Name: 뉴런 리소좀 상호작용과 근접 라벨링 단백질체학의 특성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T14:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: 학습하세요 iPSC 유래 인간 뉴런에서 근접 라벨링 단백질체학을 이용한 리소좀 미세환경 분석 방법입니다. 이 기술은 뇌 질환 관련 리소좀 기능 이상을 이해하고 치료 표적을 발굴하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 NIH 보조금(R01NS121608)의 지원을 받습니다. AMF는 ARCS-Metro Washington Chapter 장학금과 Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship을 인정합니다. 우리는 분자 생물학 지원과 i3뉴런 기술 개발에 대해 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (NINDS)의 마이클 워드 연구소에 감사드립니다.

<ol><li>De Duve, C., Wattiaux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functions of lysosomes.</a> Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).</li>
<li>Ballabio, A., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes+as+dynamic+regulators+of+cell+and+organismal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).</li>
<li>Lawrence, R. E., Zoncu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lysosome+as+a+cellular+centre+for+signalling%2C+metabolism+and+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control.</a> Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).</li>
<li>Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteome+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The proteome of lysosomes.</a> Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).</li>
<li>Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome+trafficking+and+signaling+in+health+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases.</a> Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).</li>
<li>Leeman, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome+activation+clears+aggregates+and+enhances+quiescent+neural+stem+cell+activation+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging.</a> Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).</li>
<li>Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+dysfunction+at+the+centre+of+Parkinson%27s+disease+and+frontotemporal+dementia%2Famyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson's disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis.</a> Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).</li>
<li>Ferguson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Neuronal lysosomes.</a> Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).</li>
<li>Rost, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+acidification+of+synaptic+vesicles+and+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).</li>
<li>Liao, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+granules+hitchhike+on+lysosomes+for+long-distance+transport%2C+using+annexin+A11+as+a+molecular+tether%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether.</a> Cell. 179 (1), 147-164 (2019).</li>
<li>Kuijpers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+autophagy+regulates+presynaptic+neurotransmission+by+controlling+the+axonal+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum.</a> Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+serotonin+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).</li>
<li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+a+dish%3A+The+promise+of+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145 (6), 831-834 (2011).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+production+of+iPSC-derived+human+neurons+to+identify+tau-lowering+compounds+by+high-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening.</a> Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).</li>
<li>Fernandopulle, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+differentiation+of+human+iPSCs+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons.</a> Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).</li>
<li>Sunbul, M., Andres, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSunbul%2C+M+%22Proximity+labeling%3A+Methods+and+protocols%22">Proximity labeling: Methods and protocols</a>. , Humana Press. (2019).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li>
<li>Rhee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+mapping+of+mitochondria+in+living+cells+via+spatially+restricted+enzymatic+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging.</a> Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).</li>
<li>Lobingier, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+spatiotemporally+resolve+protein+interaction+networks+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells.</a> Cell. 169 (2), 350-360 (2017).</li>
<li>Paek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+tracking+of+GPCR+signaling+via+peroxidase-catalyzed+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling.</a> Cell. 169 (2), 338-349 (2017).</li>
<li>Fazal, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas+of+subcellular+RNA+localization+revealed+by+APEX-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq.</a> Cell. 178 (2), 473-490 (2019).</li>
<li>Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+comparative+evaluation+of+endolysosomal+proximity+labeling-based+proteomic+methods+in+human+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons.</a> Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).</li>
<li>Li, J., Pfeffer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+membrane+glycoproteins+bind+cholesterol+and+contribute+to+lysosomal+cholesterol+export%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export.</a> eLife. 5, 21635(2016).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+polypharmacology+platform+promotes+cytoprotection+and+viability+of+human+pluripotent+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells.</a> Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).</li>
<li>Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-cleavable+biotin+for+chemical+and+enzymatic+biotinylation+and+its+application+to+mitochondrial+TurboID+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+proteomic+and+metabolomic+analyses+of+the+mitochondrial+neurodegenerative+disease+MELAS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Omics%22%5BJournal%5D)">Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS.</a> Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSFragger%3A+Ultrafast+and+comprehensive+peptide+identification+in+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).</li>
<li>Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+protein+contaminants+influence+DDA+and+DIA+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichr%3A+A+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li>
<li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STRING+v11%3A+Protein-protein+association+networks+with+increased+coverage%2C+supporting+functional+discovery+in+genome-wide+experimental+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets.</a> Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).</li>
<li>Kissing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+vacuolar-type+H%2B-ATPase+complex+in+liver+causes+MTORC1-independent+accumulation+of+autophagic+vacuoles+and+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes.</a> Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).</li>
<li>kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CORVET+and+HOPS+tethering+complexes+-+coordinators+of+endosome+and+lysosome+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">CORVET and HOPS tethering complexes - coordinators of endosome and lysosome fusion.</a> Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).</li>
<li>Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab7%3A+Roles+in+membrane+trafficking+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Rab7: Roles in membrane trafficking and disease.</a> Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).</li>
<li>Cheng, X. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+LAMP1-labeled+nondegradative+lysosomal+and+endocytic+compartments+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons.</a> Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).</li>
<li>Eskelinen, E. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+LAMP-1+and+LAMP-2+in+lysosome+biogenesis+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy.</a> Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).</li>
<li>Sancak, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ragulator-rag+complex+targets+mTORC1+to+the+lysosomal+surface+and+is+necessary+for+its+activation+by+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids.</a> Cell. 141 (2), 290-303 (2010).</li>
<li>Abu-Remaileh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+metabolomics+reveals+V-ATPase-+and+mTOR-dependent+regulation+of+amino+acid+efflux+from+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes.</a> Science. 358 (6364), 807-813 (2017).</li>
<li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture%2C+SILAC%2C+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li>
<li>Tao, W. A., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quantitative+proteomics+via+stable+isotope+tagging+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).</li>
<li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+analysis+of+a+genetically+induced+prostate+inflammation+mouse+model+via+custom+4-plex+DiLeu+isobaric+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+mass+tags%3A+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).</li>
<li>Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+molecular+interactions+by+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deciphering molecular interactions by proximity labeling.</a> Nature Methods. 18, 133-143 (2021).</li>
<li>Go, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximity-dependent+biotinylation+map+of+a+human+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A proximity-dependent biotinylation map of a human cell.</a> Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

이 LAMP1-APEX 프로브를 사용하여 리소좀 막 위와 근처의 단백질이 비오틴화되고 농축됩니다. 100-1,200 nm의 일반적인 리소좀 직경을 감안할 때,이 방법은 10-20 nm 표지 반경으로 우수한 세포 내 분해능을 제공합니다. LAMP1은 풍부한 리소좀 막 단백질이자 리소좀의 고전적인 마커로, 내인성 발현 수준에서 리소좀 APEX 라벨링을 위한 우수한 미끼 단백질 역할을 합니다. 그러나, LAMP1이 후기 엔도솜 및 비분해성 리소좀(35)에도 존재하기 때문에, LAMP1을 리소좀을 표적화하기 위해 사용할 때 한계가 존재한다. 대부분의 리소좀 마커는 후기 엔도좀에서도 발현되며 결국 리소좀으로 성숙합니다. 리소좀을 표적으로 하는 대안적인 미끼 단백질은 LAMPTOR, LAMP2, 및 TMEM19235,36,37이다....

리소좀은 리소좀-자가포식 경로1을 통해 거대분자를 분해하는 이화작용 소기관입니다. 분해 외에도 리소좀은 신호 전달, 영양소 감지 및 분비 2,3,4와 같은 다양한 세포 기능에 관여합니다. 리소좀 기능의 섭동은 리소좀 저장 장애, 암, 노화 및 신경 퇴행과 관련이 있습니다 3,5,6,7. 유사분열 후 및 고도로 편광된 뉴런의 경우, 리소좀은 뉴런 세포 항상성, 신경 전달 물질 방출 및 축삭 8,9,10,11을 따른 장거리 수송에 중요한 역할을 합니다. 그러나 인간 뉴런에서 리소좀을 조사하는 것은 어려운 작업이었습니다. 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 유래 뉴런 기술의 최근 발전으로 이전에는 접근 할 수 없었던 살아있는 인간 뉴런의 배양이 가능해져 동물 모델과 인간 환자 간의 격차를 해소하여 인간의 뇌를 연구합니다12,13. 특히, 진보 된 i3뉴런 기술은 독시사이클린 유도 성 프로모터 하에서 뉴로 게닌 -2 전사 인자를 iPSC 게놈에 안정적으로 통합하여 iPSC가 2 주 만에 순수한 피질 뉴런으로 분화하도록 유도합니다14,15.
매우 역동적인 리소좀 활성으로 인해 다른 세포 구성 요소와의 리소좀 상호 작용을 캡처하는 것은 특히 고처리량 방식으로 기술적으로 어렵습니다. 근접 라벨링 기술은 탁월한 공간 특이성으로 안정 및 일시적 / 약한 단백질 상호 작용을 모두 캡처 할 수 있기 때문에 이러한 동적 상호 작용을 연구하는 데 적합합니다16,17. 조작된 퍼옥시다아제 또는 비오틴 리가아제는 미끼 단백질에 유전적으로 융합될 수 있습니다. 활성화 시, 반응성이 높은 비오틴 라디칼이 생성되어 이웃 단백질을 공유 표지하고, 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS) 플랫폼 17,18,19,20,21을 통해 다운스트림 상향식 단백질체학을 위한 스트렙타비딘 코팅 비드에 의해 농축될 수 있습니다.
내인성 리소좀 근접 표지 단백질체학 방법이i3뉴런22에서 동적 리소좀 미세환경을 포착하기 위해 최근에 개발되었다. 조작된 아스코르브산 과산화효소(APEX2)는 iPSC의 리소좀 관련 막 단백질 1(LAMP1)의 C-말단에 녹인되었으며, 이는 피질 뉴런으로 분화될 수 있습니다. LAMP1은 풍부한 리소좀 막 단백질이며 고전적인 리소좀 마커23입니다. LAMP1은 또한 리소좀으로 성숙하는 후기 엔도좀에서 발현됩니다. 이러한 후기 엔도솜-리소좀과 비분해성 리소좀은 모두 이 프로토콜에서 리소좀이라고 합니다. 생리학적 수준에서 발현되는 이 내인성 LAMP1-APEX 프로브는 LAMP1 오국소화 및 과발현 인공물을 줄일 수 있습니다. 수백 개의 리소좀 막 단백질과 리소좀 인터랙터는 살아있는 인간 뉴런에서 뛰어난 공간 분해능으로 식별하고 정량화할 수 있습니다.
여기서, 인간 iPSC 유래 뉴런에서 리소좀 근접 표지 단백질체학에 대한 상세한 프로토콜이 최근에 공개된 방법(22)으로부터의 추가적인 개선과 함께 기술된다. 전체 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜에는 hiPSC 유래 뉴런 배양, 뉴런의 근접 라벨링 활성화, 형광 현미경을 통한 APEX 활성 검증, 최적의 스트렙타비딘 비드 대 입력 단백질 비율 결정, 비오틴화 단백질 농축, 온비드 단백질 분해, 펩타이드 탈염 및 정량화, LC-MS 분석 및 단백질체학 데이터 분석이 포함됩니다. 문제 해결 지침 및 실험 최적화도 근접 라벨링 품질 관리 및 성능을 개선하기 위해 논의됩니다.

<table><tbody><tr><td>10%(w/v) 사포닌 용액</td><td>Acros Organics</td><td>419231000</td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td>세포 <td>분리 용액, 세포 배양</td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Fisher Scientific</td><td>17504044</td>세포 <td>배양, 피질 뉴런 배지</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-02</td><td>세포 배양, 피질 뉴런 배지</td></tr><tr><td>붕산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td>세포 배양, 붕산염 완충</td></tr>액 <tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Millipore Sigma</td><td>A8806</td><td>총 단백질 농도를 측정하기 위한 표준 용액을 만들기 위해</td></tr><tr><td>Brainphys neuronal medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5790</td><td>Cell Culture, cortical Neuron medium</td></tr><tr><td>CD45R (B220) 항체 Alexa Fluor 561</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>505-0452-82</td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>Chroman1 ROCK 억제제</td><td>Tocris</td><td>716310</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>cOmplete mini 프로테아제 억제제</td><td>Roche</td><td>4693123001</td><td>칵테일 억제제 in Lysis Buffer</td></tr><tr><td>DC 단백질 분석 키트 II</td><td>Bio-Rad</td><td>5000112</td>세포 <td>용해물의 총 단백질 농도를 측정하려면</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>근접 라벨링 반응</td></tr><tr><td>DMEM/F12 배지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320082</td><td>세포 배양,</td></tr><tr><td>HEPES를 사용한 디쉬 코팅 DMEM/F12 배지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330057</td>세포 <td>배양, 유도 배지</td></tr><tr><td>당나귀 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate, &ge; 98% (HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td>세포 배양, 유도 매체</td></tr><tr><td>필수 8 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td>세포 <td>배양</td></tr><tr><td>필수 8 보충제(50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517101</td>세포 <td>배양</td></tr><tr><td>추출 플레이트 진공 매니폴드 키트</td><td>Waters</td><td>WAT097944</td><td>펩타이드 탈염</td></tr><tr><td>포름산(FA)</td><td>용Fisher Scientific</td><td>A11750</td><td>LC-MS 분석</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-10</td><td>세포 배양, 피질 뉴런 매체</td></tr><tr><td>Hoechst 염료</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62239</td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>HPLC 등급 메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452</td><td>펩타이드 탈염</td></tr><tr><td>HPLC 등급 물</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5</td><td>펩타이드 탈염</td></tr><tr><td>인간 유도 만능 줄기 세포</td><td>Corriell Institute</td><td>GM25256</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>과산화수소, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>AA33323AD 근접 라벨링 반응</td></tr><tr><td>요오도아세트아미드(IAA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>I6125</td><td>단백질 분해용</td></tr><tr><td>라미닌</td><td>Fisher Scientific</td><td>23017015</td><td>세포 배양, 피질 뉴런 매체</td></tr><tr><td>LC-MS 등급 Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955</td><td>LC-MS 분석용</td></tr><tr><td>LC-MS 등급 물</td><td>Fisher Scientific</td><td>W64</td><td>LC-MS 분석용</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-030-081</td><td>세포 배양, 유도 매체</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-774-552</td><td>기저막 매트릭스, 세포 배양, 접시 코팅</td></tr><tr><td>마우스 안티-휴먼 LAMP1 단클론 항체</td><td>개발 연구 Hybridoma Bank</td><td>h4a3</td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>N-2 보충제( 100x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-502-048</td><td>세포 배양, 유도 매체</td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인, Precut, 0.45 &micro; m, 7 x 8.5 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>1620145</td><td>비드 적정을 위한 도트 블롯 분석을 수행하려면</td></tr><tr><td>비필수 아미노산(NEAA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-140-050</td><td>세포 배양, 유도 매체</td></tr><tr><td>NT-3</td><td>PeproTech</td><td>450-03</td><td>세포 배양, 피질 뉴런 매체</td></tr><tr><td>오아시스 HLB 96웰 고체상 추출 플레이트</td><td>Waters</td><td>186000309</td><td>펩타이드 탈염용</td></tr><tr><td>오디세이 차단 완충액 (TBS)</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-50000</td><td>비드 적정을 위한 도트 블롯 분석 수행</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>페놀 비오틴(1,000x 재고)</td><td>아디포겐</td><td>41994-02-9</td><td>근접 라벨링 반응</td></tr><tr><td>칼슘 또는 마그네슘이 없는 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td>세포 배양, 근접 라벨링 반응, 형광 현미경 투시법</td></tr><tr><td>피어스 정량 비색 펩타이드 분석</td><td>Thermo Fisher</td><td>23275</td><td>펩타이드 농도 분석</td></tr><tr><td>폴리-L-오르니틴(PLO)</td><td>밀리포어 시그마</td><td>P3655</td><td>세포 배양, 디쉬 코팅</td></tr><tr><td>아스코르브산 나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4034</td><td>근접 라벨링 담금질 완충액, 용해 완충액</td></tr><tr><td>나트륨 아지드</td><td>시그마-알드리치</td><td>S8032</td><td>근접 라벨링 담금질 완충액, 용해 완충액, 형광 현미경 검사</td></tr><tr><td>, 염화나트륨</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td>, <td>세포</td><td>배양 S271500, 붕산염 완충액</td></tr><tr><td>, 도데실황산나트륨(SDS),</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1311220</td><td>용해 완충액, 도트 블롯 분석 완충액, 비드 세척 완충액</td></tr><tr><td>, 수산화나트륨</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>415413</td><td>세포 배양, 붕산염 완충</td></tr>액<tr><td>, 사붕산나트륨</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>, 221732</td><td>세포 배양, 붕산염 완충</td></tr>액, <tr><td>SpeedVac 농축기</td><td></td><td></td>, <td>진공 농축기</td></tr>, <tr><td>스트렙타비딘, 마그네틱 세파로스 비드,</td><td>Cytiva(공식 GE)</td><td>28-9857-99</td><td>비오틴화 단백질 농축,</td></tr><tr><td>스트렙타비딘, 알렉사 플루어, 680, 접합체</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S32358</td><td>비드 적정을 위한 도트 블롯 분석 수행</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td></td><td></td><td>온도 제어 믹서</td></tr><tr><td>트리플루오아세트산(TFA)</td> <td>밀리포어 시그마</td><td>302031</td><td>펩타이드 탈염용</td></tr><tr><td>트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염(TCEP)</td> <td>단백질 분해용</td> <td>밀리포어 시그마</td><td>C4706</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152500</td><td>용해 버퍼, 도트 블롯 분석 완충액, 비드 세척 완충액</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Thermo Fisher Scientific BP151500</td><td></td><td>비드 세척 완충액</td></tr><tr><td>TROLOX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>648471</td><td>근접 라벨링 담금질 완충액, 용해 완충액</td></tr><tr><td>트립신/Lys-C 혼합물, 질량 분석기 등급</td><td>Promega</td><td>V5073</td><td>단백질 소화용</td></tr><tr><td>TWEEN&nbsp; 20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379</td><td>도트 블롯 분석 버퍼</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP169500</td><td>Beads wash and On-Beads Digestion Buffer</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7180</td><td>Cell Culture, Dish Coating</td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK inhibitor</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td>Cell Culture</td></tr></tbody></table>

뉴런 리소좀 상호작용과 근접 라벨링 단백질체학의 특성 분석

Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics

리소좀은 분해 및 기타 다양한 세포 기능을 달성하기 위해 다양한 생체 분자와 자주 통신합니다. 리소좀은 인간의 뇌 기능에 매우 중요한데, 뉴런은 유사분열 후 세포성이고 세포 항상성을 유지하기 위해 자가포식-리소좀 경로에 크게 의존하기 때문입니다. 다양한 리소좀 기능에 대한 이해의 발전에도 불구하고 리소좀과 다른 세포 구성 요소 간의 매우 역동적인 통신을 캡처하는 것은 특히 고처리량 방식으로 기술적으로 어렵습니다. 여기서, 최근 발표된 인간 유도만능줄기세포(hiPSC) 유래 뉴런에서의 내인(knock-in) 리소좀 근접표지 단백질체에 대한 상세한 프로토콜이 제공된다. 
리소좀 막 단백질과 반경 10-20nm 이내의 리소좀을 둘러싼 단백질은 살아있는 인간 뉴런에서 확실하게 식별하고 정확하게 정량화 할 수 있습니다. 프로토콜의 각 단계, 즉 hiPSC-뉴런 배양, 근접 라벨링, 뉴런 수확, 형광 현미경, 비오틴화 단백질 농축, 단백질 분해, LC-MS 분석 및 데이터 분석에 대해 자세히 설명합니다. 요약하면, 이 독특한 내인성 리소좀 근접 라벨링 단백질체학 방법은 살아있는 인간 뉴런에서 매우 역동적인 리소좀 활성을 연구하기 위한 고처리량의 강력한 분석 도구를 제공합니다.

이 리소좀 근접 라벨링 단백질체학 연구는 살아있는 뉴 런에서 동적 리소좀 미세 환경을 포착하기 위해 인간 iPSC 유래 뉴런에서 수행되었습니다. 상이한 시점에서의 hiPSC 및 hiPSC-유래 뉴런의 세포 형태가 도 2A에 예시되어 있다. 인간 iPSC는 E8 배지의 콜로니에서 자랍니다. 분화는 iPSC를 독시사이클린 함유 뉴런 유도 배지로 도금함으로써 시작됩니다. 신경 돌기 확장은 3 일 분화 동안 매일 더 잘 보입니다. 뉴런 배지에서 PLO 코팅 플레이트로 전환 한 후 뉴런은 뉴런 사이에 네트워크를 형성하고 뉴런이 2 주 만에 성숙함에 따라 축삭 확장이 더 잘 보입니다. i3뉴런에서 APEX 프로브의 국소화는 빠른 APEX 활성화 후 형광 현미경으로 검증됩니다. 비오틴화 단백질은 스트렙타비딘(SA) 항체를 사용하여 염색하고, 리소좀은 항-LAMP1 항체를 사용하여 염색합니다. 병합된 이미지는 미끼 단백질에 대한 LAMP1-APEX의 올바...

뉴런 리소좀 근접 라벨링 단백질체학 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 동적 리소좀 미세 환경을 특성화하기 위해 여기에 설명되어 있습니다. 리소좀 막 단백질 및 리소좀과 (안정적으로 또는 일시적으로) 상호 작용하는 단백질은 살아있는 인간 뉴런에서 우수한 세포 내 공간 분해능으로이 방법으로 정확하게 정량화 할 수 있습니다.

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to ...

리소좀은 세포의 쓰레기 처리 시스템입니다. 리소좀 활동은 매우 역동적이며 포착하기가 매우 어렵습니다. 이 연구에서 우리는 살아있는 인간 뉴런에서 리소좀 미세 환경을 해독하기 위한 근접 라벨링 단백질체학 접근 방식을 개발했습니다.이 접근법은 리소좀 막 단백질과 리소좀 및 iPSC 유래 뉴런과의 안정적이고 일시적인 상호 작용을 포착합니다. 리소좀 기능 장애는 다양한 뇌 질환과 크게 관련이 있습니다. 이 기술은 다양한 뇌 질환을 이해하고 새로운 치료법을 설계하기 위한 잠재적인 분자 표적을 제공하는 데 적용될 수 있습니다.근접 라벨링 절차를 시작하려면 현미경으로 뉴런을 관찰하여 살아 있고 건강한지 확인하십시오. 배양액에서 절반 부피의 배지를 취하여 비오틴 페놀과 혼합하고 섭씨 37도 인큐베이터에서 30분 동안 최종 농도 500마이크로몰로 뉴런에 다시 추가합니다. 새로 준비된 과산화수소 용액을 1 밀리몰 최종 농도로 뉴런 배양에 첨가하여 표지 반응을 시작합니다.1분 배양 후, 배지를 흡인하고 퀀치 완충액으로 배양물을 3회 헹굽니다. 플레이트를 기울여 모든 잔류 버퍼를 흡입합니다. 얼음처럼 차가운 용해 완충액을 첨가한 후, 세포 용해물을 차가운 1.5밀리리터 튜브에 긁어낸다.얼음처럼 차가운 수조에서 튜브를 100와트 이상으로 15분 동안 40초 켜고 20초 끄기의 교대 주기로 초음파 처리합니다. 세포 용해 후, 섭씨 영하 20도의 차가운 아세톤을 세포 용해물 용액의 4배 부피로 샘플에 첨가합니다. 와동을 잠시 하고 섭씨 영하 20도에서 3시간 동안 배양하여 단백질을 침전시키고 잔류물 비오틴 페놀을 제거합니다.세포 용해물 튜브를 섭씨 2도에서 10분 동안 16, 500배 G로 원심분리하고 단백질 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 섭씨 영하 20도에서 아세톤 1밀리리터로 펠릿을 두 번 세척한 다음 원심분리하여 상층액을 제거합니다. 다음으로, 단백질 펠릿을 진공 농축기로 1분 동안 건조시킨다.와류 또는 초음파 처리로 펠릿을 완전히 용해시키기 위해 세포 용해 버퍼를 추가하십시오. 20 마이크로 리터의 부분 표본을 취하여 DCA 분석으로 총 단백질 농도를 측정하십시오. 남은 세포 용액은 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.섭씨 영하 80도 냉동고에서 단백질 용해물 샘플을 채취하고 빠른 해동을 위해 샘플 튜브를 30초 동안 초음파 처리합니다. 소용돌이, 벤치탑 미니 원심분리기로 잠시 원심분리하고 샘플 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 250 마이크로 리터의 스트렙 타비딘 마그네틱 비드 슬러리를 각 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다.이 튜브를 마그네틱 랙에 1 분 동안 놓고 2 % 나트륨 도데 실 설페이트 용액 1 밀리리터로 비드를 3 번 씻고 잔류 완충액을 제거합니다. 세포 용해물의 총 단백질 농도 및 비드 적정 분석 결과에 기초하여, 250 마이크로리터의 스트렙타비딘 마그네틱 비드 슬러리에 필요한 단백질 샘플의 계산된 양을 첨가한다. 그런 다음 세포 용해 버퍼를 1 마이크로 리터의 총 부피로 자성 비드-용해물 혼합물에 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 튜브를 회전시킵니다.다음날, 벤치탑 미세 원심분리기에서 샘플 튜브를 잠시 원심분리하고 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 놓아 상청액을 제거합니다. 이어서, 비드를 실온에서 5분간 회전시키면서 1밀리리터의 세척 완충액 A를 사용하여 2회 세척한다. 각 세척 버퍼로 섭씨 4도에서 버퍼 B, 버퍼 C 및 버퍼 D를 사용하여 순차적으로 두 번 프로세스를 반복합니다.튜브를 마그네틱 랙에 1 분 동안 놓고 상층액을 제거하십시오. 이어서, 비드를 50밀리몰 트리스 완충액 중 100마이크로리터의 5밀리몰 TCEP에 재현탁시켜 섭씨 37도의 열혼합기에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 어둠 속에서 30분 동안 15밀리몰 IAA를 첨가하고 5분 동안 5밀리몰 TCEP를 첨가하여 잔류물 IAA를 켄칭한다. 미세 원심분리기에서 샘플 튜브를 잠시 원심분리하고 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 놓아 상층액을 제거합니다.50밀리몰 트리스 버퍼에 200마이크로리터의 5밀리몰 TCEP를 추가하여 비드를 재현탁합니다. 1 마이크로그램의 트립신/Lys-C 혼합물을 1, 200 RPM 및 섭씨 37도에서 14시간 동안 추가합니다. 14시간 후, 0.2마이크로그램의 트립신/Lys-C 혼합물을 3시간 동안 추가하고, 샘플 튜브를 회전시킨 다음, 1분 동안 마그네틱 랙에 놓습니다.그런 다음 펩타이드 상청액을 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 50 분 동안 흔들면서 50 마이크로 리터의 50 밀리몰 트리스 버퍼로 비드를 세척하고, 펩타이드 상청액을 결합하고, 30 마이크로 리터의 10 % 트리 플루오로 아세트산을 튜브에 첨가하여 pH를 3 미만으로 낮 춥니 다. 펩타이드 탈염 후 건조.LC-MS 분석을 위해 LC 완충액에 펩타이드 샘플을 재현탁시킨다. 상청액을 LC 샘플 바이알로 옮겨 나노 LC-MS로 분석합니다. LC-MS 분석법 파일에서 스트렙타비딘, 트립신 및 Lys-C와 같은 매우 풍부한 오염 물질 펩타이드 피크에 대한 특정 질량 및 머무름 시간 범위가 포함된 맞춤형 LC-MS 제외 목록을 추가합니다.단백질체학 데이터 분석 소프트웨어로 LC-MC 원시 데이터를 분석합니다. 스위스-프로트 호모 사피엔스 참조 데이터베이스인 두 개의 FASTA 라이브러리와 UniProt ID에 오염 물질 접두사가 있는 새로 구축된 범용 오염 물질 FASTA 라이브러리를 포함합니다.단백질 및 펩타이드 스펙트럼 일치 식별을 위해 1%거짓 발견률로 데이터 분석 매개변수를 설정합니다. 3 개의 누락 된 절단, 시스틴 카르 바 미딜 메틸화의 고정 변형, 메티오닌 산화의 가변 변형 및 단백질 말단 아세틸 화가있는 트립신 소화를 선택하십시오.무표지 정량화를 위해 펩타이드 MS-I 피크 강도를 내인성 비오티닐화 카르복실라제 PCCA로 정규화하고 근접 표지 실험의 변동을 줄입니다. 단백질체학 소프트웨어의 단백질 수준 결과를 Excel 파일로 내보냅니다. 통계 분석 전에 오염 단백질 및 PSM이 하나만 있거나 정량화 결과가없는 단백질을 제거하십시오.iPSC 뉴런의 상이한 시점에서의 세포 형태는 3 일의 분화 기간 동안 신경 돌기 성장을 보여 주었다. 뉴런 배지에서 폴리 -L- 오르니 틴 코팅 플레이트로 전환 한 후, 뉴런은 뉴런 사이에 네트워크를 형성하고 축삭 확장은 2 주 만에 성숙 후 더 잘 보이게되었습니다. 형광 영상에서, 비오틴화 단백질의 LAMP1 정점 활성은 스트렙타비딘에 의해 염색되고 뉴런에서 LAMP1 염색과 공동 국소화되었다.비드 적정 분석의 결과는 스트렙타비딘 비드 양을 증가시킬 때 포획되지 않은 비오티닐화 단백질 신호의 감소를 입증했습니다. 5마이크로리터의 스트렙타비딘 비드는 내인성 LAMP1 정점 샘플에서 50마이크로그램의 입력 단백질에 최적이었습니다. 트립신/Lys-C 혼합을 사용한 비드 상의 분해는 트립신 단독과 비교할 때 더 많은 단백질 및 펩타이드 식별과 누락된 절단을 줄였습니다.또한, 1 내지 1.5 마이크로그램의 트립신/Lys-C는 가장 많은 수의 확인된 단백질과 가장 낮은 비율의 결손 절단을 얻기 위해 비드 위 분해에 최적인 것으로 밝혀졌다. 알려진 리소좀 막 단백질은 LAMP1 정점에서 증가하였고 정점 대조군은 없었다. 내인성 비오티닐화 단백질은 매우 풍부하지만 변하지 않습니다.GO 용어 및 단백질 네트워크 분석은 안정적인 리소좀 막 단백질 및 엔도리소좀 트래피킹 및 수송과 관련된 일시적인 리소좀 인터랙터가 LAMP1 정점 단백질체학에서 풍부함을 시사했습니다. Apex 근접 라벨링은 산화 스트레스와 실험 변화를 줄이기 위해 정확히 1분 안에 담금질되어야 합니다. 우리는 최근에 비오틴화 단백질을 풍부하게 할 수 있는 절단 가능한 비오틴 방법을 개발했습니다.이 방법을 현재의 방법과 결합하면 스트렙타비딘과 내인성 비오티닐화 단백질의 간섭을 줄일 수 있습니다. 우리는이 방법을 뇌 질환을 일으키는 유전 적 변이가있는 야생형 및 돌연변이 뉴런 모두에 적용 할 수 있습니다. 이것은 유전 적 돌연변이가 인간 뉴런의 리소좀 미세 환경에 어떻게 그리고 왜 영향을 미치는지 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

characterization-neuronal-lysosome-interactome-with-proximity

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 동영상은 선충 세포에서 현장 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다. 관심 단백질의 근접성은 2차 항체에 부착된 PLA 프로브의 도움으로 원형 DNA 템플릿을 생성합니다. 프로브는 긴 단일 가닥 DNA를 생성한 후 검출기 프로브의 혼성화를 생성하는 증폭 용액을 사용하여 추가로 증폭되어 세포 내 단백질-단백질 상호 작용의 국소화를 가능하게 합니다.

In Situ 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석(Proximity Ligation Assay)

여기, 우리는 고정 된 세포에서 소포체와 미토콘드리아의 내생 적 상호 작용을 시각화하고 고감도로 정량화 할 수있는 절차를 설명합니다. 프로토콜은이 미토콘드리아 관련 막 계면에서 이노시톨에게 1,4,5- 트리 포스페이트 수용체 / 혈당 조절 단백질 75 / 전압 가변 음이온 채널 / 시클로 필린의 D 복합체 타겟팅 시츄 근접 결찰 분석법 최적화 기능.

소포체와 미토콘드리아의 상호 작용의 연구에 의해<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석 고정 세포의

단백질-단백질 상호 작용은 세포의 핵과 세포질 모두에서 발생할 수 있습니다. 이러한 상호 작용을 조사하기 위해 기존의 동시 면역침전과 현대의 근접 결찰 분석법이 적용됩니다. 이 연구에서는 이 두 가지 방법을 비교하여 핵과 세포질에서 NF90-RBM3 상호 작용의 분포를 시각화합니다.

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석

기재된 단백질 은 관심 있는 주어진 단백질및 무표지 질량 분석법의 면역친화성 농축을 사용하여 핵 세포 분획으로부터 단백질 상호작용 파트너를 식별하기 위한 프로테오믹스 워크플로우이다. 워크플로우에는 세포외 분획, 면역 침전, 필터 보조 시료 준비, 오프라인 정리, 질량 분석 법 및 다운스트림 생물 정보학 파이프라인이 포함됩니다.

대규모 핵 상호 작용 프로파일링을 위한 라벨 없는 면역 침전 질량 분광 워크플로우

여기서 설명된 것은 니코티아나 벤타미아나 잎 조직에서 NLR 면역 수용체의 TIR 도메인의 상호작용 파트너의 식별을 위한 근접 라벨링 방법이다. 또한 니코티아나 및 다른 식물 종에서 이 기술을 사용하여 관심 있는 다른 단백질 간의 상호 작용을 식별하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다.

단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보ID 기반 근접 라벨링

여기서, 우리는 질량 분광계 기지를 둔 proteomics에 의하여 감염 도중 호스트와 병원체 사이 상호 작용을 프로파일기 위하여 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 실험에서 호스트(예를 들어, 대식세포)와 병원체(예를 들어, Cryptococcus neoformans)의단백질 풍부도의 변화를 측정하기 위해 라벨이 없는 정량화를 사용합니다.

발견 중심의 숙주-병원균 상호 작용을 위한 라벨 프리 정량적 프로테오믹스 워크플로우

우리는 데이터 전처리, 공동 발현 클러스터링, 경로 농축 및 단백질 - 단백질 상호 작용 네트워크 분석을 포함한 상세한 프로토콜과 함께 정량적 단백체학 데이터에 대한 네트워크 분석을 수행하고 시각화하는 시스템 생물학 도구 JUMPn을 제시합니다.

JUMPn: 프로테오믹스의 단백질 공동 발현 클러스터링 및 네트워크 분석을 위한 간소화된 응용 프로그램

여기에서는 AT4G18020(APRR2)-AirID 단백질을 모델로 사용하여 오이(Cucumis sativus L.)에서 근접 라벨링(PL) 실험을 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 벡터의 구성, 아그로인 침투를 통한 구성물의 변형, 비오틴 침투, 단백질 추출 및 친화성 정제 기술을 통한 비오틴 표지 단백질의 정제를 설명합니다.

식물의 단백질-단백질 상호작용을 위한 AirID 기반 근접 라벨링

막 접촉 부위(MCS)를 연구하기 위한 새로운 접근법의 필요성은 이러한 세포 구조와 그 구성 요소 연구에 대한 관심이 증가함에 따라 증가했습니다. 여기에서는 MCS에 상주하는 세포 소기관 내 및 세포 기관 간 단백질 복합체를 식별하고 정량화하기 위해 이전에 사용 가능한 현미경 기술을 통합하는 프로토콜을 제시합니다.

근접 결찰 분석에 의한 ER-미토콘드리아 접촉 부위에서 내인성 세포 기관 내 단백질 상호 작용의 시각화 및 정량화

이 연구에서는 D. melanogaster 난소의 TurboID 기반 근접 표지(PL)에 대한 세부 프로토콜을 수립하여 비오틴 보충 및 난소 절제부터 이식유전자 발현 검증 및 질량 분석을 위한 비오틴화 펩타이드 농축에 이르는 단계를 다룹니다.

생체 내 Drosophila melanogaster에 TurboID 기반 근접 라벨링 적용

여기에서는 화학 프로브 및 질량 분석법을 사용하여 천연 세포 및 조직에서 질병 특이적 단백질-단백질 상호 작용을 포착하고 식별할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 결과 상호 작용 데이터 세트는 전용 웹 기반 플랫폼을 통해 분석되어 질병과 관련된 동적 네트워크 기능 장애 및 경로 변경을 밝힙니다.

질병에서 기능 장애 단백질-단백질 상호 작용 매핑

학습하세요 iPSC 유래 인간 뉴런에서 근접 라벨링 단백질체학을 이용한 리소좀 미세환경 분석 방법입니다. 이 기술은 뇌 질환 관련 리소좀 기능 이상을 이해하고 치료 표적을 발굴하는 데 활용됩니다.

뉴런 리소좀 상호작용과 근접 라벨링 단백질체학의 특성 분석

더 많은 동영상 탐색