+diseases+from+human+genetic+discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries.</a> Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).</li>
<li>Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR+tools+for+variant+interpretation+and+disease+modeling+in+inherited+retinal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies.</a> Genes. 11 (5), 473(2020).</li>
<li>Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+therapeutics%3A+current+challenges+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).</li>
<li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+correction+of+muscular+dystrophy+by+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).</li>
<li>Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+specificity+of+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Target specificity of the CRISPR-Cas9 system.</a> Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).</li>
<li>Merienne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+self-inactivating+KamiCas9+system+for+the+editing+of+CNS+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes.</a> Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).</li>
<li>Marty, I., Fauré, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation-contraction+coupling+alterations+in+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Excitation-contraction coupling alterations in myopathies.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).</li>
<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li>
<li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick%2C+cost-free+method+of+purification+of+DNA+fragments+from+agarose+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li>
<li>Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+3+and+type+1+ryanodine+receptors+are+localized+in+triads+of+the+same+mammalian+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).</li>
<li>Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+linear+Lowry--Folin+assay+for+both+water-soluble+and+sodium+dodecyl+sulfate-solubilized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A linear Lowry--Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins.</a> Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).</li>
<li>Garibaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dusty+core+disease%27+%28DuCD%29%3A+expanding+morphological+spectrum+of+RYR1+recessive+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Dusty core disease' (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3(2019).</li>
<li>Marty, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+a+complex+involving+Dihydropyridine+receptor+and+Ryanodine+receptor+in+triad+junctions+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).</li>
<li>Oddoux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triadin+deletion+induces+impaired+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1, 34(2011).</li>
<li>Cacheux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+a+central+core+disease+RyR1+mutation+%28p.Y4864H%29+associated+with+quantitative+defect+in+RyR1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).</li>
<li>Luis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+old+and+the+new%3A+Prospects+for+non-integrating+lentiviral+vector+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology.</a> Viruses. 12 (10), 1103(2020).</li>
<li>Leenay, R. T., Beisel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering%2C+communicating%2C+and+engineering+the+CRISPR+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 4, Unit 4.21 (2006).</li>
</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

병리학에 관여하는 알려지지 않은 기능의 유전자를 특성화하는 길의 주요 단계는 이러한 유전자의 기능을 연구하기위한 관련 세포 모델의 개발입니다. CRISPR / Cas9를 사용한 유전자 편집의 사용은 기하 급수적으로 성장하는 연구 분야이며, 여기에 제시된 녹아웃 모델의 개발은 가장 널리 사용되는 응용 분야 중 하나입니다. 이러한 맥락에서, 우리는 여기서 관심있는 임의의 유전자에서 인간 세포주 녹아웃을 개발하기 위한 다목적 프로토콜을 제안하여, 관련 인간 세포 모델에서 이 유전자의 특성화를 허용한다. 여기에 제시된 프로토콜은 iPSC뿐만 아니라 불멸화 된 근모세포에서도 사용될 수 있으며, 따라서 관심있는 유전자에서 임의의 인간 세포 모델 KO의 생산을 사실상 초래할 수 있습니다.
한계는 이 프로토콜이 불멸화된 세포에 적용되어야 한다는 것인데, 이는 수많은 연속적인 증폭과 함께 세포 클로닝뿐만 아니라 배양의 많은 주간이 요구되기 때문이다. 대안적으로 몇 주 또는 몇 달 동안 증폭 및 ...

유전자 시퀀싱의 진행과 특정 조직에서 알려지지 않은 기능의 유전자에서 돌연변이의 확인과 함께, 새로운 표적 유전자의 기능을 이해하고 관련 병리 생리학 적 메커니즘에 대한 개입을 확인하는 관련 세포 모델의 개발은 필수적인 도구를 구성합니다. 또한, 이들 모델은 미래의 치료 개발1,2에 매우 중요하며, 실험에서 동물의 사용을 줄이기 위한 국제 권고와 직선으로 녹아웃 동물 모델의 개발에 대한 흥미로운 대안을 구성한다. CRISPR/Cas9를 사용한 유전자 편집은 현재 사용 가능한 가장 강력한 도구 중 하나로, 많은 녹아웃/녹인 모델을 개발할 수 있었으며, CRISPR/Cas9를 사용한 표적 유전자 검증은 CRISPR/Cas93의 가장 널리 사용되는 응용 프로그램 중 하나입니다. 유전자 편집의 성공은 표적 세포 모델에 CRISPR 도구 (가이드 RNAs 및 뉴클레아제 Cas9)를 도입하는 능력에 달려 있으며, 이는 근육 세포4와 같은 많은 형질감염이 어려운 세포에서 도전이 될 수 있습니다. 이 도전은 바이러스, 일반적으로 렌티 바이러스의 사용으로 극복 할 수 있으며, 이는 많은 세포 유형을 효율적으로 형질 도입하고 전이유전자를 전달할 수있는 큰 이점을 가지고 있습니다. 그러나 그것의 주요한 단점은 숙주 세포 게놈에서 이식유전자의 통합이며, 통합 부위에 국소화된 유전자의 잠재적 변경과 이식유전자의 영구적인 발현으로 이어지며, 이는 뉴클레아제 Cas9의 경우 해로운 결과를 초래할 것이다5. Merienne과 동료6에 의해 스마트 솔루션이 제안되었는데, 이는 Cas9 유전자 자체를 표적으로 하는 가이드 RNA의 세포로의 도입으로 구성되어 Cas9 불활성화로 이어진다. 이 전략의 적응은 사용자 친화적이고 다재다능한 프로토콜로 제시되어 형질감염이 어려운 세포에서 거의 모든 유전자를 녹아웃 할 수 있습니다.
여기에 제시된 프로토콜의 목표는 불멸화된 근육 세포에서 관심있는 유전자의 불활성화를 유도하는 것이다. 그것은 불멸화 된 세포의 다른 유형에서 관심있는 모든 유전자를 녹아웃하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에 기재된 프로토콜은 가이드 RNAs 및 이들의 클로닝을 렌티바이러스 플라스미드로 설계하고, 렌티바이러스 벡터에서 CRISPR 도구를 생산하고, 세포를 상이한 렌티바이러스로 형질도입하고, 세포를 복제하여 균질한 편집된 세포주를 생산하는 단계를 포함한다.
이 프로토콜을 사용하여, 불멸화된 인간 골격근 세포는 세포내 칼슘 방출 및 근육 수축에 관여하는 필수 칼슘 채널인 제1형 리아노딘 수용체(RyR1)의 결실과 함께 개발되었다7. 유전자의 녹아웃(KO)은 웨스턴 블롯을 사용하여 단백질 수준에서, 그리고 칼슘 이미징을 이용한 기능적 수준에서 확인되었다.

<table><tbody><tr><td>항CACNA1S 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA048892</td><td>Primary 항체</td></tr><tr><td>Blp I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0585S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>CalPhos 포유류 트랜스펙션 키트</td><td>Takara</td><td>631312&nbsp;</td><td>트랜스펙션(Transfection) 키트</td></tr><tr><td>이지 블롯 안티 마우스 IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX221667-01</td><td>HRP 보조 항체</td></tr><tr><td>이지 블롯 안티 Rabbit IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX221666</td><td>HRP 보조 항체</td></tr><tr><td>Fluo-4 직접</td><td>분자 프로브</td><td>F10472</td><td>칼슘 이미징</td></tr><tr><td>GAPDH(14C10) Rabbit mAb&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2118</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Fermentas</td><td>ER0501</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>InFusion HD Precision Plus</td><td>Takara</td><td>638920</td><td>Ligation kit</td></tr><tr><td>MasterMix Phusion High Fidelity with GC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F532L</td><td>Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTP</td></tr><tr><td>Myosin Heavy Chain antibody</td><td>DHSB</td><td>MF20</td><td>기본 항체</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>REF&nbsp; </td><td>740424 플라스미드 정제를 위한 Maxipreparation 키트</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td></td><td>740609 DNA 정제</td></tr> 세포<tr><td>에서 DNA 추출을 위한</td><td>NucleoSpin Tissue</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952</td> Kit for DNA extraction from cell</tr><tr><td>One Shot Stbl3 Chemically Competent&nbsp;E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C737303</td><td>Chemically competent cells</td></tr><tr><td>Plasmid #87904</td><td>Addgene</td><td>87904</td><td>SpCas9 인코딩 렌티바이러스 플라스미드 (LV-Cas9용)</td></tr><tr><td>플라스미드 #87919</td><td>Addgene</td><td>87919</td><td>가이드가 있는 카세트 삽입용 렌티바이러스 백본(LV-가이드 타겟용)</td></tr><tr><td>플라스미드 #12260</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>렌티바이러스 플라스미드 인코딩 GAG POL</td></tr><tr><td>플라스미드 #8454</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>렌티바이러스 및 MuLV 레트로바이러스 입자를 생성하기 위한 렌티바이러스 플라스미드 인코딩 봉투 단백질</td></tr><tr><td>V5 태그 단클론 항체</td><td>Invitrogene</td><td>R96025&nbsp;</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>XL10-Gold 초역량 세포</td><td>애질런</td>트 <td>200317</td><td>화학적 역량 세포</td></tr><tr><td>Xma I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0180S</td><td>제한 효소</td></tr></tbody></table>

렌티바이러스 매개 crispr/cas9 유전자 편집을 이용한 녹아웃 근육 세포주 개발

Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

클러스터형 조절 간격 짧은 고진구 반복(CRISPR)/Cas 9의 한 가지 중요한 적용은 특히 유전자 진단 중에 확인된 질병과 관련된 새로운 유전자/단백질의 기능을 연구하기 위한 녹아웃 세포주의 개발입니다. 이러한 세포주의 개발을 위해서는 두 가지 주요 쟁점이 얽혀 있어야합니다 : 선택된 세포에 고효율로 CRISPR 도구 (Cas9 및 가이드 RNA)를 삽입하고 선택한 유전자의 특정 결실에 대한 Cas9 활성의 제한. 여기에 기술된 프로토콜은 근육 세포와 같은 형질감염되기 어려운 세포에서 CRISPR 도구의 삽입에 전념한다. 이 프로토콜은 공개적으로 이용가능한 플라스미드로 생산된 렌티바이러스의 사용에 기초하며, 이를 위해 모든 클로닝 단계가 관심있는 유전자를 표적으로 하기 위해 기술된다. Cas9 활성의 조절은 KamiCas9라고 불리는 이전에 기술된 시스템의 적응을 사용하여 수행되었으며, 여기서 Cas9를 표적화하는 가이드 RNA를 코딩하는 렌티바이러스를 사용한 세포의 형질도입은 Cas9 발현의 점진적 폐지를 허용한다. 이 프로토콜은 RYR1-녹아웃 인간 근육 세포주의 개발에 적용되었으며, 이는 근육 세포 내 칼슘 방출 및 여기 수축 결합에 관여하는이 중요한 칼슘 채널의 녹아웃을 확인하기 위해 단백질 및 기능적 수준에서 더욱 특성화되었습니다. 여기에 설명 된 절차는 근육 세포 또는 다른 트랜스펙션하기 어려운 다른 유전자에 쉽게 적용될 수 있으며 인간 세포에서 이러한 유전자를 연구하는 데 유용한 도구를 생산할 수 있습니다.

이 프로토콜은 건강한 피험자15 (소위 HM 세포, 인간 근모세포의 경우)로부터의 불멸화 근모세포에 적용되었으며, 여기서 RyR1은 RyR1 단백질을 코딩하는 RYR1 유전자를 녹아웃시키기 위해 이전에 특성화16이었다. 가이드 RNA의 설계는 유전자의 엑손 101 및 인트론 101의 일부를 포괄하는 서열을 삭제하도록 만들어졌다. 엑손 101의 일부의 결실은 판독 프레임의 중단을 초래할 것으로 예상된다. 또한, 엑손(101)은 단백질의 기공을 인코딩하고, 따라서 기능성 칼슘 채널을 생성하는데 요구된다. 심각한 RyR1 관련 근병증으로 영향을 받는 많은 환자들은 유전자7의 이 영역에 돌연변이를 갖는다. Crispor 소프트웨어로 예측된 최상의 가이드는 최상의 효율성을 유지하면서 가능한 한 적은 오프 타겟을 확보하기 위해 선택되었습니다. 우리는 동일한 바이러스 벡터에서 동시에 두 개의 가이드...

이 프로토콜은 가이드 RNA의 설계부터 녹아웃 클론의 세포 클로닝 및 특성화에 이르기까지 CRISPR/Cas9를 사용하여 녹아웃 근세포를 생성하는 방법을 설명합니다.

렌티바이러스 매개 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 이용한 녹아웃 근육 세포주 개발

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

이 프로토콜은 근육에서이 유전자의 기능을 더 연구하기 위해 모든 유전자에서 근육 세포 녹아웃의 개발을 허용합니다. 장점은 어떤 유전자를 연구하기 위해 녹아웃 동물의 개발보다 저렴하고 빠르다는 것입니다. 이 기술은 예를 들어, 근병증에서 새로 확인된 유전자의 관여를 연구하는데 사용될 수 있다.여기에 기술된 기술이 iPS 세포에 적용된다면 임의의 유형의 세포에서 임의의 유전자에 대한 녹아웃 세포의 발달을 유도할 수 있다. 정기적으로 간격이 짧은 팰린드로믹 반복 또는 CRISPR 매개 유전자 결실을 시작하려면 먼저 앙상블과 같은 게놈 브라우저 도구를 사용하십시오. 조직(org)의 양쪽에 있는 DNA 서열과 함께 표적 유전자를 동정한다.유전자 엑손의 목록을 얻으려면 먼저 단백질 코딩 서열의 전사체를 클릭 한 다음 Exons를 클릭하십시오. 그런 다음 다운로드 시퀀스를 클릭하고 게놈 시퀀스 만 선택하여 전체 유전자의 전체 합의 서열을 다운로드하십시오. 유전자의 엑손과 인트론 목록을 스크롤하여 표적화 된 것을 선택하십시오.가이드 RNA를 설계하기 위해, 먼저 표적 서열의 바로 상류 및 하류의 인트론의 뉴클레오티드 서열을 선택한다. 그런 다음 crispr.tefor와 같은 웹 사이트로 이동하십시오. 그물 및 선택된 서열을 사용하여 두 개의 가이드 RNAs를 설계하고, 각각의 20개 뉴클레오티드는 수백 염기쌍으로 분리된 프로토스페이서 인접 모티프 없이 길다.다음으로 각 가이드 RNA에 대한 역보체 서열을 확인하고 프라이머를 주문한다. 플라스미드 클로닝을 위한 가이드 RNA 카세트를 구성하려면 먼저 텍스트에 설명된 레시피 및 프로그램을 사용하여 프라이머 세트 1개로 PCR을 실행한 다음, Tris-borate-EDTA 버퍼를 사용하여 1% 아가로스 겔에서 PCR 산물을 분리합니다. 다음으로 300-염기 쌍 단편을 소비하고 키트를 사용하여 정제하십시오.유사하게, 다른 프라이머 세트로 또 다른 PCR을 실행한 후, 400-염기쌍 긴 DNA 단편을 20 마이크로리터의 용출 완충액으로 정제한다. 가이드 RNA 카세트를 렌티바이러스 플라스미드 백본에 삽입하기 위해, 먼저 본문에 기재된 바와 같이 플라스미드와 제한 효소 Xma 1 및 Blp 1의 이중 소화 반응을 설정한다. 반응 튜브를 섭씨 37도에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 섭씨 65도에서 20분 동안 인큐베이션한 다음, 소화 생성물을 1% 아가로스 겔에서 실행하고 적절한 키트를 사용하여 약 10킬로염기쌍의 플라스미드를 정제한다.또한 광학 밀도를 측정하여 정제된 생성물을 정량화한다. 가이드 RNA 카세트를 플라스미드와 리게이트하기 위해, 정제된 가이드 RNA, 선형화된 플라스미드 DNA, 효소 및 물과 10 마이크로리터의 최종 부피로 반응 믹스를 준비한 다음, 반응 튜브를 섭씨 50도에서 15분 동안 인큐베이션하여 pGuide라고 불리는 최종 플라스미드를 생성하였다. 렌티바이러스 생산을 위해, 먼저 10%FBS와 1%페니실린 또는 스트렙토마이신으로 보충된 고글루코스 및 피루베이트가 있는 DMEM에 1백만 HEK 293 세포가 있는 145센티미터 플레이트를 시드한다.그런 다음 세포를 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소 배양기에서 3 일 동안 성장시킵니다. 넷째 날에는 세포를 검사하여 60 ~ 65 %의 합류율을 확인하십시오. 다음으로 관심있는 플라스미드, 바이러스 외피를 코딩하는 플라스미드, 렌티바이러스 패키징 플라스미드 psPAX2, 및 인산칼슘으로 구성된 형질감염 용액을 준비한다.최종 부피를 물로 1000 마이크로 리터로 조정하십시오. 이어서, 형질감염 용액을 교반 하에 2X HBS의 1 밀리리터에 적가하고, 실온에서 적어도 10분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 용액을 세포에 적가하십시오.형질감염 용액의 균질한 분포를 위해, 플레이트를 모든 방향으로 부드럽게 기울인 다음, 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 적어도 5시간 동안 인큐베이션한다. 다음으로, 플레이트로부터 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척하여 형질감염 시약을 제거한 다음, 12 밀리리터의 신선한 배지를 첨가한다. 섭씨 37도에서 48시간 배양한 후, 모든 플레이트의 배지를 튜브에 풀링한다.튜브를 밀봉된 버킷에 넣고 섭씨 4도에서 5분 동안 800배 G에서 원심분리한 다음, 0.45마이크로미터 필터를 이용하여 상층액을 여과한 후, 68, 300배 G에서 4°C에서 두 시간 동안 여과액을 원심분리하고, 스윙 버킷 로터를 사용한다. 상층액을 제거한 후 튜브를 안전 캐비닛의 종이 타월에 거꾸로 뒤집어 놓고 펠릿에서 액체를 최대한 제거하십시오. 100 마이크로 리터의 HEC 증식 배지를 넣고 튜브를 적어도 두 시간 동안 섭씨 네 도에서 유지하십시오.그런 다음 피펫팅으로 펠렛을 재현탁하십시오. 재현탁 된 펠렛을 모두 수집 한 후 10 또는 25 마이크로 리터의 분취량을 만든 다음 액체 수소에서 스냅 동결 한 후 분취량을 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 근원세포 형질도입을 위해, 먼저 10, 000개의 근원세포 세포를 함유하는 100마이크로리터의 증식 배지로 96-웰 플레이트의 각 웰을 시드한다.다음 날, 사전 계산된 LV 가이드와 LV Cas9 볼륨을 안전 캐비닛의 셀에 추가하십시오. 배양의 오일 후, 트립신을 첨가하여 웰에서 세포를 방출한다. 세포 번호를 세어 본 후 40 ~ 50 %의 합류율로 세포를 웰에서 새 플레이트로 옮깁니다.다섯 시간의 인큐베이션 후, 20의 감염의 배수에서 LV 킬러의 계산 된 부피를 추가하고 5 ~ 10 일 또는 그 사이에 적어도 두 개의 계대 동안 배양하십시오. 칼슘 이미징에 의한 유전자 편집 클론의 기능적 특성화를 위해, 플레이트 50, 000 세포를 라미닌 코팅된 35-밀리미터 디쉬의 중앙에 위치시킨다. 분화를 유도하기 위해, 본문에 기재된 바와 같이 분화 배지를 첨가한다.배양 엿새 후, 배양 배지를 벗고 소수성 펜으로 세포를 묘사한다. 그런 다음 분화 배지에서 일대일로 희석 된 Fluo-4 Direct 50 마이크로 리터를 분화 된 myotube에 첨가하십시오. 섭씨 37도에서 30 분 동안 접시를 배양 한 후, 포도당 밀리리터 당 한 밀리그램으로 보충 된 Krebs 버퍼로 세포를 두 번 씻으십시오.다음으로 반전 형광 현미경 또는 10X 목표의 공초점 현미경을 사용하여 90 초 동안 초당 한 프레임의 속도로 형광 변화를 측정하고 적어도 10 개의 근관이있는 필드를 선택하십시오. 추가적인 크렙스 완충액을 제거한 후, 막 탈분극을 위해 2밀리리터의 염화칼륨 또는 2밀리리터의 플로로클로랄 메타크레졸 또는 4CmC 또는 RyR1 직접 자극으로 세포를 자극한다. 자극 후 형광 변화를 시각화한 다음, 각 myotube의 형광 변이를 정량한다.이 프로토콜은 인간 근모세포로부터 RyR1 유전자를 녹아웃하는데 성공적으로 사용될 수 있었고, 이는 세포에서 게놈 DNA를 더 짧게 만들었다. RyR1 녹아웃은 또한 웨스턴 블롯팅에 의해 표적화된 세포에서 RyR1 단백질이 검출될 수 없었기 때문에 단백질 수준에서 확인되었다. RyR1 녹아웃 세포로부터 분화된 미오튜브에서 RyR1 활성의 부재는 4CmC에 의한 직접적인 RyR1 자극 또는 염화칼륨에 의한 간접 자극 후 Fluo-4 칼슘 이미징에 의해 추가로 검증되었다-유도된 막 탈분극.결실될 서열은 기능적 단백질의 예측에 요구되어야 한다. 이 기술은 근육 질환에 새로운 유전자의 개입을 연구하기위한 게놈 후 도구의 개발에 이상적입니다.

development-knock-out-muscle-cell-lines-using-lentivirus-mediated

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

체세포를 유 전적으로 조작하는 능력의 최근 진보는 기본 및 응용 연구에 큰 가능성을 안겨줍니다. 여기, 우리는 선택 마커의 사용 여부에 관계없이 포유류 세포주에서 CRISP / Cas9 생성 녹아웃 생산 및 스크리닝을위한 두 가지 접근법을 제시한다.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

프로토콜에 대 한 빠른 마우스에서 유전자 장애 CRISPR/Cas9-중재 하 고 인간의 기본 조 혈 모 세포가이 문서에서 설명 하는. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins sgRNAs 녹음 방송 생체 외에서 그리고 상업적인 Cas9를 통해 생성 된 electroporation 통해 소개 된다. 높은 편집 효율성 제한 시간 및 금융 비용으로 달성 된다.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

여기, 선물이 유전자 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs)를 사용 하 여 기본 또는 확장 된 인간의 자연 킬러 (NK) 세포를 수정 하는 프로토콜. 이 프로토콜을 사용 하 여 인간 NK 세포 성장 인자-b 수용 체 2를 변형 (TGFBR2) 및 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)에 대 한 결핍을 생성 했습니다.

Cas9 Ribonucleoproteins를 사용 하 여 노크 아웃 기본 및 확장 된 인간 NK 세포의 생성

설명된 것은 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 고효율 게놈 편집을 위한 프로토콜로 조혈 시스템 별 유전자 수정을 통해 마우스 모델 시스템을 신속하게 개발합니다.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

여기에서는 배아 줄기 세포를 사용하여 유전자 변형 마우스 모델, 특히 대형 DNA 녹인 (KI)을 개발하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 사용하여 조정되어 기존의 상동 재조합 매개 선형화된 DNA 표적화 방법에 비해 KI 효율이 크게 향상되었습니다.

유전자 조작 마우스 모델 개발을 위한 배아 줄기 세포에서 CRISPR/Cas9 매개 고효율 유전자 표적화

CRISPR 관련 프로토콜이 점점 더 유용해지고 접근성이 높아짐에 따라 특정 실험 조건에서 복잡성과 장애물이 여전히 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9을 사용하여 수용체 상호 작용 세린/트레오닌-단백질 키나아제 1(RIPK1/RIP1) 녹아웃 인간 세포주를 생성하는 방법을 간략하게 설명하고 이 과정에서 직면할 수 있는 잠재적인 문제를 강조합니다.

CRISPR-Cas9 시스템을 사용한 RIP1 Knockout U937 세포주 생성

제시된 방법은 고효율 렌티바이러스 매개 유전자 전달 시스템을 사용하여 L2HGDH 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 안정적으로 발현하는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 계통 H9에서 CRISPR 매개 유전자 knockout의 생성을 설명합니다.

CRISPR-Cas9 매개 유전자 결실은 feeder-free 조건에서 배양된 인간 만능 줄기 세포에서 발생합니다.

THP-1 세포주는 다양한 생물학 관련 연구 분야에서 인간 단핵구/대식세포의 기능을 조사하기 위한 모델로 널리 사용됩니다. 이 논문에서는 효율적인 CRISPR-Cas9 기반 엔지니어링 및 단일 세포 클론 분리를 위한 프로토콜에 대해 설명하여 강력하고 재현 가능한 표현형 데이터를 생성할 수 있습니다.

THP-1 세포의 전기천공법 기반 CRISPR-Cas9 매개 유전자 녹아웃 및 단일 세포 클론 분리

Toxoplasma gondii 에서 약물 내성 유전자를 확인하는 데 유전지도를 기반으로하는 QTL 매핑을 사용하는 방법과 게놈 타겟을 효율적으로 편집하는 CRISPR / Cas9 시스템으로 어떻게 검증 할 수 있는지에 대한 세부 정보가 제공됩니다. 약물 내성 유전자.

약물 저항 유전자를 확인하기위한 QTL 매핑 및 CRISPR / Cas9 편집<em&gt; Toxoplasma gondii</em

학습하세요 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 이용한 근육 세포 녹아웃 기법으로, iPS 세포에서도 적용 가능한 효율적인 유전자 기능 연구 방법입니다. 이 프로토콜은 근육 질환 관련 유전자 연구에 활용됩니다.

렌티바이러스 매개 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 이용한 녹아웃 근육 세포주 개발

더 많은 동영상 탐색