다운스트림 순환 프리 DNA 응용을 위한 표준화된 액체 생검 사전 분석 프로토콜
2022년 9월 16일
액체 생검은 종양학 번역 연구에 대한 우리의 접근 방식에 혁명을 일으켰으며, 샘플 수집, 품질 및 보관은 성공적인 임상 적용을위한 중요한 단계입니다. 여기에서는 대부분의 번역 연구 실험실에 적용 할 수있는 다운스트림 순환 프리 DNA 응용 프로그램에 대한 표준화되고 검증 된 프로토콜을 설명합니다.
이것은 순환하는 자유 DNA를 기반으로 하는 다운스트림 액체 생검 애플리케이션을 위한 혈액 샘플의 처리 및 저장을 위한 표준 프로토콜입니다. 이 기술은 몇 년 동안 사용되어 왔지만 이것은 출판 된 최초의 표준 프로토콜입니다. 대부분의 중개 또는 과학 실험실에서 사용할 수 있는 표준 장비로 쉽게 따를 수 있습니다.
프로토콜은 모든 실험실 직원이 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 샘플을 수집하고 저장하는 방법을 표준화하는 데 도움이되며, 이는 궁극적으로 클리닉에 영향을 미치고 정밀도가 가장 중요한 동일하거나 유사한 다운 스트림 분석을 수행하는 여러 센터 간의 변동성을 줄입니다. 이 방법은 종양학 연구 및 임상 응용 분야에서 특히 유용합니다.
그러나 액체 생검이 사용되는 다른 비암 질환에도 적용될 수 있습니다. 혈액 샘플을 원심분리한 후 제거할 혈장이나 혈청의 양을 아는 것은 어려울 수 있지만 이 특정 지침을 따르면 도움이 됩니다. 나머지 프로토콜은 실험실에서의 제한된 경험으로 따르기가 매우 쉽습니다.
절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자 인 호르헤 (Jorge)가 될 것입니다. 시작하려면 신선한 혈액이 들어있는 튜브를 실온에서 1600 회 g에서 10 분 동안 원심 분리하고 최대 휴식을 취하십시오. 원심 분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거하십시오.
혈청 상청액의 상부 단계는 투명하고 황색을 띠게됩니다. 샘플에 용혈 징후가 있는지 확인하고 적절한 경우 용혈 유무를 기록합니다. Class II 생물안전 캐비닛에서 혈청을 250마이크로리터 분취량으로 수집 튜브로 옮깁니다.
부분 표본에는 올바르게 레이블이 지정되어야 합니다. 즉시 혈청을 섭씨 영하 80도에서 보관 상자에 똑바로 얼리고 샘플 보관 시간을 기록합니다. 샘플이 필요한 4시간 내에 처리되었는지 확인합니다.
EDTA 튜브를 실온에서 1600회 g에서 10분 동안 원심분리하고 최대 브레이크를 적용합니다. 원심분리 후, 혈장 상청액은 투명하고 황색을 띠게 될 것이다. 샘플에 용혈 징후가 있는지 확인하고 일회용 혈청 피펫을 사용하여 세포층을 방해하지 않고 혈장을 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮깁니다.
세포층 위에 약 5 밀리미터의 작은 잔류 혈장 부피를 남겨 둡니다. 용혈이 관찰되면 추가 분석을 위해 샘플을 폐기하십시오. 혈장을 원심분리 및 15-밀리리터 원심분리 튜브로 원심분리하여 제1 원심분리 단계로부터 이월된 임의의 잔류된 온전한 혈액 세포를 제거한다.
튜브 바닥의 셀 펠릿이 아닌 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거하고 일회용 혈청학적 피펫을 사용하여 1-4밀리리터의 혈장을 1-4밀리리터의 폴리프로필렌 극저온 바이오스 또는 Eppendorfs로 옮깁니다. 혈장이 혈액 세포로 오염되는 것을 피하기 위해 튜브 바닥에 잔류량의 혈장을 남겨 두어야합니다. 즉시 저장 상자에 플라즈마를 섭씨 영하 80도에서 똑바로 얼리고 샘플 보관 시간을 기록합니다.
샘플에 레이블이 올바르게 지정되고 필요한 4시간 내에 처리되었는지 확인합니다. P1000을 사용하여 세포층을 수집하고 여과 된 팁을 2 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 즉시 냉동하여 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.
다운스트림 애플리케이션에 사용할 수 있는 고품질 cfDNA 추출의 예가 여기에 나와 있는 반면, 이 그래픽 이미지는 게놈 오염 수준이 높은 부적합한 샘플의 예를 나타냅니다. 혈장 또는 혈청 분획은 노란색이어야합니다. 이는 개별 샘플에 따라 다를 수 있습니다.
용혈 된 샘플은 폐기해야합니다. 혈장 분획을 제거할 때 세포 펠릿을 제거하지 않도록 주의하십시오. 이 프로토콜은 면역 검출 기술을 사용하여 혈청 및 혈장 샘플에서 비코딩 RNA 또는 단백질의 검출과 같은 다른 핵산 기반 및 단백질 애플리케이션에도 사용할 수 있습니다.
이것은 많은 실험실에서 사용되는 매우 표준적인 기술입니다. 이 프로토콜은 연구자가 분석을 수행하는 방법을 표준화하는 데 도움이 되며, 이는 향후 임상 응용 분야에 필요한 중요한 측면입니다.
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개요
이 기사는 순환하는 유리 DNA에 중점을 둔 액체 생검 응용을 위한 혈액 샘플의 처리 및 저장에 대한 표준화된 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 따르기 쉽게 설계되었으며 대부분의 임상 연구 실험실에서 구현할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 종양학
- 임상 연구
배경
- 액체 생검은 종양학 임상 연구를 변화시켰습니다.
- 샘플 수집, 품질 및 저장은 임상 응용을 위해 중요합니다.
- 이 기술에 대해 발표된 최초의 표준 프로토콜입니다.
- 이 방법은 수년 동안 사용되어 왔습니다.
연구 목적
- 샘플 수집 및 저장을 표준화합니다.
- 유사한 분석을 수행하는 다양한 센터 간의 변동성을 줄입니다.
- 임상 응용에서의 정밀도를 향상시킵니다.
사용된 방법
- 혈액 샘플 처리.
- 순환하는 유리 DNA 저장 프로토콜.
- 표준 실험실 장비의 사용.
- 모든 실험실 직원이 액세스할 수 있는 프로토콜.
주요 결과
- 표준화된 프로토콜은 샘플 처리를 개선합니다.
- 다운스트림 분석의 변동성을 줄입니다.
- 종양학 연구에서 더 나은 임상 결과를 촉진합니다.
결론
- 이 프로토콜은 액체 생검 응용의 신뢰성을 향상시키는 데 중요합니다.
- 표준화는 임상 관행에 긍정적인 영향을 미칠 것입니다.
- 종양학 연구에서의 정밀도에 대한 증가하는 필요를 지원합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Standardized preanalytical protocols for liquid biopsy are critical for ensuring reproducible, high-quality circulating-free DNA (cfDNA) samples across translational and clinical research pipelines. This protocol directly addresses variability in sample handling, supporting predictive confidence and enabling robust downstream molecular analyses. Its adoption impacts early discovery, assay development, and translational continuity in oncology and other disease areas utilizing cfDNA.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent cfDNA sample quality for hypothesis-driven biomarker studies.
- Reduces preanalytical variability, supporting functional target validation.
- Facilitates reliable comparison of molecular signatures across cohorts.
Screening & Assay Development
- Provides standardized input material for assay optimization and validation.
- Supports reproducibility and quantitative output in cfDNA-based assays.
- Enables scalable sample processing for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sample handling with requirements for translational biomarker studies.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation of cfDNA markers.
- Reduces risk of sample-related artifacts in disease-relevant model systems.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions preanalytical sample handling as a foundational step from early discovery through lead identification and translational research. Its standardization supports robust data generation and cross-study comparability.
- Discovery Biology: Ensures cfDNA integrity for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Delivers reproducible, high-quality samples for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative, contamination-minimized inputs for downstream molecular analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical model validation with consistent sample quality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, cross-team protocol for cfDNA sample processing in diverse R&D settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cfDNA studies.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability across laboratories.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cfDNA-driven programs.
Implementation Considerations
- Requires basic laboratory expertise and adherence to biosafety protocols.
- Needs standard centrifugation and cold storage infrastructure.
- Demands rigorous sample labeling and time-tracking for cross-team standardization.
- Adaptable to various nucleic acid and protein applications in plasma and serum.
- Sample quality is limited by hemolysis and processing time constraints as specified.
