Name: 감염성 바이러스와 비감염성 바이러스를 구별하기 위한 압타머의 시험관 내 선택 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-07T12:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: 학습하세요 감염성과 비감염성 바이러스를 구별하는 DNA 압타머 시험관 내 선택 방법을. PCR 조건 최적화와 qPCR 모니터링을 통해 임상 진단 및 환경 모니터링용 센서 개발이 가능합니다.

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이 프로토콜에 사용된 유사바이러스 샘플(SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1)을 제공한 시카고 일리노이 대학의 Ms. Laura M. Cooper와 Dr. Lijun Rong, 그리고 고처리량 시퀀싱에 도움을 주신 일리노이 대학교 어바나-샴페인에 있는 Roy J. Carver Biotechnology Center의 DNA 서비스 시설의 Dr. Alvaro Hernandez와 Dr. Chris Wright에게 감사드립니다. 그리고 시험관 내 선택 및 압타머 특성화 기술로 우리를 도운 Lu 그룹의 많은 구성원. 이 연구는 국립 과학 재단 (CBET 20-29215)의 RAPID 보조금과 일리노이 대학교 어 바나 샴페인 및 일리노이 – JITRI 연구소 (JITRI 23965)의 지속 가능성, 에너지 및 환경 연구소의 종자 보조금으로 지원되었습니다. ASP는 재정 지원에 대해 PEW Latin American Fellowship에 감사드립니다. 또한 오스틴에 있는 텍사스 대학교의 Lu 그룹 연구 프로그램을 지원해 주신 Robert A. Welch Foundation(보조금 F-0020)에도 감사드립니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

SELEX는 pM-nM 범위 22,43,44,45에서 높은 친화력을 가진 압타머를 식별할 수 있을 뿐만 아니라 높고 조정 가능한 선택성도 제공합니다. 카운터 선택을 활용하면 선택성이 어려운 압타머를 얻을 수 있습니다. 예를 들어, Li 그룹은 병원성 박테리아 균주와 비병원성 균주를 구별할 수 있는 서열을 얻을 수 있는 능력을 입증했다21. 또한, Le et al. Streptococcus pyogenes 박테리아46의 혈청형을 구별할 수 있는 압타머를 확인했습니다. 이것은 새로운 나노 기술 22,51,52와 함께 상이한 기능적 DNA 센서...

바이러스 감염은 최근 COVID-19 대유행으로 인해 점점 더 분명해진 바와 같이 전 세계적으로 막대한 경제적, 사회적 영향을 미칩니다. 시기 적절하고 정확한 진단은 건강한 사람들에게 바이러스가 퍼지는 것을 방지하면서 바이러스 감염을 치료하는 데 가장 중요합니다. PCR 검사1,2 및 면역검사3와 같은 많은 바이러스 검출 방법이 개발되었지만, 현재 사용되는 대부분의 방법은 검출된 바이러스가 실제로 감염되는지 여부를 판단할 수 없습니다. 이는 바이러스 핵산이나 단백질과 같은 바이러스 단독의 성분의 존재가 손상되지 않은 감염성 바이러스가 존재한다는 것을 나타내지 않고 이러한 바이오마커의 수준이 감염성과 빈약한 상관관계를 나타내기 때문입니다 4,5,6. 예를 들어, 현재 PCR 기반 COVID-19 검사에 일반적으로 사용되는 바이러스 RNA는 환자가 전염성이 있을 때 감염 초기 단계에서 매우 낮은 수준을 갖는 반면, 환자가 감염에서 회복되어 더 이상 전염성이 없을 때 RNA 수준은 여전히 매우 높은 경우가 많습니다 7,8. 바이러스 단백질 또는 항원 바이오마커는 유사한 경향을 따르지만 일반적으로 바이러스 RNA보다 훨씬 늦게 나타나므로 감염 가능성을 예측할 수 훨씬 적습니다 6,9. 이러한 한계를 해결하기 위해, 바이러스의 감염성 상태를 알려줄 수 있는 몇 가지 방법이 개발되었지만, 결과를 얻기 위해 오랜 시간(일 또는 몇 주)을 필요로 하는 세포 배양 미생물학 기술을 기반으로 한다 4,10. 따라서 임상 또는 환경 샘플의 감염 가능성을 알릴 수 있는 새로운 센서를 개발하면 치료 지연 및 바이러스의 추가 확산을 방지할 수 있습니다. 그러나 손상되지 않은 감염성 비리온을 인식하고 비감염성이 된 동일한 바이러스와 구별할 수 있는 감지 분자를 얻을 수 있는 방법은 거의 없습니다.
이러한 맥락에서, 앱타머는 독특한 생체 분자 도구로서 특히 매우 적합하다(11,12,13,14). 앱타머는 특정 뉴클레오티드 서열을 가진 짧은 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자로, 높은 친화력과 선택성을 가진 표적을 인식하기 위해 특정 3D 형태를 형성할 수 있습니다15,16. 이들은 10 14-10 15 서열17,18,19의 큰 무작위 DNA 샘플링 라이브러리를 가진 시험관에서 수행되는 시험관 내 선택으로도 알려진 지수 농축에 의한 리간드의 체계적 진화 (SELEX)라고하는 조합 선택 과정에 의해 얻어진다. 이 반복 과정의 각 라운드에서 DNA 풀은 먼저 원하는 조건에서 표적과의 배양을 통해 선택 압력을 받습니다. 그런 다음 대상에 바인딩되지 않은 모든 시퀀스가 제거되고 주어진 조건에서 바인딩할 수 있는 몇 개의 시퀀스만 남게 됩니다. 마지막으로, 이전 단계에서 선택된 서열은 PCR에 의해 증폭되어 다음 선택 라운드를 위해 원하는 기능 서열로 풀의 모집단을 풍부하게 하고 프로세스가 반복됩니다. 선택 풀의 활성이 고원에 도달하면(일반적으로 8-15라운드 후) 라이브러리를 DNA 시퀀싱으로 분석하여 가장 높은 친화도를 나타내는 우승 서열을 식별합니다.
SELEX는 바이러스(22)의 감염성 상태와 같은 다른 유사한 표적(20,21)에 대해 증가된 선택성을 얻기 위해 이용될 수 있는 독특한 이점을 갖는다. 첫째, 소분자 및 단백질로부터 전체 병원체 및 세포에 이르기까지 매우 다양한 유형의 표적이 선택에 사용될 수 있다16. 따라서, 감염성 바이러스에 결합하는 앱타머를 얻기 위해, 바이러스 표면 단백질19 대신에 온전한 바이러스를 표적으로 사용할 수 있다. 전체 바이러스 SELEX를 사용하면 바이러스를 파괴할 필요 없이 바이러스의 본래 상태에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택할 수 있습니다. 둘째로, SELEX는 선택(22)의 각 라운드에서 카운터 선택 단계들을 사용하여, 다른 유사한 바이러스 또는 비감염성 불활성화 바이러스와 같은 경쟁 타겟(21, 23)을 제거하도록 맞춤형으로 제작될 수 있다. 카운터 선택 단계 동안, DNA 풀은 결합이 바람직하지 않은 표적에 노출되고, 결합하는 임의의 서열은 폐기된다.
이 작업에서 우리는 감염성 바이러스에 결합하지만 특정 소독 방법에 의해 비감염성이 된 동일한 바이러스 또는 다른 관련 바이러스에는 결합하지 않는 앱타머를 선택하는 데 일반적으로 적용할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법을 사용하면 사전에 알 필요가 없는 바이러스 표면의 기능적 차이를 기반으로 인식 제제를 얻을 수 있으므로 새로 출현한 병원체의 검출 또는 연구가 부족한 질병에 대한 추가적인 이점을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>10% 과황산암모늄(APS)</td><td>BioRad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 및 마그네슘 없는 1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드/비아크릴아미드(29:1) 용액</td><td>BioRad</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 비드</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA 클린업 비드 - 섹션 7.2.2</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 원심 필터 유닛</td><td>Merck</td><td>UFC501024</td><td>컷오프 10 kDa</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 원심 필터 유닛</td><td>Merck</td><td>UFC510024</td><td>컷오프 100 kDa</td></tr><tr><td>붕산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100165</td><td></td></tr><tr><td>C1000 터치 열 순환기(듀얼 48/48 고속 반응 모듈 포함)</td><td>BioRad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Real-Time PCR 검출 시스템</td><td>BioRad</td><td>1855201</td><td></td></tr><tr><td>Digital Dry Baths/Block Heaters</td><td>Thermo Scientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Thermo Fisher</td><td>65001</td><td>스트렙타비딘 변성 마그네틱 비드 - 섹션 4.9</td></tr><tr><td>EDTA 디소듐 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>324503</tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>Lenti-X p24 Rapid Titer Kit</td><td>Takara Bio USA, Inc.</td><td>632200</td><td>렌티바이러스 정량화 키트 - 섹션 3.3.2.1</td></tr><tr><td>MagJET 분리 랙, 12 x 1.5 mL 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>MR02</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR 플레이트 밀봉 필름, 접착제, 광학</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td>Non-UV absorbing</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels</td><td>BioRad</td><td>1658004EDU</td><td></td></tr><tr><td>미니 프로티안 쇼트 플레이트</td><td>BioRad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>미니 프로티언 스페이서 플레이트(0.75mm 통합 스페이서 포함</td>) <td>BioRad</td><td>1653310</td><td></td></tr><tr><td>분자 생물학 등급 Water</td><td>Lonza</td><td>51200</td><td></td></tr><tr><td>멀티플레이트 96웰 PCR 플레이트, 하이 프로파일, 언스커트, 투명</td><td>BioRad</td><td>MLP9611</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq DNA 중합효소</td><td>New England BioLab</td><td>M0480S</td><td></td></tr><tr><td>Ovation Ultralow v2 + UDI</td><td>Tecan</td><td>0344NB-A01</td><td>고트로풋 염기서열분석 라이브러리 준비 키트 - 섹션 7.2.</td></tr><tr><td>PIPETMAN G (100-1000 &마이크로; L, 20-200 &마이크로; L, 2-20 &마이크로; L 및 0.2-2 & 마이크로; L)</td><td>Gilson</td><td>F144059M, F144058M, F144056M, F144054M</td><td></td></tr><tr><td>Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets</td><td>Labconco</td><td>4261</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td>형광 기반&nbsp; dsDNA 정량화&nbsp; 키트 - Section 7.2.3</td></tr><tr><td>SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1158U43, 1159M44, 1158U40</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>S2889</td><td></td></tr>, <tr><td>염화나트륨</td>, <td>시그마-알드리치</td>, <td>S7653</td><td></td></tr>, <tr><td>소르발, 레전드 마이크로 17R 마이크로 원심분리기</td><td>, 써모 사이언티픽</td><td></td> 75002440 <td></td></tr><tr><td>SsoFast, EvaGreen Supermix,</td><td>BioRad</td><td>1725201</td><td>qPCR 마스터믹스 - 섹션 6.2.</td></tr><tr><td>트리스(하이드록시메틸)아미노메탄</td><td>시그마-알드리치</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>튜브 및 울트라 클리어 캡, 8</td>개의 <td>미국 과학</td><td>AB1183</td><td>PCR 튜브</td></tr><tr><td>요소</td><td>시그마-알드리치</td><td>U5128</td><td></td></tr> 스트립</tbody></table>

감염성 바이러스와 비감염성 바이러스를 구별하기 위한 압타머의 시험관 내 선택

In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

바이러스 감염은 사회에 큰 영향을 미칩니다. 대부분의 검출 방법은 검출 된 바이러스가 전염성이 있는지 여부를 판단하는 데 어려움이있어 치료가 지연되고 바이러스가 더 확산됩니다. 임상 또는 환경 샘플의 감염 가능성을 알려줄 수 있는 새로운 센서를 개발하면 이러한 미충족 과제를 해결할 수 있습니다. 그러나 온전한 감염성 바이러스를 인식하고 소독 방법으로 비감염성이 된 동일한 바이러스와 구별할 수 있는 감지 분자를 얻을 수 있는 방법은 거의 없습니다. 여기에서는 지수 농축(SELEX)에 의한 리간드의 체계적인 진화를 사용하여 감염성 바이러스와 비감염성 바이러스를 구별할 수 있는 앱타머를 선택하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 SELEX의 두 가지 기능을 활용합니다. 첫째, SELEX는 카운터 선택을 사용하여 비감염성 바이러스 또는 기타 유사한 바이러스와 같은 경쟁 표적을 제거하도록 맞춤 제작할 수 있습니다. 추가로, 전체 바이러스는 예를 들어 바이러스 표면 단백질 대신에 SELEX에 대한 표적으로서 사용될 수 있다. 전체 바이러스 SELEX는 바이러스를 파괴할 필요 없이 바이러스의 본래 상태에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택할 수 있습니다. 따라서이 방법은 사전에 알 필요가없는 병원체 표면의 기능적 차이에 기초하여 인식 제제를 얻을 수있게한다.

DNA 앱타머는 시험관(15)에서 SELEX를 사용하여 얻을 수 있기 때문에, 이 SELEX 전략은 온전한 전체 감염성 바이러스에 대한 양성 선택 단계(즉, 감염성 바이러스에 결합하는 DNA 분자를 보유함)뿐만 아니라 특정 소독 방법에 의해 비감염성이 된 동일한 바이러스에 대한 반대 선택 단계를 모두 포함하도록 신중하게 설계되었습니다. 특히 자외선 처리는 비감염성 바이러스에 결합할 수 있는 DNA 서열을 폐기한다. 선택 프로세스의 개략도가 그림 1에 나와 있습니다.
이 프로토콜의 대표적인 결과로 감염성 SARS-CoV-2에 대한 압타머 선택을 선택했습니다. 손상되지 않은 전염성 SARS-CoV-3를 처리하기 위한 생물안전 수준 3(BSL2) 작업 조건의 요구 사항으로 인해 우리는 대신 유사형 바이러스를 사용하기로 결정했습니다. 유사형 바이러스는 상대적으로 무해한 백본 바이러스(이 경...

우리는 일반적으로 감염성 바이러스에만 결합하는 앱타머를 선택하고 소독 방법에 의해 비감염성이 된 바이러스 또는 기타 유사한 바이러스에는 결합하지 않는 앱타머를 선택할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 이것은 휴대용 및 신속한 테스트에서 감염성 상태를 결정할 수 있는 가능성을 열어줍니다.

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

이 프로토콜은 임상 또는 환경 샘플의 감염 가능성을 알릴 수 있는 감지 분자를 얻기 위해 감염성 바이러스와 비감염성 바이러스를 구별할 수 있는 DNA 앱타머를 선택하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 바이러스의 구조나 서열에 대한 사전 지식이 필요하지 않기 때문에 신종 바이러스를 포함한 다른 많은 바이러스에 대한 선택적 앱타머를 얻는 데 적용할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 감염성 바이러스의 임상 진단 및 환경 모니터링을 위한 앱타머 센서를 개발하여 누군가가 전염성이 있는지 또는 환경 소독 방법이 의도한 대로 작동하는지 감지할 수 있습니다.선택은 특히 처음 접하는 사람들에게 어려운 과정이 될 수 있습니다. PCR 조건을 최적화하고 qPCR로 선택 진행 상황을 모니터링하는 것이 중요합니다. 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 대학원생 인 Marcos Gramajo가 될 것입니다.시작하려면 초기 단일 가닥 또는 SS-DNA 라이브러리와 프라이머를 설계합니다. 표준 탈염 정제를 통해 상업적 공급원으로부터 DNA 올리고를 얻는다. SS-DNA 라이브러리와 프라이머를 10% 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 정제한 후 에탄올을 침전시킵니다.다음으로, 감염성 및 비 감염성 바이러스의 원액을 얻거나 텍스트 원고에 설명 된대로 준비하십시오. SS-DNA 라이브러리의 변성을 위해 10마이크로리터의 100마이크로몰 SS-DNA 라이브러리와 240마이크로리터의 SELEX 완충액을 혼합합니다. 혼합물을 섭씨 95도에서 건조한 욕조에서 15 분 동안 가열 한 다음 튜브를 얼음 위에 15 분 동안 놓습니다.양성 선택을 위해 SELEX 버퍼에 250마이크로리터의 SS-DNA 라이브러리를 50마이크로리터의 감염성 바이러스와 혼합합니다. 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오. 그런 다음 0.5 밀리리터 필터에 1 밀리몰 T20 시퀀스 400 마이크로 리터를 추가하여 비특이적 부위를 차단합니다.필터를 30분 동안 배양합니다. 필터를 14, 000 G에서 10분 동안 원심분리하여 T20 용액을 제거한다. 그런 다음 필터를 SELEX 버퍼로 세 번 세척하여 과도한 T20 서열을 제거합니다.다음으로, SS-DNA 라이브러리 감염성 바이러스 혼합물을 차단된 100 킬로달톤 필터 및 원심분리기에 첨가하여 결합되지 않은 서열을 세척한다. 400 마이크로 리터의 SELEX 버퍼를 추가하고 원심 분리하여 필터를 세 번 세척하십시오. 필터에 분획을 유지하고 플로우 스루를 버립니다.결합된 시퀀스를 용리하려면 원심분리기 필터의 수집 튜브를 교체하고 8몰 요소가 포함된 SELEX 버퍼 300마이크로리터를 필터에 추가합니다. 필터를 섭씨 95도에서 15분 동안 가열한 다음 원심분리하여 용출된 서열이 포함된 플로우 스루를 수집합니다. 완료되면 10% 표백제로 재료를 씻으십시오.다음으로, 이전 단계에서 수집 한 SS-DNA 감염성 바이러스 용액을 차단 된 10 킬로 달톤 필터에 첨가하고, 14, 000 G에서 15 분 동안 원심 분리하고 플로우 스루를 버린다. 필터를 300 마이크로 리터의 SELEX 완충액으로 세 번 세척하여 원심 분리로 요소를 제거하고 플로우 스루를 버립니다. 깨끗한 수집 튜브에서 거꾸로 뒤집고 5분 동안 원심분리하여 필터의 용액을 회수합니다.피펫을 사용하여 회수된 용액의 최종 부피를 측정하고 Round 1A 샘플로 라벨을 붙입니다. 1차 라운드에서 라운드 1A 샘플의 90%를 템플릿으로 사용하고 최적화된 조건으로 PCR을 실행합니다. 스트렙타비딘 변형 마그네틱 비드 또는 MB를 사용하여 SS-DNA를 회수하려면 제품을 50마이크로리터 분취량으로 분할하고 50마이크로리터 MB가 들어 있는 미세원심분리기 튜브에 추가합니다. 실온에서 온화한 교반으로 튜브를 30분 동안 배양합니다.그런 다음 튜브를 마그네틱 랙에 올려 MB를 분리하고 피펫팅으로 상층액을 제거합니다. 튜브에 200 마이크로 리터의 바인딩 및 세척 버퍼를 추가하여 MB를 두 번 세척하십시오. 그런 다음 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 피펫팅을 통해 MB를 균질한 용액으로 다시 일시 중단하기 전에 두드립니다.튜브를 마그네틱 랙에 다시 놓고 상층액을 제거합니다. 두 번째 세척 후 MB를 100마이크로리터의 SELEX 완충액에 재현탁하고 용액을 섭씨 95도에서 10분 동안 가열합니다. 즉시 튜브를 마그네틱 랙에 넣고 SS-DNA 풀이 들어 있는 상층액을 수집합니다.이 복구 단계를 반복하여 50 마이크로 리터의 SELEX 버퍼를 추가합니다. 회수된 분획의 최종 부피를 측정하고 Round 1X로 표시합니다. SS-DNA 풀의 변성을 위해 Round 1X 샘플의 60%를 취하여 50마이크로리터의 SELEX 완충액과 혼합합니다.건조한 수조에서 샘플을 가열한 다음 튜브를 얼음 위에 15분 동안 놓습니다. 다음으로, 반대 선택 단계로서 SELEX 완충액에 변성된 SS-DNA 풀을 각 바이러스 50 마이크로리터와 혼합하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 원심분리 필터에서 비특이적 부위를 차단한 후, 바이러스 용액과 함께 인큐베이션된 변성된 SS-DNA 풀을 차단된 100 킬로달톤 필터에 첨가한다.필터를 14, 000 G에서 10 분 동안 원심 분리하고 플로우 스루를 수집하십시오. 300 마이크로 리터의 분획을 취하여 밀리 리터 당 1 억 개의 카피를 함유 한 50 마이크로 리터의 감염성 바이러스와 혼합하십시오. 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.텍스트에 설명된 대로 표준 qPCR 마스터 믹스 및 정제된 SS-DNA 라이브러리의 희석액을 준비합니다. qPCR을 실행하여 임계값 주기를 결정합니다. 실행 후 표준 곡선을 사용하여 라운드 1A 및 라운드 1X에서 SS-DNA의 양을 정량화합니다.그런 다음 결합된 DNA 양을 초기 DNA 양으로 나눈 값으로 용리 수율을 계산하고 용출 수율 대 반올림 수를 플로팅합니다. 마지막으로, 서로 다른 라운드에 대한 용융 곡선을 플로팅합니다. 고처리량 염기서열 분석을 위해서는 상업적으로 이용 가능한 적절한 키트를 선택하십시오.높음, 중간 및 낮음 보강을 나타내는 선택 라운드의 여러 풀과 각 풀의 어댑터에서 서로 다른 인덱스 쌍을 사용하여 최종 풀을 준비합니다. 그런 다음 준비된 최종 라이브러리를 시퀀싱 시설로 보냅니다. 염기서열 분석을 위해 염기서열은 시퀀싱 시설에 의해 역다중화되었습니다.명령행 프로그램 Cutadapt를 사용하여 시퀀싱 어댑터 및 선택 프라이머를 제거하십시오. 그런 다음 FASTX-Toolkit 프로그램을 사용하여 저품질 시퀀스를 제거합니다. 그런 다음 역방향 파일의 FASTX-Toolkit FASTX_reverse_ 보수 기능을 사용하여 역방향의 시퀀스 파일을 정방향의 시퀀스 파일과 병합합니다.그런 다음 내장된 CAT 프로그램을 사용하여 파일을 단일 파일로 병합합니다. FASTAptamer 분석 툴킷을 사용하여 다양한 선택 풀에서 염기서열의 강화를 분석할 수 있습니다. 먼저, FASTAptamer 카운트 및 FASTAptamer 클러스터 함수를 사용하여 유사한 시퀀스를 클러스터로 그룹화합니다.다음으로, FASTAptamer 보강 함수를 사용하여 시퀀스와 군집의 보강에 대한 정보를 가져옵니다. 서열 분석을 통해 얻은 농축 정보로부터 후보 앱타머 서열을 식별합니다. 여러 압타머 서열을 선택하고 결합 분석을 사용하여 초기 스크리닝을 수행합니다.이 분석에서 qPCR을 사용하여 감염성 SARS-CoV-2 특이적 압타머의 SELEX 진행을 모니터링했습니다. 용출 수율은 처음에 SELEX의 각 라운드마다 증가했으며 8 라운드와 9 라운드에서 평준화되었습니다. 용융 곡선을 비교함으로써, 섭씨 77도에서 79도까지의 높은 용융 온도에서 피크로부터의 이동이 관찰되었다.또한, 마지막 두 라운드에서 낮은 용융 온도에서의 피크가 관찰되었습니다. 연속 선택 라운드에서 얻은 순차적 SARS2 AR10에 대한 백만당 판독 수의 상대적 풍부도가 표시됩니다. SARS2 AR10의 예측된 구조는 바이러스 인식에 관여할 수 있는 줄기 루프 영역을 포함하는 구조화된 2차 구조를 보여주었습니다.앱타머가 확보되면 또 다른 유형의 센서인 전기 광학 장치에 통합되어 바이러스 감염성을 알릴 수 있는 포털 및 신속한 바이러스 검출 테스트를 개발할 수 있습니다. 다양한 변종 또는 고정관념의 바이러스에 특이적인 앱타머를 확보할 수 있어 사회에 가장 큰 위협이 되는 변종을 신속하게 모니터링할 수 있을 것으로 기대하고 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

Aptamers는가 선택한 짧은 ribo-/deoxyribo-oligonucleotides...

아밀로이드 β 단백질, 알츠하이머 병의 원인이되는 에이전트에 대한 Aptamers의 선택

SELEX의 프로토콜 설정에서 임의의 라이브러리 영역을 측면 고정 프라이머 시퀀스를 요구 바운드 리간드의 재생을 필요로 각각의 선택 여러 라운드를 구성. 이러한 고정 프라이머 시퀀스는 선택 프로세스 (잘못된 반응과 제외)을 방해할 수 있습니다. 여기 입문서없는 프로토콜을 제시한다.

랜덤 DNA 라이브러리를 사용하여 뇌관 - 무료 Aptamer 선택

nanomole 친화력과 HIV - 1Ba - L gp120에 대한 몇 가지 2' - 플루오로 RNA의 aptamers는 RNA 라이브러리에서에 의해 고립...

siRNA 전달을위한 셀 타입의 특정 안티 HIV gp120 aptamers의 개발

세포 변성 효과 (CPE) 기반의 분석, 용량 - 반응 분석 및 시간 - 중 - 추가 TOA () 분석 등의 세 가지 분석은 물론, 개발, 최적화, 검증 및 Bluetongue 바이러스에 대한 새로운 항 바이러스제 (BTV)를 식별하기 위해 사용 된 새로 확인 된 항 바이러스제에 사용할 수있는 기계 장치의 액션 (대학교 미술관)을 결정하기로.

Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

바이러스 복제를 측정하는 시험 관내 분석에서 크게 루시페라아제 또는 생물 발광 가능한 다른 효소를 발현하는 재조합 RNA 바이러스의 개발에 의해 개선되었다. 여기 세부 홍역 및 화학 도서관에서 폭 넓은 스펙트럼 항 바이러스를 분리하기 Chikungunya의 바이러스와 같은 재조합 균주를 결합하여 높은 처리량 검사 파이프 라인을.

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

조정 가능한 엄격성 마그네틱 비드 선택 방법을 기반으로 저분자 타겟에 대한 구조 스위칭 압타머를 선택하기 위한 프로토콜이 제공됩니다. 구조 스위칭 특성으로 선택된 Aptamers는 설명된 금 나노입자 분석과 같이 표적의 존재를 알리기 위해 구조적 변화가 필요한 분석에 유용합니다.

색채 금 나노 입자 분석에 적용 구조 전환 앱 타머를 선택하는 방법

여기에서는 새로운 항바이러스제를 식별하고 평가하기 위해 바이러스 진입의 특정 단계를 검사하는 프로토콜을 제시합니다.

초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

아레나바이러스 수명 주기의 첫 번째 단계는 바이러스 입자를 숙주 세포에 부착하는 것입니다. 아레나바이러스 부착 이벤트의 초고감도 검출 및 정량화를 위한 정량적 (q)RT-PCR 기반 분석을 보고합니다.

Arenavirus 셀 첨부 파일의 측정을위한 고감도 분석

일상적인 탐지 방법 바이러스 성 게놈 증폭을 이용 하는 비 전염 성 입자에서 전염 성 차별을 그들의 무 능력에 의해 제한 됩니다. 이 문서의 목적은 aptamer 바인딩, 동적 산란, 및 전송 전자 현미경 검사 법을 사용 하 여 감염 노로바이러스 입자의 차별에 도움이 다른 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하는 것입니다.

대체 체 외에 바이러스 성 Capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법

여기, 선물이 arbovirus 복제 및 arbovirus 복제를 제한 하는 2) 진 핵 호스트 요인 1) 바이러스 인코딩된 immunomodulators 식별 프로토콜. 이러한 형광 및 발광 기반 방법을 빠르게 낮은 신호 대 잡음 비율 단순한 분석에 arbovirus 복제의 양적 정보를 연구 수 있습니다.

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

항암 앱타머 개발에 필요한 단계는 표적에 대한 결합을 테스트하는 것입니다. 우리는 이 결합을 연구하기 위한 유세포 분석 기반 분석을 시연하며, 특정 단백질에 대해 음성 대조군 압타머와 양성 또는 음성 암세포를 포함하는 것의 중요성을 강조합니다.

항암 압타머의 선택성 및 특이성을 평가하기 위한 유세포분석 기반 세포 표면 단백질 결합 분석

학습하세요 감염성과 비감염성 바이러스를 구별하는 DNA 압타머 시험관 내 선택 방법을. PCR 조건 최적화와 qPCR 모니터링을 통해 임상 진단 및 환경 모니터링용 센서 개발이 가능합니다.

감염성 바이러스와 비감염성 바이러스를 구별하기 위한 압타머의 시험관 내 선택

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