Name: 안지오텐신 II의 마우스 모델에서 중앙 정맥 카테터에 의한 약물 치료 유도 복부 대동맥류 및 3D 초음파에 의한 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 학습하세요 복부 대동맥류 유도 및 3D 초음파 모니터링 방법을 ApoE 결핍 마우스에서. 중앙 정맥 카테터를 이용한 약물 치료 시스템으로 혈관류 확장을 효과적으로 관찰하고 약물 효능을 평가하는 완전한 실험 워크플로우를 제공합니다.

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동물 실험에 도움을 주신 Podesser교수님과 Ellmeier 교수님의 팀(비엔나 의과대학 의과대학 생물의학 연구 및 실험실 동물 사육 및 축산을 위한 핵심 시설)에 감사드립니다. AAA 삼색 염색은 Monika Weiss와 Peter Petzelbauer 교수 (비엔나 의과 대학 피부과 학과)가 친절하게 수행했습니다. 이 연구는 오스트리아 과학 기금 [SFB 프로젝트 F 5409-B21]의 지원을 받았습니다. Marc Bailey는 British Heart Foundation [FS/18/12/33270]의 지원을 개인적으로 받고 있습니다.

동물 실험은 지역 윤리위원회와 오스트리아 과학부 (BMWFW-66.009/0355-WF/V/3b/2016)의 승인을 받았으며 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 유럽 지침 2010/63/EU와 오스트리아 동물 실험법 2012을 준수했습니다. ≥15 % 체중 감소, 음식 및 / 또는 수분 섭취 피하기, 활동 감소 (운동 저하증) 또는 운동 장애 또는 통증 / 증상 관리에도 불구하고 장기간의 흔들림, 긁힘, 호흡 곤란 또는 구부러진 자세. 필요한 경우, 동물을 깊은 마취, 즉 케타민 (약 100 mg / kg)과 자일라진 (약 5 mg / kg)의 과다 복용 칵테일 또는 자궁 경부 탈구로 안락사시킵니다. 외과 적 절차의 경우 무균 기술과 멸균 / 깨끗한 장갑이 전체적으로 사용됩니다.
1. 펌프 이식
<ol><li>마취<ol><li>ApoE 결핍 마우스(B6.129P2-Apoetm1Unc/J)를 정상 식단에 유지하고, 바람직하게는 인간 질병에서 남성 우세를 나타내기 위한 실험에 12-14주령의 수컷 동물을 포함시킨다3.</li>
		<li>수술 1일 전(d-1, pre-OP), 제조자의 프로토콜에 따라 마우스 중량에 따라 원하는 농도의 안지오텐신 II로 삼투압 펌프를 준비하고 채우고, 펌프를 37°C에서 하룻밤 동안15개의 식염수로 인큐베이션한다. 예: 25g 마우스의 경우, 1000ng/kg/min 전달 속도와 0.25μL/h 펌프 속도를 갖춘 삼투압 펌프( 재료 표 참조)를 사용하여 28일 동안 300μL의 식염수(Ang-II의 1500ng/h를 전달하기 위한 6000ng/μL 농도)에 Ang-II 1.8mg을 용해시킵니다. 무딘 충전 바늘로 용액을 펌프에 적재 한 다음 흐름 중재자를 삽입하여 펌프를 닫으십시오.</li>
		<li>마우스를 무의식이 될 때까지 2 L/min O2와 혼합된 3%-4% 이소플루란의 마취 챔버에 놓는다. 마우스를 경향이있는 위치의 가열 테이블 (37 °C)로 옮기고 코 콘을 통해 이소플루란 마취를 1.8 % -2 %로 유지하십시오.</li>
		<li>건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 눈 윤활제를 바르십시오.</li>
		<li>마우스에 10 μL/g의 식염수에 2.5% 부프레노르핀을 피하 주사하고 발가락 꼬집음으로 마취 깊이를 확인합니다.</li>
		<li>마우스의 왼쪽 상단에 있는 작은 부분을 어깨 뼈 위로 다시 면도합니다. 면도 부위의 소독을 위해 10 % (w / v) 포비돈 요오드 용액을 바르십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>펌프 삽입 (5-7 분, 현미경없이 수행)<ol><li>마우스가 발가락 꼬집음으로 완전히 마취되었는지 확인하고 중추와 왼쪽 견갑골 선 사이의 메스로 등 위쪽의 피부에 1cm 횡단 절개를하십시오.</li>
		<li>포셉으로 피부를 잡고 무딘 곡선 가위를 사용하여 왼쪽 뒷다리 쪽으로 밀어 피하 주머니를 만듭니다. 가위를 열고 열린 가위를 컷에서 꺼내 반복하여 주머니를 넓히십시오.</li>
		<li>펌프를 꼬리쪽으로 유동 중재자와 함께 주머니에 부드럽게 삽입하십시오 (절개 부위에 의한 Ang-II 방출의 잠재적 간섭을 최소화하기 위해). 참고 : 포켓은 펌프 삽입을 위해 충분히 넓을뿐만 아니라 피부가 펌프 주위에 단단하지 않아야하며 최적의 상처 치유를 위해 펌프와 절개 부위 사이에 적어도 5mm가 있어야합니다.</li>
		<li>4-0 개의 흡수 가능한 중단 봉합사로 상처를 닫으십시오.</li>
		<li>마우스에 10 μL / g의 마우스를 피하로 식염수에 10 % 포도당을 주사하십시오.</li>
		<li>포비돈 요오드 상처 스프레이를 닫힌 상처에 바르고 마우스가 가열 램프 아래에서 의식을 회복 할 수있게 한 다음 수술 후 3 일 동안 200 mL의 식수에 7.5mg의 피리트라 미드 (연장 된 통증 관리를 위해)와 20 mL의 5 % 포도당으로 케이지로 돌려 보내십시오.</li>
		<li>하루에 여러 번 마우스에서 통증이나 고통의 징후가 있는지 확인하십시오. 참고 : 대동맥 파열은 20 % -40 % 비율로 발생하며 주로 수술 후 처음 3-10 일 이내에 발생하기 때문에 빈번한 동물 모니터링을 통해 장기간의 심한 통증이나 고통의 위험을 최소화해야합니다. 임박한 파열의 주요 징후는 그룹과의 분리, 구부러진 자세, 이동성 감소 (뒷다리 마비의 정도까지), 취급 중 감소 또는 무반응이 포함됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 경정맥 카테터 삽입
참고 :이 수술 절차에는 8x-10x 배율의 현미경이 필요합니다.
<ol><li>혈관 접근 시스템 ( 재료 표 참조)을 사용하여 3Fr 측면을 원하는 길이 (실리콘 앵커 전에 ∼5-7 mm)로 절단하고 카테터를 혈관 액세스 시스템 (VAS)의 22 G 금속 커넥터 위로 밀어 넣어 카테터를 적어도 3 mm 겹침으로 준비하십시오. 포트에 보호하기 위해 버튼에 알루미늄 캡을 놓습니다.</li>
	<li>1-1.5cm 길이 6-0 실크 합자를 준비하십시오.</li>
	<li>마우스를 무의식이 될 때까지 2 L/min O2와 혼합된 3%-4% 이소플루란의 마취 챔버에 놓는다.</li>
	<li>마우스를 수핀 위치의 가열 테이블(37°C)로 이동시키고, 코콘을 통해 이소플루란 마취를 1.8%-2%로 유지한다.</li>
	<li>건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 눈 윤활제를 바르십시오.</li>
	<li>마우스에 10 μL/g의 마우스를 피하로 식염수에 2.5% 부프레노르핀으로 주사한다.</li>
	<li>복부 측면과 위쪽 뒤쪽의 오른쪽에있는 목의 오른쪽에서 모피를 면도하십시오 (왼쪽에는 이식 된 삼투 펌프가 있습니다).</li>
	<li>면도 부위의 소독을 위해 포비돈 - 요오드 용액을 바르십시오.</li>
	<li>마우스가 발가락 꼬집음으로 완전히 마취되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>경정맥 준비 (5-10 분, 현미경으로 수행)<ol><li>오른쪽 쇄골 위로 목의 오른쪽에서 0.5cm 횡단 supraclavicular 피부 절개를하십시오.</li>
		<li>무딘 미세 외과 핀셋을 사용하여 결합 조직과 지방을 분리하여 외부 경정맥을 노출시킵니다. 지방의 작은 혈관을 찢어 버리지 마십시오.</li>
		<li>가슴 근육에 가까운 혈관의 적어도 5mm를 분리하십시오.</li>
		<li>무딘 구부러진 마이크로 핀셋을 사용하여 정맥 아래의 조직을 해부하고 6-0 합자 중 2-3 개를 통과시킵니다. 참고: 관심 영역에서 측면 가지가 확인되면 합자를 측면 가지에 인과적으로 삽입하거나 측면 분기를 6-0 합자로 분리하고 묶어서 영구적으로 결찰해야 합니다.</li>
		<li>합자를 집어 넣고 식염수 한 방울을 사이트에 넣으십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>버튼 이식 (5-7 분, 현미경없이 수행)<ol><li>마우스를 뒤집어 경향이있는 위치에 놓습니다. 발가락 꼬집음으로 마취의 깊이를 확인하고 포비돈 요오드 용액을 적용하여 면도 부위를 소독하십시오.</li>
		<li>중추와 오른쪽 견갑골 선 사이의 메스로 등 위쪽에 1cm 시상 절개를하십시오.</li>
		<li>무딘 곡선 가위를 사용하여 둔한 해부로 절개 부위 주변의 VAS 크기보다 약간 큰 원형 포켓을 만드십시오.</li>
		<li>무딘 곡선 가위를 사용하여 가위를 약간 연 다음 열린 가위를 당겨 목의 복부 절개 쪽으로 오른쪽 어깨 위로 두개골로 터널링하고 더 밀어 넣을 때 동작을 반복하십시오. 참고: 이 단계에서는 마우스를 왼쪽으로 켤 수 있습니다.</li>
		<li>터널이 복부 절개에 도달하면 복부에서 등쪽 절개까지 수술 클램프를 통과하십시오.</li>
		<li>카테터의 3Fr 끝을 클램프에 부착하고 터널을 통해 카테터를 당겨 복부 목 절개에서 벗어나 VAS가 등쪽 절개에 배치되도록하십시오.</li>
		<li>VAS의 수술 펠트 디스크를 뒤쪽의 절개에 피하 삽입하십시오.</li>
		<li>카테터의 클램핑을 풀고 칼슘과 마그네슘(PBS-/-)이 없는 식염수 또는 인산염 완충 식염수로 플러시하고, 취급 도구의 포크 엔드를 사용하여 보호 알루미늄 캡을 제거한 다음 자기 끝을 사용하여 버튼을 잡고 액체가 1Fr 끝에서 누출될 때까지 해당 인젝터에 부착된 1mL 주사기로 주입합니다. 참고: 카테터 플러싱은 대안적으로 단계 2.1에서 수행될 수 있다.</li>
		<li>주머니에있는 버튼을 caudally 누르고 VAS의 플랜지 아래에있는 VAS의 펠트 디스크 위에 피부를 닫고 적어도 두 개의 4-0 개의 봉합사가 두개골로 중단됩니다. 참고: 버튼 주위의 피부에 긴장이 가해지지 않도록 하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>정맥 카테터 삽입 (7-10 분, 현미경으로 수행)<ol><li>마우스를 다시 수핀 위치로 뒤집고, 발가락 꼬집음으로 마취 깊이를 확인한 다음 절단 부위에 식염수 한 방울을 추가하십시오.</li>
		<li>카테터와 경정맥 주위의 첫 번째 합자를 가능한 한 멀리 2-3 노트로 묶어 정맥을 리게이트하고 카테터를 외부에 고정시킵니다. 두 번째 합자를 가슴 근육에 가능한 한 가깝게 이동하십시오.</li>
		<li>카테터를 필요한 길이로 짧게 하여 카테터의 ~3-5 mm가 정맥에 들어오도록 대각선 각도로 마이크로 가위로 절단하여 날카로운 끝을 만듭니다.</li>
		<li>식염수로 채워진 1 mL 주사기에 부착된 27 G 바늘을 사용하여 정맥에 구멍을 뚫고, 고정된 두개골 합자를 당기고 바늘을 정맥에 평행하게 밀어냄으로써 정맥에 구멍을 뚫는다. 참고: 역류에서 혈액이 정맥에서 누출되면 면봉을 사용하여 출혈이 멈출 때까지 압력을 가하십시오.</li>
		<li>고정 된 두개골 합자를 당기고 구부러진 핀셋을 사용하여 카테터를 정맥으로 밀어 넣음으로써 동일한 방식으로 카테터를 정맥에 삽입하십시오. 카테터가 정맥과 정렬 될 때까지 카테터를 밀어 넣으십시오.</li>
		<li>카테터가 정맥에 삽입되는 부위에 두 번째 합자를 2-3 노트로 묶고 혈액 누출이 없는지 확인하십시오. 세 번째 합자 및 일부 국소 지방 조직이 카테터를 추가로 고정하는데 사용될 수 있다.</li>
		<li>마이크로 가위로 두 합자의 과도한 끝을 자르고 식염수 한 방울을 넣으십시오.</li>
		<li>4-0 흡수 가능한 중단 봉합사로 피부를 닫으십시오.</li>
		<li>마우스에 10 μL / g의 마우스를 피하로 식염수에 10 % 포도당을 주사하십시오.</li>
		<li>취급 도구의 포크 끝을 사용하여 원하는 부피의 억제제 또는 PBS / 식염수를 마우스에 주입하여 보호 알루미늄 캡을 제거한 다음 자기 끝을 버튼으로 잡고 인젝터에 부착 된 1 mL 주사기로 주입하십시오. 참고: 주입하기 전에 액체 한 방울이 나올 때까지 플런저를 눌러 주입 주사기에 공기 또는 기포가 없는지 확인하십시오. VAS의 인젝터와 주사기를 분리하면서 플런저에 양압을 유지하여 카테터 팁으로 혈액을 끌어 당겨 카테터 막힘을 일으키는 것을 방지하십시오.</li>
		<li>닫힌 상처에 포비돈 요오드 상처 스프레이를 바르고 마우스가 가열 램프 아래에서 의식을 회복 할 수있게 한 다음 수술 후 3 일 동안 200 mL의 식수에 7.5mg의 피리트라미드 (연장 된 통증 관리를 위해)와 20 mL의 5 % 포도당으로 케이지로 돌려 보내십시오.</li>
		<li>하루에 여러 번 마우스에서 통증이나 고통의 징후가 있는지 확인하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>매일 주사 (<5 분)<ol><li>매일 주사를 위해, 마우스를 의식이 없고 호흡 속도가 느려질 때까지 2 L/min O2와 혼합된 3%-4% 이소플루란의 마취 챔버에 놓은 다음, 단계 2.12.10에서와 같이 주사한다. 카테터가 더 이상 정맥에 삽입되지 않았 음을 나타내는 주사 후 부종의 징후가 있는지 목에 확인하십시오. 또한 카테터가 가려지면 주사가 불가능합니다. 참고 : 10 μL / g의 마우스 체중 1 일 주사는 마우스에 의해 잘 견뎌냅니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3.3D 초음파
<ol><li>초음파 이미징 시스템, 가열 테이블 및 겔 워머를 준비하고, 트랜스듀서를 시스템에 부착하고, 횡방향 위치(즉, 마우스 척추에 수직)로 스테이지 위에 설정합니다.</li>
	<li>초음파 소프트웨어를 사용하여 30dB, 9.0mm의 이미지 깊이 및 8.08mm의 이미지 너비를 얻도록 설정을 조정합니다.</li>
	<li>마우스를 무의식이 될 때까지 2 L/min O2와 혼합된 3%-4% 이소플루란의 마취 챔버에 놓는다. 마우스를 수핀 위치의 가열 테이블(37°C)로 이동시키고, 코콘을 통해 이소플루란 마취를 1.8%-2%로 유지한다.</li>
	<li>건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 눈 윤활제를 바르십시오.</li>
	<li>마우스 복부에 모피를 면도하십시오. 필요한 경우 제모 크림을 1 분 동안 바른 다음 젖은 거즈로 닦아내고 닦으십시오.</li>
	<li>무대의 네 개의 심전도 (ECG) 전극 각각에 전극 젤 한 방울을 추가하고 마우스 사지를 테이프로 붙입니다.</li>
	<li>마우스의 복부에 따뜻한 초음파 젤을 뿌리고 송신기를 내려 동물과 접촉하게하십시오.</li>
	<li>대동맥을 원형 빠른 맥동 혈관으로 식별하십시오. 참고 : 열등한 정맥 카바 (IVC)는 대동맥 옆에 위치하며, 프로브를 단단히 누르면 대동맥이 안정적으로 유지되는 동안 IVC가 압축됩니다. 분석된 용기가 IVC가 아닌 대동맥이라는 확인은 맥파 도플러(PW-mode)를 사용하여, 65°의 각도로 얻을 수 있다. 대동맥은 높은 맥파 속도를 가질 것입니다.</li>
	<li>왼쪽 신장 동맥을 찾아 관심 영역 (즉, suprarenal 대동맥)에 간섭이 없는지 확인하기 위해 12mm까지 수동으로 두개골로 영역을 조사하십시오. 왼쪽 신장 동맥으로 돌아간 다음 왼쪽 신장 동맥에서 두개골로 프로브를 6mm로 설정합니다. 참고: 3D 초음파는 지정된 길이(즉, 12mm)를 원점으로부터 중간 정도(6mm)부터 시작하여 지정된 길이(12mm)까지 두개골로 기록합니다. 간섭에 대한 문제 해결 단계에는 트랜스듀서를 약간 누르고, 트랜스듀서를 들어올린 다음 다시 내리고, 초음파 젤을 더 많이 적용하고, 스테이지의 각도를 기울이는 작업이 포함됩니다.</li>
	<li>3D 초음파 수집<ol><li>호흡 게이팅을 25% 지연 및 50%의 윈도우로 설정하고, ECG 트리거(T1)를 50 ms로 설정한다(대동맥의 피크 수축기 확장을 기록하기 위해). 참고: 호흡 게이팅은 호흡률과 운동 아티팩트가 제거되도록 하기 위한 노력에 따라 각 동물에 대해 최적화될 수 있습니다.</li>
		<li>3D 옵션에서 스텝 크기가 0.076mm인 스캔 거리를 11.96mm로 설정하면 157프레임이 생성됩니다.</li>
		<li>이 프로그램은 약 1-2 분 안에 157 프레임을 자동으로 획득합니다. 스크롤하여 이미지 품질을 확인하고 하위 수준인 경우 반복한 다음 이미지를 저장합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>2D 직경 수집<ol><li>호흡 게이팅 및 ECG 트리거를 끄고 suprarenal 대동맥의 12 mm 스트레칭에서 가장 큰 직경을 가진 영역을 수동으로 찾습니다.</li>
		<li>B 모드 이미지(16)를 획득한다.</li>
		<li>또한 트랜스듀서를 이동하지 않고 동일한 사이트에서 시스템의 표준 설정을 사용하여 ECG 게이트 킬로헤르츠 시각화(EKV) 이미지를 획득합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>스캔 종료<ol><li>복부에서 초음파 젤을 닦아내고 마우스를 케이지로 되돌립니다. 마우스가 완전히 복구될 때까지 마우스를 모니터링합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 초음파 분석
<ol><li>볼륨 분석<ol><li>분석 소프트웨어에서 3D 모드 이미지를 열고 이미지 처리 메뉴에서 3D로로드를 누르면 157 개의 2D 프레임이 3D 이미지 (예 : 큐브)로 컴파일됩니다.</li>
		<li>볼륨 측정 메뉴에서 병렬 및 회전 방법을 선택하면 소프트웨어가 3D 이미지를 단일 창에 표시합니다.</li>
		<li>볼륨(Volume)에서 시작(Start)을 누르고 첫 번째 점을 클릭하여 추가하고 커서를 대동맥 주위로 이동한 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 윤곽선을 완료하여 대동맥의 내벽 주위에 첫 번째 윤곽선을 그립니다.</li>
		<li>9-10프레임(0.75-1mm)을 건너뛴 다음 같은 방식으로 다른 윤곽선을 그립니다. 마지막 프레임에 도달할 때까지 이 단계를 반복합니다. 이로 인해 16-17 개의 윤곽선이 발생합니다. 참고: 첫 번째 프레임과 마지막 프레임에는 12mm 이상의 정확한 볼륨을 계산하기 위해 윤곽선이 그려져 있어야 합니다.</li>
		<li>메뉴에서 첫 번째 윤곽선을 선택하고 구체화를 선택합니다. 이것은 선박 벽에 선을 가깝게 맞추기 위해 가장자리 감지 알고리즘을 시작합니다. 윤곽선의 점을 새 위치로 드래그하여 윤곽선이 대동맥의 내벽 가장자리를 정확하게 정렬하도록 합니다. 참고: Ang-II 모델에서는 교내 혈전이 존재할 수 있습니다. 이것이 이 모델의 일반적인 특징이기 때문에, 부피 측정은 혈전을 포함해야 한다.</li>
		<li>모든 윤곽선을 구체화하고 마침 을 눌러 분석을 저장합니다. 계산된 볼륨이 왼쪽 하단 모서리에 표시됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>직경 분석 참고: 직경 측정은 내벽, 외벽에서 외벽 또는 내벽에서 외벽으로 수행될 수 있지만 모든 측정에 대해 일관성이 있어야 합니다. 그러나 Ang-II 모델에서는 교내 혈전이 존재할 수 있으며 이는 분석에 포함되어야합니다.<ol><li>3D 모드 이미지에서: 157개의 프레임을 평가하여 육안 검사로 최대 직경을 식별합니다. 그런 다음 측정 메뉴에서 선형을 선택하고 대동맥을 가로 질러 여러 선을 그려 가장 큰 지름 을 결정합니다.</li>
		<li>B 모드 또는 EKV (ECG 게이트 킬로 헤르츠 시각화) 이미지에서 : 시네 루프에서 육안 검사를 통해 대동맥의 최대 팽창 (수축기)을 식별하십시오. 그런 다음 측정 메뉴에서 선형을 선택하고 대동맥을 가로 질러 여러 선을 그려 가장 큰 지름 을 결정합니다. 참고: ECG는 심장 주기를 결정하는 데 사용할 수 있지만 시각적 식별은 정확한 결과를 산출합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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Ang-II 모델은 낮은 기술적 요구와 인간 질병 3,6과 유사한 특정 기능으로 인해 AAA의 가장 일반적으로 사용되는 마우스 모델 중 하나입니다. 수술 시간은 동물 당 약 10 분이며, 피하 주머니가 충분히 넓고 절개 부위에서 멀리 떨어진 동물의 등에 낮게 배치되어 상처 치유를 방해하지 않도록 피하 펌프 이식은 마우스에 의해 잘 견뎌냅니다. 펌프 주위의 피부가 꽉 조이면 조직 자극이 발생하여 염증과 딱지가 생기고 삼투압에 의한 펌프의 방출 메커니즘을 방해 할 수 있습니다. 동물 희생 시에 펌프에 남아있는 Ang-II의 부피를 측정하면 Ang-II가 28일 동안 성공적으로 방출되었는지에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
Ang-II 모델은 최근 대동맥류 및 해부 진행을 연구하는 데 적합하도록 제안되었으며, 이는둘 다 6의 인간 특징과 유사함을 나타내기 때문입니다. 중요한 것은 대동맥 확장을 차단하고 리모델링에 영향을 미치기 위해 약물 후보를 테스트하는 것이 현재의 임상 수요와 일치한다는 것입니다. 우리의 실험 환경에서, 동맥류 형성에 대한 컷오프는 마우스에서 절대 대동맥 크기의 자연적인 변화를 설명하는 기준선과 관련하여 8 일째에 125 % 부피 성장을 기준으로 치료 시작 전에 정의되었습니다. 역치 및 시점은 조직학에서 대동맥 벽 파괴를 확인한 초기 시간 과정 (데이터는 나타내지 않음)에서 파생되었으며 카테터 이식 전에 35 % 파열 및 56 % 관찰 된 AAA를 초래했습니다. 확립 된 질병의 최소 역치가 연구 포함을 위해 적용되었지만, 높은 수준의 초기 대동맥 확장이 또한 실험 적용성을 제한 할 수 있다는 것이 나중에 관찰되었습니다. 8일째까지 >200% 부피로 급속히 진행된 동맥류는 55%의 사례에서 그 크기를 넘어 더 이상 성장하지 않았다(그림 1D). 이것은 실험적 설계 및 샘플 크기 계산 중에 고려되어야하며, 이는 치료의 실제 효과를 가릴 수 있기 때문입니다. 이 모델의 또 다른 측면은 빈번한 대동맥 파열 (흉부 또는 복부)으로, 20 % -40 %의 비율로 발생하며 대부분 Ang-II 펌프 이식 후 처음 10 일 이내에발생합니다 3,18,19. 따라서 치료 시작을 9 일째로 선택함으로써 확립 된 동맥류의 높은 비율이 달성되었고, 경정맥 카테터 삽입은 본질적으로 실험이 끝날 때까지 생존 할 것으로 예상되는 쥐 (역사적인 대조군의 3/24 마우스 만 9 일째에 파열됨)에 대해 수행되어 시간과 노력을 절약하고, 및 비용.
심한 상태를 구성하는 대동맥 파열 외에도 혈관 접근 버튼과 삼투 펌프가있는 카테터의 동시 이식은 마우스에 의해 잘 견뎌 냈으며 수술에서 회복 된 후 이동성이나 행동에 눈에 띄는 영향을 미치지 않았습니다. 경정맥 카테터 삽입 절차는 훈련 된 연구원에게 약 30 분이 소요됩니다. (이소플루란) 마취에 노출되는 지속 기간은 최소한으로 유지되어야하며, 호흡 억제를 예방하기 위해 동물 호흡 속도를 면밀히 모니터링해야하며, 이는 해결되지 않으면 치명적인 결과를 초래할 수 있습니다20. 카테터 삽입을 위해 경정맥에 구멍을 뚫은 후 혈액 손실은 - 중요한 경우 동물 사망으로 이어짐 - 경정맥이 두개골로 적절하게 결찰되지 않거나 혈관의 고립 된 영역으로 먹이는 측면 가지가 닫히지 않을 때 잠재적으로 발생할 수 있습니다. 이 경우 혈액 누출이 느려지거나 멈출 때까지 면봉으로 압력을 가한 다음 카테터 삽입 및 결찰을 가능한 한 빨리 수행해야합니다. 콜라겐 상처 드레싱의 작은 조각은 지혈을 돕기 위해 일시적으로 활용 될 수 있습니다.
카테터 개통성은 카테터가 정맥이나 접근 버튼에서 분리되어 약물이 피하 공간으로 누출되는 부적절한 약물 전달을 초래하기 때문에 가장 중요한 요소 중 하나입니다. 카테터와 금속 연결기 사이의 최소 3mm 겹침에 대한 제조업체의 권고에 따라, 버튼 측에서 카테터 분리의 한 사례 (버튼의 절개 부위에서 누출 된 주입 된 액체로 표시됨)만이 3 년 동안 기록되었으며,이 모델 (2020-2021, n = 73)은 상처를 열고 수술시 연결을 다시 확립하여 고정되었습니다. 또한, 우리의 역사적인 PBS 대조군 (2/21)에서 약 10 %의 카테터 개통 실패율은 카테터 폐색 (주입을 불가능하게 함), 정맥으로부터의 카테터 분리 (주사 중 목에 명백한 붓기로 나타남) 또는 상처 치유 합병증으로 인해 경험되었습니다. 이러한 문제는 자해 부상, 즉 마우스 긁힘 또는 물기와 관련이있을 수 있습니다. 특히, 상처 치유를 방해하는 약물 치료는 실패율을 높일 수 있습니다. 개통률을 향상시키기 위한 문제 해결 단계에는 정맥에 삽입된 카테터의 길이를 늘리고, 합자가 카테터와 정맥 주위에 단단히 매듭지도록 보장하고, 주입하는 동안 단계 2.12.10.에 설명된 대로 제조업체의 권고에 따라 양압 기술을 적용하는 것이 포함됩니다. 카테터 개통성은 또한 동물 희생시에 현미경으로 해부 및 육안 검사를 통해 검증되어야합니다. 참고로, 주입 된 약물 용액의 일일 부피는 신중하게 고려되어야합니다. 혈장 부피가 혈압을 조절하기 때문에 주사량은 AAA 확장에 영향을 미칠 수 있으므로 통제 동물은 담체 부피로 가짜 절차를 받아야합니다. 우리의 경험 (및 공개되지 않은 관찰)에 기초하여, PBS의 일일 최대 250 μL의 양은 잘 용인되는 것으로 보인다. 마지막으로, 펌프 이식과 유사하게, 이식된 혈관 접근 버튼 주위에 피부 자극이 발생할 수 있다. 탈생 또는 괴사 성 조직을 동반 한 염증이 관찰되면 생존 할 수없는 조직을 제거하여 상처 탈지가 수행되어야하며 (괴사 조직은 종종 상처에서 자연적으로 분리됩니다), 필요한 경우 피부를 봉합해야합니다. 염증과 괴사가 광범위하다면 동물의 복지와 인도적 종점은 지침에 따라 고려되어야합니다.
삼투압 펌프 및/또는 VAS의 단일 및 이중 등쪽 이식은 초음파 신호를 방해하거나 초음파 단계에서 적절한 위치에 마우스를 고정시키는 것을 방해하지 않았습니다. 부피 측정을 위해 대동맥의 3D 이미지를 렌더링하기 위해 12mm 이상의 157 프레임을 자동으로 획득하는 것은 간단하고 빠른 절차(14)이며, 이는 대동맥이 관심 영역에 대한 간섭을 방지하도록 보장하기만 하면 된다. 이러한 맥락에서 한 가지 함정은 간섭의 이미지를 지우려고 시도하는 동안 변환기에 너무 많은 압력을 가하는 것인데, 이는 복부 대동맥의 두개골 끝의 이미지가 기록 될 때 호흡 속도가 갈비뼈의 압축에 의해 영향을받는 경우 자동화 된 측정을 방해 할 수 있습니다. 직경은 전통적으로 작업자가 초음파 분석을 수행하는 동안 최대 직경의 영역을 수동으로 검색하는 B 모드를 사용하여 획득 한 이미지에서 측정됩니다. B 모드 이미지의 발전은 EKV 이미지로, 작은 대동맥 동작을 해결하여 맥동하는 대동맥의 고품질, 느려진 이미지를 생성 할 수 있습니다. 또한, 최대 대동맥 직경은 획득 된 3D 프레임에서 결정될 수 있으며, 157 개의 이미지는 수축기에서 찍은 대동맥에 대한 포괄적 인 개요를 제공합니다 (ECG 트리거 설정으로 인해).
결론적으로, 제시된 컴파일된 프로토콜은 Ang-II 유도 AAA의 마우스 모델에서 i.v. 약물 투여를 위한 안정적이고 재현 가능한 워크플로우를 제공하고 3D 초음파에 의한 대동맥 크기를 모니터링한다. 모니터링 및 수술의 시점은 특정 요구에 맞게 조정할 수 있으며, 경정맥 카테터 삽입은 i.v. 주사를 통해 특정 물질의 전달을 요구하는 모든 실험 설정에 대해 별도로 수행 할 수 있습니다. VAS는 카테터 잠금 용액이 응고를 방지하기 위해 사용되는 경우 반복 혈액 샘플링에 선택적으로 사용될 수 있습니다. 기술된 3D 초음파 절차는 AAA의 엘라스타제 또는CaCl2-기반 마우스 모델에서 급성 모욕시 동맥류가 발생하는 infrarenal 대동맥을 측정하도록 적응될 수 있다. 3D 초음파 수집은 영향을받는 대동맥 영역과 동맥류 형태에 대한 개요를 제공하는 이점을 가지고 있지만, 이미지 수집은 더 많은 시간이 걸리고 따라서 비용 집약적 일 수 있습니다. 인정되어야 하는 프로토콜의 또 다른 한계는 동물이 정맥내 주사를 위해 간략하게 마취될 필요가 있는 반면, 복강내 투여는 일반적으로 의식이 있는 마우스에 대해 수행되어야 한다는 것이다.

복부 대동맥류 (AAA)는 궁극적으로 파열과 환자 사망으로 이어질 수있는 대동맥벽의 염증 및 조직 파괴 과정으로 인한 혈관의 병리학 적 팽창입니다. 외과 적 AAA 수리에서 상당한 업적에도 불구하고, 동맥류 확장의 진행을 차단하고 잠재적으로 파열의 위험을 낮추는 보수적 인 약물 치료는 현재까지 누락되었습니다. 동물 모델은 질병의 유발 요인과 중재자를 밝히고 치료에 대한 새로운 접근법을 테스트하기 위해 개발되었습니다. AAA의 마우스 모델은 널리 적용되고 인간 조직으로부터의 상이한 관찰을 포괄한다. 그들의 pathomechanistic 차이로 인해, 종종 분자 / 경로의 특정 기능 또는 잠재적 인 치료 약물 1,2의 효능을 조사하기 위해 하나 이상의 모델이 적용됩니다. AAA 유도의 가장 일반적으로 사용되는 모델 중에는 아포리포단백질 E 결핍(ApoE KO) 마우스3에서의 안지오텐신-II(Ang-II) 투여가 있는데, 이는 급성 모욕으로부터 대동맥벽 4,5에 이르는 동맥류 형성에 의존하는 모델에 비해 더 만성-유사 병인을 갖는다. 따라서, Ang-II 모델은 질환 진행을 모니터링하는데 특히 적합한 것으로 보이며, 최근에는 대사 및 염증 반응과 관련하여 인간 AAA 질환과 매우 유사한 것으로 나타났다6. 특히, Ang-II 모델은 AAA 발달뿐만 아니라 흉부 동맥류 형성뿐만 아니라 교내 혈전 형성을 통한 대동맥 박리를 특징으로합니다.
질병의 개시를 막기보다는 이미 확립된 AAA의 진행을 표적으로 하는 것을 목표로 하는 치료법은 치료(7,8)를 필요로 하는 기존 병태를 갖는 환자로서 더 높은 번역 가치를 가질 수 있다. 비교 가능한 실험 설계의 경우, AAA 유도 전후에 대동맥 크기를 모니터링하여 질병 발생의 역치를 정의하고 잠재적으로 마우스를 치료 그룹으로 계층화해야합니다.
약물 투여 방식은 각 물질의 흡수 및 안정성에 달려 있습니다. 복강내(i.p.) 주사는 적용의 용이성, 마취제를 필요로 하지 않으며, 주사 부피의 제약의 부족으로 인해 가장 자주 이용된다(9). 그러나 약동학은 투여 경로를 선택할 때 i.p.가 주로 간 문맥 순환을 통해 흡수되고 순환에 도달하기 전에 간 대사를 겪을 수 있기 때문에 첫 번째 통과 효과10에 따라 혈장 농도가 달라질 수 있으므로 고려해야합니다. 정맥 내 (i.v.) 주사는 물질의 가장 높은 생체 이용률을 산출하고, 반복적 인 i.v. 접근의 도전은 매일 투여를위한 카테터 및 혈관 접근 포트의 사용에 의해 회피 될 수있다 11,12,13. AAA 설정과 관련하여, 순환에서의 약물 분포는 정의된 농도에서 직접적인 동맥류 노출을 용이하게 한다.
여기에서는 삼투압 펌프의 피하 이식을 통해 Ang-II 마우스 모델에서 AAA를 유도하기 위한 워크플로우를 설명하고, 외부 경정맥에 삽입된 카테터에 연결된 혈관 액세스 포트를 통한 일일 i.v. 약물 치료뿐만 아니라 두 개의 등쪽 임플란트가 있음에도 불구하고 3D 초음파(14 )를 통한 동맥류 크기의 모니터링을 위해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>4-0 Polysorb 봉합사</td><td>Covidien</td><td>GL-46-MG</td><td>꼰 흡수성 봉합사 CV-23 테이퍼</td></tr><tr><td>6-0 실크 봉합사</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td>PERMA-HAND Silk</td></tr><tr><td>ALZET 2004 삼투압 펌프</td>스 <td>DURECT Corp</td><td>298</td><td>삼투압 미니 펌프</td></tr>스 <tr><td>Angiotensin-II</td><td>Bachem</td><td>4006473.0100</td><td>Angiotensin II 아세테이트</td></tr><tr><td>Aquasonic Clear 초음파 투과 젤</td><td>Parker Labs</td><td>PUSG-0308</td><td>초음파 젤</td></tr><tr><td>베타도나 상처 스프레이</td><td>Mundipharma</td><td></td><td>상처 소독 스프레이(포비돈-요오드 스프레이)</td></tr><tr><td>베타이소도나 용액</td><td>Mundipharma</td><td>15973</td><td>상처 소독 용액(포비돈-요오드 용액)</td></tr><tr><td>마우스 대퇴 정맥/동맥용 카테터</td><td>Instech Laboratories Inc</td><td>C10PU-MFV1301</td><td>1-3Fr, 10.5cm, 칼라 @1.2cm. 22G</td></tr><tr><td>제모 크림</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>취급 도구</td><td>Instech Laboratories Inc</td><td>VABMG</td><td>자기 마우스 처리 도구 혈관 접근 버튼</td></tr><tr><td>HYLO NIGHT Eye Oinment</td><td>URSAPHARM</td><td>538922</td><td>눈 윤활제 크림</td></tr><tr><td>다양한 크기의</td><td></td><td></td> 바늘 및 주사기 <td>1mL 및 5mL 주사기, 27G 및 30G 바늘</td></tr><tr><td>Olympus SZ51 스테레오 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>해부 및 검사 현미경</td></tr><tr><td>PinPort 인젝터</td><td>Instech Laboratories Inc</td><td>PNP3M-50</td><td>인젝터 혈관 접근 버튼</td></tr><tr><td>보호 알루미늄 캡</td><td>Instech Laboratories Inc</td><td>VABM1C</td><td>자기 1 채널 마우스 용 보호 알루미늄 캡 VAB</td></tr><tr><td>Signa 전극 초음파 젤</td><td>Parker Labs</td><td>PE-1560</td><td>전극 gel</td></tr><tr><td>소형 전기 면도기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surigcal 및 microsurgical 장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suprasorb C</td><td>Lohmann & Rauscher</td><td>20482</td><td>콜라겐 상처 드레싱</td></tr><tr><td>혈관 접근 버튼(VAB)</td><td>Instech Laboratories Inc</td><td>VABM1B/22</td><td>마우스용 혈관 접근 버튼, 마그네틱, 1채널 22G, 인젝터</td></tr><tr><td>Vevo 3100 이미징 시스템</td><td>FUJIFILM VisualSonics Inc</td><td>51073-51</td><td>초음파 시스템</td></tr><tr><td>Vevo Lab 5.6.1 소프트웨어</td><td>FUJIFILM VisualSonics Inc</td><td></td><td>초음파 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Vevo MX550D 변환기</td><td>FUJIFILM VisualSonics Inc</td><td></td><td>Vevo 3100 시스템용 선형 어레이 변환기</td></tr><tr><td>Vevo 마우스 취급 테이블</td><td>FUJIFILM VisualSonics Inc</td><td>11436</td><td>생리 모니터링용 마우스 가열, 마우스 코어 온도 캡처 및 ECG 패드</td></tr></tbody></table>

안지오텐신 ii의 마우스 모델에서 중앙 정맥 카테터에 의한 약물 치료 유도 복부 대동맥류 및 3d 초음파에 의한 모니터링

Drug Treatment by Central Venous Catheter in a Mouse Model of Angiotensin II Induced Abdominal Aortic Aneurysm and Monitoring by 3D Ultrasound

제약 치료 옵션이 복부 대동맥류 (AAA)의 임상 관리에서 부족하기 때문에, 동물 모델, 특히 마우스 모델은 질병 병인에 대한 이해를 증진시키고 잠재적 인 치료 표적을 식별하기 위해 적용됩니다. 이들 모델에서 AAA 성장을 차단하기 위한 신규한 약물 후보를 시험하는 것은 일반적으로 실험의 시간 과정 동안 반복적인 약물 투여를 필요로 한다. 여기에서는 AAA 유도, 장기간 치료를 용이하게하는 정맥 내 카테터의 삽입 및 3D 초음파에 의한 직렬 AAA 모니터링을위한 컴파일 된 프로토콜을 설명합니다. 동맥류는 아포리포단백질 E(ApoE) 결핍 마우스에서 안지오텐신 II 방출에 의해 유도되며, 28일에 걸쳐 삼투압 미니펌프로부터 다시 마우스 내로 피하로 이식된다. 그 후, 외부 경정맥 카테터 삽입을위한 외과 적 절차가 매일 정맥 내 약물 치료 또는 피하 혈관 액세스 버튼을 통한 반복 혈액 샘플링을 허용하기 위해 수행됩니다. 두 개의 등쪽 임플란트에도 불구하고, AAA 개발의 모니터링은 순차적 인 반자동 3D 초음파 분석에 의해 쉽게 촉진되며, 이는 실험예에 의해 설명 된 바와 같이 대동맥류 직경과 부피의 확장 및 동맥류 형태학에 대한 포괄적 인 정보를 제공합니다.

대표적인 결과는 기준선, 8일째 및 27일째에 초음파에 의해 모니터링된 바와 같은 상완동맥류의 발달 및 진행을 보여준다(도 1A). 도 1A에서 27일째 대동맥의 삼색 염색(도 1B)은 벽 해부 및 교내 혈전을 갖는 형성된 동맥류의 형태를 추가로 예시한다. 대동맥 부피 (mm3)는 12 mm14의 연신에 걸쳐 결정되었고, 최대 대동맥 직경은 EKV 이미지로부터 추가로 측정되었다. 기준선에서 8일째까지의 125% 부피 성장의 역치는 초기 동맥류 발달을 정의하기 위해 설정되었다. 2 년 (2020-2021, n = 157)에 걸쳐 수집 된 데이터에 따르면,이 컷오프에 따라 AAA를 형성하지 못한 동물의 9 %만이 AAA를 형성하지 못했습니다. 그러나, 마우스의 35%는 9일째에 카테터 이식 전에 대동맥 파열(흉부 또는 복부)을 경험하였고, 따라서 AAA 질환이 확립된 나머지 동물의 총 56%가 치료 그룹으로 계층화될 수 있게 되었다(도 1C). 참고로, 우리의 역사적인 PBS 대조군 (n = 21) 중에서 동맥류는 다양한 정도로 발전했습니다 (범위 : 128 % -314 %, 평균 199 % ± 55 % SD 대동맥 부피 증가). 중요하게도, 초기 확장과 추가 질병 진행 사이의 역관계가 관찰되었는데, 즉, 빠른 진행성 동맥류의 55%(8일째에 &gt;200% 부피 성장)는 27일째까지 더 이상 진행되지 않았고, 반면에 다른 동맥류의 80%(8일째에 &gt;125% 및 &lt;200% 부피 성장)는 실험이 끝날 때까지 계속 확장되었다(도 1D).
최근 보고된 바와 같이, 14,17에 보고된 바와 같이, 기술된 방법들은 성공적으로 확립되고, 검증되고, 구현되었으며, 예를 들어, 확립된 AAA의 진행을 차단하는 히스톤 시트룰린화 억제제 (GSK484, 호중구 세포외 트랩 형성의 억제를 위한)의 치료 효과를 문서화한다. ApoE 결핍 마우스는 28 일 동안 피하 이식 된 삼투 펌프에 의해 1000 ng / kg / min으로 Ang-II를 받았다. 동물을 8일째에 측정된 대동맥 부피를 기준으로 GSK484 (0.2 μg/g/day) 또는 PBS 처리로 1:1로 계층화하였고, 9일째에 경정맥 카테터 삽입 절차를 거쳤다. 약물 주사는 연구17이 끝날 때까지 마우스 중량의 10 μL/g의 부피로 매일 수행되었다. 도 2는 예시적인 (n=2/군) 초음파 결과(절대 및 상대적 부피 또는 직경 확장의 시간 과정)를 보여주며, GSK484 치료가 AAA 진행을 억제한 반면, 동맥류는 대조군 마우스에서 계속 확대되었음을 밝혀냈다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64124/64124fig01.jpg"> 도 1: 3D 초음파에 의해 검출된 바와 같은 Ang-II 마우스 모델에서의 AAA 형성 및 진행. (A) 상완 대동맥을 Ang-II 펌프 이식 후 기준선(BL), 8일째(d8), 및 27일째(d27)에서 3D 초음파에 의해 모니터링하였다. 부피는 3D 재구성된 이미지를 기반으로 12 mm 스트레치의 상완 대동맥(157 프레임)에 걸쳐 측정되었다. 최대 대동맥 직경은 EKV 이미지로부터 결정되었다. (b) 마우스 희생 및 장기 수집 후 27일째 대동맥의 횡단 절편의 삼색 염색. 대동맥 박리의 존재는 L1 / L2 (루멘 1 및 루멘 2)로 표시되며 교내 혈전은 A와 B에서 *로 표시됩니다. (c) 8일째에 AAA의 발생률(BL로부터 &gt;125% 대동맥 부피 증가) 및 2년에 걸쳐 수집된 데이터 세트로부터 처음 9일 이내(흉부 또는 복부) 내의 대동맥 파열(n=157). (d) PBS 대조군-처리된 마우스(n=21)에서 동맥류의 초기 빠른 형성 (BL에서 8일째까지 &gt;200% 대동맥 부피 성장) 대 적당히 성장(BL에서 8일째까지의 &gt;125% 및 &lt;200% 대동맥 부피 성장)의 8일째부터 27일째까지의 진행 빈도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64124/64124fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64124/64124fig02.jpg"> 도 2: 혈관 접근 버튼을 통해 GSK484 또는 PBS의 정맥내 주사에 의한 Ang-II 모델에서 AAA 진행을 차단하는 히스톤 시트룰린화의 억제로부터의 예시적인 결과 . (A) 대동맥 부피(mm3)는 상프레날 대동맥의 12 mm 스트레치에 걸쳐 측정된 바와 같다. (b) 기준선으로부터 계산된 대동맥 부피 성장 (BL = 100%). (C) EKV 이미지로부터 결정된 최대 대동맥 직경. (d) BL. GSK484 데이터로부터 계산된 대동맥 직경 성장을 이전에 발표된 연구17로부터 추출하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64124/64124fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 반복적인 약물 치료를 위해 경정맥 카테터를 갖는 혈관 접근 포트의 아포리포단백질 E(ApoE) 결핍 마우스에서 안지오텐신 II 방출에 의해 복부 대동맥류를 유도하기 위한 삼투압 펌프의 연속 이식을 기술한다. 3D 초음파에 의한 동맥류 발달 모니터링은 등쪽 임플란트에도 불구하고 효과적으로 수행됩니다.

안지오텐신 II의 마우스 모델에서 중앙 정맥 카테터에 의한 약물 치료 유도 복부 대동맥류 및 3D 초음파에 의한 모니터링

Since pharmaceutical treatment options are lacking in the clinical management of abdominal aortic aneurysm (AAA), animal models, in particular mouse ...

이 프로토콜은 확립 된 인간 질병과 유사한 복부 대동맥 동맥류의 마우스 모델과 정맥 카테터를 통한 반복 치료를 결합합니다. 동맥류 진행을 차단해야 하는 임상적 필요성을 해결합니다. 이 프로토콜은 대동맥 직경 부피 및 형태의 확장에 대한 포괄적인 정보를 포함하여 마우스의 동맥류 진행을 줄이기 위한 약물 테스트를 위한 완전한 워크플로를 제공합니다.플러스 3D 초음파. 3D 초음파는 덜 맛 기반 마우스 모델에서 동맥류가 발생하는 하부 대동맥을 측정하도록 조정할 수 있습니다. 경정맥 카테터 삽입은 정맥주사를 필요로 하는 임의의 세트에 활용될 수 있다.12-14 주 된 APOE 결핍 메일 마우스를 마취 한 후 등 왼쪽 상단의 작은 부위를 어깨 뼈 위로 면도하고 10 % 포비돈 요오드 용액을 바르면 면도 부위를 소독합니다. 중간 척추와 왼쪽 견갑골 선 사이에 메스로 등 위쪽의 피부에 1 센티미터의 횡단 절개를하십시오. 집게로 피부를 잡고 무딘 곡선 가위를 사용합니다.왼쪽 뒷다리쪽으로 밀어 피하 주머니를 만드십시오. 가위를 열고 열린 가위를 잘라 당겨 주머니를 넓 힙니다. 절개 부위에서 방출되는 안지오텐신 2의 잠재적 간섭을 최소화하기 위해 흐름 조절기가 꼬리를 향하도록 펌프를 주머니에 부드럽게 삽입합니다.그런 다음 4.0 흡수성 중단 봉합사로 상처를 닫으십시오. 혈관 접근 시스템 사용. 3개의 프렌치 면을 원하는 길이로 절단하고 최소 3mm 겹침으로 혈관 접근 시스템 또는 VAS의 22게이지 금속 커넥터 위로 카테터를 밀어 카테터를 준비합니다.포트를 보호하기 위해 버튼에 알루미늄 캡을 놓습니다. 복부 쪽의 목 오른쪽과 마취 된 마우스의 등 위쪽 오른쪽에서 모피를 면도하십시오. 그런 다음 포비돈 요오드 용액을 사용하여 면도 부위를 소독하십시오.경정맥 준비를 위해 오른쪽 쇄골 위의 목 오른쪽에 0.5cm의 횡단 슈퍼 쇄골 피부 절개를하십시오. 무딘 미세 수술 핀셋을 사용하여 결합 조직과 외부 경정맥을 노출시키는 지방을 분리하십시오. 지방에서 작은 혈관을 찢지 마십시오.가슴 근육에 가까운 혈관의 5 밀리미터를 분리하십시오. 그런 다음 구부러진 마이크로 핀셋을 사용하여 정맥 아래의 조직을 무딘 해부하고 6.0 실크 합자 중 2-3 개를 통과시킵니다. 합자를 집어 넣고 식염수 한 방울을 사이트에 추가하십시오.버튼 이식의 경우 마우스를 뒤집어 엎드린 위치에 놓습니다. 면도 부위를 소독하기 위해 포비돈 요오드 용액을 바르십시오. 중간 척추와 오른쪽 견갑골 선 사이에 메스로 등 위쪽에 1cm 시상 절개를하십시오.다음으로, 무딘 곡선 가위를 사용하여 무딘 해부로 절개 부위 주변의 VAS 크기보다 약간 큰 원형 주머니를 만듭니다. 뭉툭한 구부러진 가위를 사용하여 가위를 살짝 열어 목의 복부 절개 부위를 향해 오른쪽 어깨 너머로 두개골로 터널을 뚫습니다. 그런 다음 열린 가위를 꺼내고 더 밀어 넣으면서 동작을 반복합니다.터널이 복부 절개에 도달하면 복부에서 등쪽 절개 부위까지 수술 클램프를 통과하십시오. 카테터의 세 개의 프렌치 끝을 클램프에 부착하고 터널을 통해 카테터를 당겨 복부 목 절개 부위에서 벗어나 VAS가 등쪽 절개 부위에 제자리에 있도록 합니다. 그런 다음 VAS 수술 펠트 디스크를 뒤쪽 절개 부위에 피하 삽입합니다.핸들링 도구의 포크 끝을 사용하여 카테터의 개통 여부를 확인하여 보호용 알루미늄 캡을 제거하고 자석 끝을 사용하여 버튼을 잡고 해당 인젝터에 부착된 1밀리리터 주사기로 식염수 또는 PBS를 주입합니다. 주머니에서 버튼을 꼬리로 누르고 두개골로 두 개의 4 개의 오 중단 봉합사로 VAS의 플랜지 아래 VA의 펠트 디스크 위의 피부를 닫습니다. 정맥 카테터 삽입의 경우 마우스를 앙와위 위치로 다시 뒤집고 절단면에 식염수 한 방울을 추가합니다.합자를 분리하고 카테터와 경정맥 주위의 첫 번째 합자를 가능한 한 두개골로 2-3 노트로 묶어 정맥을 결찰하고 카테터를 외부에 고정시킵니다. 두 번째 합자를 가슴 근육에 최대한 가깝게 움직입니다. 마이크로 가위를 사용하여 대각선을 잘라 날카로운 끝을 만들어 카테터의 3-5 밀리미터가 정맥에 오도록합니다.그런 다음 고정 된 두개골 합자를 당기고 바늘을 정맥과 평행하게 밀어 식염수로 채워진 1 밀리리터 주사기에 부착 된 27 게이지 바늘을 사용하여 정맥의 구멍을 뚫습니다. 다음으로, 고정된 두개골 합자를 당기고 구부러진 핀셋을 사용하여 카테터를 정맥에 밀어 넣어 동일한 방식으로 카테터를 정맥에 삽입합니다. 정맥과 정렬 될 때까지 카테터를 밉니다.카테터 삽입 부위에 두 번째 합자를 2-3 노트로 묶고 혈액 누출이 없는지 확인하십시오. 마이크로 가위로 두 합자의 초과 끝을 잘라 내고 식염수 한 방울을 추가하십시오. 그런 다음 4.0 흡수성 중단 봉합사로 피부를 닫습니다.앞에서 설명한 대로 원하는 양의 억제제 또는 PBS 식염수를 마우스에 주입합니다. VAS에서 주사기를 분리하는 동안 플런저에 양압을 유지하십시오. 마우스 회복 후 모니터링합니다.초음파 소프트웨어를 사용하여 설정을 조정하여 30DB 이미지 심도를 9.0mm로, 너비를 8.08mm로 조정합니다. 다음으로, 스테이지에있는 4 개의 심전도 또는 ECG 전극 각각에 전기 젤 한 방울을 넣고 마우스 사지를 테이프로 붙입니다. 마우스의 복부에 따뜻한 초음파 젤을 바르고 송신기를 내려 복부와 접촉시킵니다.대동맥을 원형의 빠른 맥동 혈관으로 식별하십시오. 왼쪽 신장 동맥을 찾고 관심 영역에 간섭이 없는지 확인하기 위해 두개골로 최대 12mm까지 수동으로 해당 영역을 조사합니다. 왼쪽 신장 동맥으로 돌아갑니다.그런 다음 동맥에서 두개골로 6 밀리미터에 프로브를 설정하십시오. 3D 초음파 획득의 경우 호흡 게이팅을 25 % 지연으로 설정하고 창을 50 %로 설정하고 ECG 트리거를 50 밀리 초로 설정하십시오. 3D 옵션에서 스캔 거리를 11.96mm로 설정하고 스텝 크기는 0.076mm로 설정합니다.157프레임을 획득한 후 이미지를 저장하기 전에 스크롤하여 이미지 품질을 확인합니다. 2D 직경 획득의 경우 호흡 게이팅과 ECG 트리거를 끄고 슈퍼 신장 대동맥의 12mm 스트레치에서 직경이 가장 큰 영역을 수동으로 찾습니다. 화면에서 B 모드를 누르고 B 모드 이미지를 획득합니다.또한 변환기를 움직이지 않고 EKV 이미지의 경우 동일한 사이트에서 시스템의 표준 설정으로 EKV 이미지를 획득합니다. 슈퍼 신장 동맥류의 발달과 진행은 기준선 8 일째와 27 일에 초음파로 모니터링되었습니다. 27 일 대동맥의 삼색 염색은 벽 박리 및 교내 혈전이있는 형성된 동맥류의 형태를 보여줍니다.8일째 복부 대동맥류 또는 AAA의 발생률과 처음 9일 이내에 대동맥 파열이 발생한 결과, 마우스의 9%가 AAA를 형성하지 못한 것으로 나타났습니다. 그러나 35%의 마우스가 카테터 이식 전에 대동맥 파열을 경험하여 AAA 질환이 확립된 나머지 마우스의 총 56%가 치료 그룹으로 계층화되는 데 최소한이었습니다. PBS 대조군 처리된 마우스에서 초기 빠른 형성 대 중간 성장 동맥류의 초기 확장 및 추가 질병 진행 사이에 반비례 관계가 관찰되었습니다.예시적인 초음파 결과는 GSK 4 84 치료가 AAA 진행을 억제하는 반면 동맥류는 마우스를 계속 확대하고 대조군하는 것으로 나타났습니다. 정맥 또는 혈관 접근 버튼에서 카테터 연결이 끊어지면 동맥류 부위에서 알 수 없는 약물 농도로 피하 공간으로 약물이 전달되기 때문에 카테터 개통이 필수적입니다. 실험이 끝날 때 마우스를 희생하면 물 및 기타 조직을 조직학적으로 조사하고 혈액 분석을 수행하여 온/오프 표적 약물 효과를 특성화할 수 있습니다.

drug-treatment-central-venous-catheter-mouse-model-angiotensin-ii

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

삼투 펌프의 피하 주입 화합물의 연장하고 일관된 전달을위한 편리한 방법을 제공합니다. 이러한 접근은 마우스에서 복부 및 흉부 대동맥 동맥류 모두 광범위하게 연구하기 위해 사용되었다.

삼투압을 이용하여 피하 안지오텐신 II 주입 쥐에서 유도 대동맥 동맥류 펌프

루멘 대동맥 및 대동맥의 봉합 결 찰에 폴리우레탄 카 테 터 삽입 adventitial 바사 vasorum hypoperfusion 인해 만성 저 산소 증 유발. 이 문서에서는 AAA의 인 간에 있는 유사한 특성을 가진 복 부 대동맥 동맥 류 (AAA)의 소설 동물 모델을 설명합니다.

Adventitial 바사 Vasorum 관류를 차단 하 여 복 부 대동맥 동맥 류의 설치류 모델의 생성

이 문서는 대동맥 동맥 및 해 부의 마우스 모델에 대동맥 직경 정량화에 대 한 murine 맥 관 구조 perfuse를 방사선 불 투과성 리드 기반 실리콘 고무를 사용 하 여 상세한 방법론을 설명 합니다.

Β-aminopropionitrile-유도 대동맥 동맥 및 해 부의 마우스 모델에서 Aortopathy의 양적 마이크로 CT 분석

초음파 이미징 생쥐에서 흉부 및 복 부 대동맥 동맥 류의 luminal 크기를 결정 하는 일반적인 형식 되고있다. 이 프로토콜 생쥐에서 상승 하 고 복 부 대동맥의 안정적이 고 재현 가능한 2 차원 초음파 이미지 절차를 설명 합니다.

흉부 및 복 부 대동맥 동맥 류 크기를 결정 하는 쥐에서의 초음파 이미징

대반 카발 누공은 두 벽을 통해 뮤린 적외선 대인 대공을 열등한 정맥으로 뚫고 열등한 정맥 카바의 부분 결찰을 통해 유출에 협착증을 생성하여 만들어졌습니다. 이 재현 가능한 모델은 중앙 정맥 협착증을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

유출 협착증을 가진 Aortocaval 누공을 사용하여 중앙 정맥 협착증의 뮤린 모형

이 원고는 복부 대동맥류의 마우스 모델에 발광 직경, 펄스 전파 속도, dtensibility 및 방사형 변형을 측정하기 위해 고주파 초음파 이미징을 사용하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

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본 프로토콜은 마우스에서 적외선 복부 대동맥의 출현에 엘라스타제의 직접 적용을 통해 엘라스타아제 유도 AAA 모델에 대한 표준화된 수술 방법을 기술한다.

엘라스타제의 혈관주위 적용에 의해 유도된 마우스 복부 대동맥류 모델

이 원고는 염화칼슘과 엘라스타제를 사용하여 생쥐 복부 대동맥류 모델을 확립하기 위한 프로토콜을 제시하고 이전 모델링 방법의 장점을 결합합니다. 이 모델은 복부 대동맥류의 기저에 있는 병태생리학적 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

Periadventitial Calcium Chloride and Elastase Infiltration에 의한 마우스 복부 대동맥류 모델

이 프로토콜은 엘라스타제를 대동맥에 직접 적용하고 음용수를 통해 ß-아미노프로피오니트릴을 투여하는 조합을 통해 마우스의 진행성 복부 대동맥류를 모델링하는 체계적인 외과적 접근 방식을 설명합니다.

국소 엘라스타제와 구강 ß-아미노프로피오니트릴의 조합에 의한 마우스의 고급 복부 대동맥류 모델링

이 프로토콜은 면역 감작 성분을 포함한 AAA 모델로서, 엘라스틴 감작과 혈관 주위 엘라스타제 적용을 사용하여 C57BL/6 마우스에서 복부 대동맥류(AAA)를 반복 가능하고 신뢰할 수 있게 유도하는 방법을 제공합니다.

엘라스틴 감작과 혈관 주위 엘라스타제를 이용한 쥐 복부 대동맥류 모델의 신뢰성 높은 생성

학습하세요 복부 대동맥류 유도 및 3D 초음파 모니터링 방법을 ApoE 결핍 마우스에서. 중앙 정맥 카테터를 이용한 약물 치료 시스템으로 혈관류 확장을 효과적으로 관찰하고 약물 효능을 평가하는 완전한 실험 워크플로우를 제공합니다.

안지오텐신 II의 마우스 모델에서 중앙 정맥 카테터에 의한 약물 치료 유도 복부 대동맥류 및 3D 초음파에 의한 모니터링

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