Name: 양전자 방출 단층 촬영을 사용한 실험적 자가면역 뇌척수염 마우스 모델에서 CD19+ B 세포 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T12:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 학습하세요 PET 영상 기술을 사용하여 실험적 자가면역 뇌척수염 마우스 모델에서 중추신경계 CD19+ B 세포의 분포와 역학을 정량화하는 방법을. 이 기술은 척수 분석의 정확성과 재현성을 높여 신경면역학 연구에 활용됩니다.

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스탠포드 대학의 SCi3 소동물 이미징 시설과 PET/CT에 대한 기술 지원을 해준 Frezghi Habte 박사의 지원에 감사드립니다. LC-MS는 스탠포드 대학 질량분석법(SUMS) 핵심 시설의 핵심 직원이 수행하며, 이 서비스를 제공해주신 직원들에게 감사드립니다. hCD19-mAb를 매우 친절하게 제공해준 Horizon Therapeutics와 특히 Jodi Karnell의 기술 지도와 지원에 감사드립니다. 이 연구는 NIH NINDS(1 R01 NS114220-01A1)의 자금 지원을 받았습니다.

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<li>Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+imaging+of+neuroinflammation+using+%5B11C%5DDPA-713+in+a+mouse+model+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PET imaging of neuroinflammation using [11C]DPA-713 in a mouse model of ischemic stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57243(2018).</li>
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<li>James, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+B+cells+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis+using+64Cu-Rituximab+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging B cells in a mouse model of multiple sclerosis using 64Cu-Rituximab PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1845-1851 (2017).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-mediated+methodology+for+the+site-specific+radiolabeling+of+antibodies+based+on+catalyst-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).</li>
<li>Lyons, J. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+are+critical+to+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+by+protein+but+not+by+a+short+encephalitogenic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells are critical to induction of experimental allergic encephalomyelitis by protein but not by a short encephalitogenic peptide.</a> European Journal of Immunology. 29 (11), 3432-3439 (1999).</li>
</ol>

CD19 항체는 호라이즌 테라퓨틱스(Horizon Therapeutics)에서 제공했다.

이 논문에서는 CD19-PET를 사용하여 MS의 마우스 모델에서 인간-CD19+ B 세포를 이미징하는 간소화된 방법에 대해 설명합니다. 다발성경화증의 이질적인 양상과 치료에 대한 다양한 반응으로 인해 임상에서의 관리가 어려울 수 있으며 치료법 선택 및 모니터링을 위한 새로운 접근 방식이 크게 필요합니다. PET 이미징은 질병 진행 및 B 세포 고갈 요법에 대한 개별 반응을 모니터링하는 강력한 도구 역할을 할 수 있습니다. 다발성경화증 외에도 CD19-PET 영상은 림프종 및 백혈병 또는 기타 B 세포 매개 질환의 아형에서 치료 후 B 세포 고갈을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜과 대표 데이터는 신경 질환에서 B 세포 이미징의 유용성을 보여줍니다.
다발성경화증의 맥락에서 인간 CD19+ B 세포를 연구하기 위해 B 세포 의존성 MOG1-125 EAE 모델7을 선택했습니다. 다른 EAE 모델과 유사하게, 이 모델은 중추신경계(CNS)로의 면역 세포의 점진적 마비 및 침윤 증상을 나타냅니다. 그러나 MOG1-125 모델은 B 세포 기반 모델이라는 점에서 독특합니다: 마우스는 수막, 뇌간, 실질 및 심실의 지주막하 공간에 다양한 수의 B 세포를 포함합니다. 이러한 림프구는 이 부위 전체에 드문드문 흩어져 있거나 난포와 같은 구조를 형성할 수 있으며, 이는 다발성경화증 8,9 환자에서도 관찰됩니다. 순진한 마우스를 대조군으로 사용하는 것 외에도 완전한 Freund's adjuvant(CFA) 전용 유도 키트를 사용할 수 있습니다(즉, MOG 단백질을 사용하지 않고 EAE 마우스에 투여된 것과 동일한 유도 에멀젼). EAE 마우스 모델에서 혈액 뇌 장벽(BBB)은 기능 장애를 일으켜 항체와 같은 더 큰 개체가 교차할 수 있도록 합니다. CD19-mAb 방사성 추적자는 B 세포가 존재하는 경우에만 CNS에 결합하고 남아 있습니다. 추적자는 B 세포가 존재하지 않는 경우 혈액 풀로 다시 순환합니다. 우리는 감마 카운팅과 조직의 방사능 수준을 측정하기 전에 관류를 통해 CNS 조직의 생체 외 자가방사선 촬영을 사용하여 이를 입증했습니다. 또한 CNS1,2에서 B 세포를 검출하기 위해 mAb 기반 PET 방사성 추적자(즉, immunoPET 이미징 접근법)를 사용하는 것을 보고한 이전 간행물에서도 이를 입증했습니다.
DOTA 킬레이터는 구리-64 표지 펩타이드 및 항체를 사용한 임상 PET 이미징에 사용되어 왔기 때문에 사용되었으며, 다발성경화증 환자의 임상 이미징을 위해 hCD19-mAb를 번역하는 것을 목표로 하고 있습니다. DOTA는 생체 내에서 구리-64에 대한 적절한 결합 친화도를 가지고 있습니다. 생체 내 안정성은 유리 64Cu가 간으로 이동하여 결합 된 방사성 추적자의 신호를 모호하게 할 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 따라서 다른 장기와 비교하여 상대적인 신호를 계산하기 위해 간의 신호를 측정하는 것이 중요합니다. 근육은 전형적으로 대조 조직으로 가지고 갑니다, 그러나 EAE의 경우에는, 근육에서 존재하는 염증이 있을 수 있습니다. 64Cu의 반감기는 12.7시간으로, PET로 신호를 측정할 수 있도록 하면서 DOTA-hCD19-mAb가 표적에 결합할 수 있는 충분한 시간을 제공합니다. 접합체를 준비할 때 원하는 DOTA/mAb 비율을 생성하기 위해 mAb에 추가할 DOTA의 양을 결정하기 위해 소규모(75-125μg) 테스트 반응을 수행해야 합니다(예: mol mAb당 6-10배 초과 DOTA-NHS-에스테르 반응은 1-2 DOTA/mAb의 접합체를 제공할 수 있음). 반응 시간 및 온도(예: 2-4시간 또는 4°C 또는 실온에서 야간)도 DOTA/mAb 비율에 영향을 미치므로 최적화해야 합니다. 비방사성 구리를 사용한 적정을 수행하여 mAb당 DOTA 수를 계산할 수 있습니다. 그러나 보다 안정적이고 정확한 결과를 위해 MALDI-MS 및/또는 LC-MS를 수행하는 것이 좋습니다.
계산된 DOTA/mAb 비율은 특정 샘플에 대한 평균값이며 약간의 변동이 예상됩니다. MALDI의 경우, 접합 및 비접합 mAb에 대해 샘플당 여러 번의 샷을 촬영합니다. 그런 다음 접합 대 비접합 비율을 계산하여 평균 DOTA/mAb 수를 결정합니다. DOTA/mAb 비율이 중요한 이유는 너무 많은 킬레이터가 항체 결합을 방해하고 너무 적으면 일관되지 않은 방사선 표지와 낮은 신호로 이어지기 때문입니다. 비율은 일관된 신호 강도와 결합 역학을 유지하기 위해 켤레 배치 간에 매우 가까워야 합니다. 이상적으로는 특정 연구 내의 모든 실험에 동일한 켤레 배치를 사용해야 합니다. 과접합 가능성으로 인한 면역 반응에 대한 잠재적 영향을 줄이기 위한 유망한 기술은 부위 특이적 접합(site-specific conjugation)10 을 사용하는 것인데, 이 접합체는 항체의 중쇄 글라이칸에서 부위 선택적이어서 mAb당 1개의 킬레이트제를 추가할 수 있습니다.
방사성 표지 반응 조건은 항체, DOTA/mAb 비율 및 64Cu 몰 활성의 차이가 방사성 표지에 영향을 미치기 때문에 최고의 표지 효율과 수율을 보장하도록 최적화되어야 합니다. 최적의 64Cu 대 mAb 접합체 비율을 사용하면 정제 없이 방사성 추적자를 사용할 수 있으므로 방사성 표지에 필요한 시간과 중력 흐름 컬럼 및 방사성 붕괴로 인한 손실을 줄일 수 있습니다. 동일한 64Cu to mAb 접합체 비율을 사용할 때도 일관되고 신뢰할 수 있는 몰 활성을 얻을 수 있으며, 이는 여러 마우스 코호트 또는 이미징 연구에서 결과를 비교할 때 특히 중요합니다. ITLC 조건은 각 사용자에 맞게 수정될 수도 있습니다. 정제가 필요한 경우 몰 활성을 계산할 수 있도록 HPLC 및/또는 UV/Vis 분광광도법에 대한 부분 표본을 저장해야 합니다.
이미징을 위해 방사성 표지 항체를 사용하는 것은 어려울 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 방사성 추적자에 사용되는 항체는 생리학적 영향을 미치지 않도록 생물학적으로 불활성이어야 합니다. 또한 항체는 혈액 체류 기간이 길기 때문에 이미지 품질을 손상시키지 않으면서 적절한 신호-배경 신호를 보장하기 위해 주어진 mAb의 순환, 결합 및 청소를 충분히 오래 기다려야 합니다. 일반적으로 64 Cu 표지 mAb의 경우 20-48시간을 기다리는 것으로 충분하지만, 주어진 설치류 모델에서 이미징을 위한 최적의 시점을 결정하기 위해 새로운 mAb PET 추적자를 평가할 때 주입 후 2, 4, 6, 12, 24, 48시간에 이미징해야 합니다. 신호 대 배경 비율이 가장 높은 ARG 이미지를 획득하는 경우에도 마찬가지입니다. 이 프로토콜의 대표 이미지는 주입 후 18-20 시간에 촬영되었지만 사용 된 방사성 동위 원소에 따라 다른 시점이 사용될 수 있습니다. CD19의 서로 다른 에피토프에 결합하는 서로 다른 항체는 다양한 결과를 생성하므로 엄격하게 특성화해야 합니다.
척수 신호를 분석할 때 호흡으로 인한 움직임을 줄이기 위해 스캐닝 베드에서 마우스를 등을 대고 앉히는 것이 중요합니다. 또한 누운 자세는 EAE 질병의 진행으로 인해 척추 만곡이 증가한 마우스의 척추를 곧게 펴는 데 도움이 될 수 있습니다. 척추와 척수의 신호 검출을 목표로 할 때 고려해야 할 또 다른 중요한 측면은 해당 부위의 관련 면역 반응으로 인해 주사 부위가 추적자와 결합할 수 있으므로 측면에 MOG1-125 를 주입하지 않는 것입니다. 주사 부위가 가까우면 척수 분석을 방해할 수 있습니다. 따라서, 흉부에서의 주사는 본원에 기재된 용도에 바람직하다.
사용되는 이미지 분석 기술은 CNS 이미징에만 해당됩니다. 이미지 분석 소프트웨어 내의 뇌 아틀라스 도구는 PET 및 CT의 등록이 정확하다면 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다. 반자동 3D 뇌 지도책을 사용하고 각 쥐의 두개골에 맞게 조정하면 동물 간에 일관된 ROI를 얻을 수 있습니다. 현재 척수의 신호를 분석하기 위한 자동 또는 반자동 접근 방식이 없기 때문에 수동 ROI를 도출해야 합니다. 특히, CD19+ B 세포(또는 골수와 척수 모두에 존재하는 모든 세포 유형)를 정량화할 때 척추와 골수에서 발생하는 신호를 최대한 제거하는 것이 중요합니다. 그 이유는 순진한 생쥐가 EAE 생쥐보다 골수에 더 많은 CD19+ B 세포를 포함하는 것으로 알려져 있기 때문이며, 이 생쥐에서 B 세포는 말초를 떠나 중추신경계 5,11에 침투합니다. 이 골수 신호는 척수의 실제 신호를 모호하게 할 수 있습니다.
척추와 골수에서 오는 신호의 기여를 최소화하면서 실제 척수 신호를 묘사하기 위해 CT 이미지의 Otsu 임계값을 사용하여 척추에 대한 불변의 ROI를 만들 수 있습니다. 그런 다음 척추 내에서 별도의 척수 ROI를 쉽게 그릴 수 있습니다. 대퇴골의 골수를 측정하는 데에도 동일한 기술을 적용할 수 있습니다. 이것은 척수의 추적 결합에 대한 통찰력을 얻는 데 매우 유용한 방법입니다. 그러나 PET의 공간 분해능이 상대적으로 낮고 마우스의 작은 해부학적 영역을 스캔할 때 부분 부피 효과와 관련된 문제로 인해 추가적인 생체 외 확인 기술(예: 감마 카운팅, ARG)을 사용하면 혈액, 뇌척수액 또는 척추로부터의 유출 신호의 존재 없이 척수에서 방사성 추적자 결합을 검증할 수 있습니다.
자궁경부/흉부 척수의 신호는 질병의 중증도와 적응 면역 반응 중에 얼마나 많은 B 세포가 침투하는지에 따라 EAE 마우스에서 달라지는 경향이 있습니다. 침윤하는 B 세포의 수와 순진한 쥐의 골반/척추 골수에 비해 중추신경계의 B 세포 수가 적기 때문에 생쥐에서 척수 조직의 생체 내 정량 분석이 어려울 수 있습니다. 소동물 영상에서 PET의 공간 분해능을 감안할 때, 골수의 신호가 척수 신호로 흘러 넘칠 수 있습니다. 여기에서 완료된 생체 외 생체 분포 및 자가방사선 촬영은 척추뼈와 척수 조직의 PET 신호를 검증하는 데 도움이 됩니다. 생쥐는 해부 전에 관류되어 혈액 풀에서 결합되지 않은 추적자를 제거하여 감마 계수 및 자가 방사선 촬영 결과가 해당 기관의 혈액 풀에 있는 추적자가 아닌 각 장기에 실제로 결합된 추적자를 반영하도록 합니다.
방사성 추적자는 혈액을 통해 순환하며, 특히 항체 추적자의 경우 초기 주입 후 몇 주 동안 혈액에 결합되지 않은 방사성 추적자가 존재하는 경우가 많습니다. 우리는 많은 혈관을 가지고 있는 뇌와 척수를 촬영하고 있기 때문에, 신호의 어느 부분이 실제로 관심 있는 뇌/조직의 추적자 결합에 의한 것인지와 혈액 풀에 존재하는 것의 어느 부분이 원인인지 이해하는 것이 중요합니다. 따라서 뇌 신호를 심장/혈액 웅덩이의 신호로 나눌 필요가 있습니다. 임상 환경에서는 척추뼈의 Otsu 임계값 및 척수 조직의 ROI와 동일한 이미지 분석 기술을 정량화에 사용할 수 있습니다. 생쥐에 비해 인간의 조직 부피가 더 크다는 점을 감안할 때, 부분 부피 효과의 영향이 현저히 적어 정확도가 향상되고 생체 내 결과를 확인하기 위한 생체 외 기술의 필요성이 없어집니다. 클리닉에서 PET를 사용하면 임상의가 개별 B 세포 부담에 따라 각 환자에 대한 맞춤형 치료를 할 수 있습니다.
ARG는 뇌간 및 소뇌와 같은 작은 영역에서 추적자 결합의 공간적 위치를 보다 정확하게 묘사할 수 있도록 고해상도 이미지를 획득하는 데 특히 유용합니다. 면역조직화학적 염색을 위해 동일한 절편 및/또는 인접 절편을 저장하여 B 세포의 존재를 확인할 수 있습니다. 이전에 CD45R/B220(보충 그림 S1)으로 중추신경계 조직을 염색하여 B 세포의 수를 PET 및 ARG 신호 5,9와 연관시켰습니다. 그런 다음 염색을 ARG 결과와 공간적으로 비교하여 방사성 추적자 신호가 염색 패턴과 일치하는지 확인할 수 있습니다. B 세포는 클러스터로 존재하거나 뇌간 전체에 확산될 수 있습니다. PET 감도는 신호를 측정하기에 충분히 높으며, 이는 임상 번역에 고무적입니다. 척수 ARG의 경우 척추뼈에서 척수를 제거하면 측정된 신호가 골수 및/또는 혈액이 아닌 척수 조직의 추적자 결합으로 인한 것이므로 부분적인 부피 효과로 인해 PET 이미지가 흐려질 수 있습니다.
ARG와 유사하게, 체외 감마 계수는 개별 장기의 방사성 신호를 정량화할 수 있습니다. 이 특정 기술의 경우 감마 카운터에 튜브를 배치하기 전에 조직의 습윤 중량을 측정하고 해당 튜브의 바닥에 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 튜브에는 마우스 번호와 조직이 표시되어야 올바른 튜브가 사용됩니다. 그런 다음 교정된 저울에서 튜브의 무게를 측정하고 장기를 마이크로그램(0.0001mg)의 가장 가까운 10분의 1로 삽입합니다. 일부 조직은 매우 작으며 전후 난관 질량의 차이는 0.0001mg 정도입니다. 조직은 수분 손실을 방지하기 위해 해부 직후 무게를 측정해야 하며, 이로 인해 질량이 낮아집니다. 체중 측정 후 ARG를 위해 뇌와 척수 튜브를 동결하기 전에 건조를 방지하기 위해 PBS로 채워야 합니다.

다발성경화증은 면역 매개 신경 장애입니다. 각 환자의 고유한 증상은 환자와 임상의의 관리를 어렵게 만들 수 있습니다1. 이 질환 자체는 뇌와 척수에 탈수초성 병변과 면역세포 침윤이 존재하여 신체적, 인지적 장애를 초래하는 것이 특징이다2. 다발성경화증이 T 세포 매개 질환이라는 전통적인 패러다임은 B 세포의 CD20+ 하위 집합을 표적으로 하는 치료제인 리툭시맙3의 획기적인 2상 임상 시험에서 처음으로 도전을 받았습니다. 이후 더 넓은 범위의 B 세포에서 발현되는 pan B 세포 바이오마커인 CD194를 표적으로 하는 추가 B 세포 치료법이 개발되었으며, 이는 진단 및 치료적으로 모두 유리할 수 있습니다. 더욱이, 치료 효능을 평가하기 위한 기존 방법(즉, 재발 횟수 및 자기공명영상(MRI) 활동 모니터링)은 반응의 조기 측정을 제공하지 못하므로 환자는 차선의 치료법 선택 및 최적화로 인해 중추신경계 손상의 상당한 위험에 처하게 됩니다. 따라서 다발성경화증 환자의 중추신경계와 말초에서 CD19+ B 세포와 같은 특정 면역 세포를 실시간으로 모니터링하기 위한 전략이 절실히 필요합니다.
PET 이미징은 CD19와 같은 특정 관심 대상의 생체 내 전신 시각화를 가능하게 하는 강력한 이미징 기술입니다. 채혈, 재발률 기록, MRI를 통한 병변 모니터링은 치료 효과에 대한 스냅샷을 제공하는 반면, PET 이미징을 통해 연구자와 임상의는 전신에 걸친 치료의 효과를 모니터링할 수 있습니다. 치료 모니터링에 대한 이러한 사전 예방적 접근 방식을 통해 임상의는 실시간으로 약물 효과를 평가하여 필요에 따라 신속하게 조정할 수 있습니다. 질병과 관련된 세포 집단의 위치와 밀도를 모니터링하면 환자별 해부학적 정보를 사용하여 중증도에 대한 종단적 평가도 가능합니다. 따라서 임상 및 전임상 환경에서 PET 이미징의 잠재력을 최대한 활용할 수 있도록 재현 가능한 분석 방법을 확립하는 것이 중요합니다.
이 논문은 인간 재조합 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 1-125(MOG 1-125)를 사용하여 인간 CD19(hCD19)를 발현하는 형질전환 마우스에서 유도된 MS의 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 마우스 모델에서 16C4-TM(64 Cu-hCD19-mAb)으로 알려진 64Cu 표지 항인간 CD19 단클론 항체(mAb)를 사용하여 CD19+ B 세포의 PET 이미징, 체외 감마 계수 및 자가 방사선 촬영(ARG)을 수행하는 방법(그림1)을 설명합니다). 또한 뇌와 척수에서 방사성 추적자 결합을 정확하고 재현 가능하게 평가하는 방법을 제공하며, 이 두 가지 중요한 발병 부위는 이 모델과 다른 신경 퇴행성 모델에서 종종 심각하게 영향을 받습니다. 이러한 기술을 통해 질병 병리학에서 B 세포의 역할에 대한 비침습적 조사가 가능하며 다발성경화증에서 항 B 세포 치료제의 효능을 평가하기 위해 임상적으로 번역될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 mL 50 kDa MWCO 원심분리 필터</td><td>MiliporeSigma</td><td>UFC505008</td><td>원심 필터</td></tr><tr><td>64Cu-CuCl3</td><td>Washington University in St. Louis; 위슨신 대학교, 매디슨; 또는 다른 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AR-2000 Radio-TLC 이미징 스캐너</td><td>Eckert & Ziegler</td><td>AR-2000</td><td></td></tr><tr><td>자동 방사선 촬영 카세트</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-21700-34</td><td>알루미늄, 8" x 10"</td></tr><tr><td>자동 방사선 촬영 필름</td><td>&nbsp; GE Life Sciences</td><td>28-9564-78</td><td>저장 형광체 스크린 BAS-IP SR 2025 E 초고해상도, 20 x 25cm, 화면 전용</td></tr><tr><td>버터플라이 니들 카테터</td><td>SAI 주입 기술</td><td>BLF-24</td><td></td></tr><tr><td>DOTA-NHS-에스테르</td><td>매크로사이클릭스</td><td>B-280</td><td></td></tr><tr><td>EAE 유도 키트</td><td>Hooke Laboratories</td><td>EK-2160</td><td></td></tr><tr><td>가이거 계수기</td><td>Ludlum</td><td>14C</td><td></td></tr><tr><td>GNEXT PET/CT 스캐너</td><td>Sofie</td><td>GNEXT</td><td></td></tr><tr><td>Hidex 자동 감마 카운터</td><td>Hidex</td><td>AMG</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 컬럼</td><td>Phenomenex</td><td>&nbsp; 00H-2146-K0</td><td>5 &무; m SEC-s3000 400 &Aring;, 300 x 7.8 mm</td></tr><tr><td>Illustra NAP-5 컬럼</td><td>Cytiva 17085301</td><td></td><td>DNA 중력 컬럼</td></tr><tr><td>이미지 J</td><td>NIH</td><td></td><td>ARG 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Low Protein Binding Collection Tubes (1.5 mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI90410</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>840281400</td><td>UV-Vis 마이크로/나노 분광 광도계</td></tr><tr><td>PCR 튜브 0.2 mL, DNA 등급</td><td>Eppendorf</td><td>30124707</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 형광체 이미저 9410</td><td>GE Healthcare</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>VivoQuant</td><td>Invicro</td><td>버전 4 패치 3</td><td>PET 분석 소프트웨어용; Brain Atlas 애드온</td></tr><tr><td>Zeba 스핀 탈염 컬럼, 7K MWCO, 0.5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI89882</td><td>탈염 컬럼</td></tr> 구매 필수</tbody></table>

양전자 방출 단층 촬영을 사용한 실험적 자가면역 뇌척수염 마우스 모델에서 cd19+ b 세포 이미징

Imaging CD19+ B Cells in an Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mouse Model using Positron Emission Tomography

다발성 경화증(MS)은 젊은 성인에게 영향을 미치는 가장 흔한 탈수초성 중추신경계(CNS) 질환으로, 질병이 진행됨에 따라 종종 신경학적 결손과 장애를 초래합니다. B 림프구는 다발성경화증 병리학에서 복잡하고 중요한 역할을 하며 임상 시험에서 여러 치료제의 표적이 되고 있습니다. 현재로서는 특정 항-B 세포 치료에 대한 환자를 정확하게 선택하거나 이러한 치료가 중추신경계 및 말초 장기의 B 세포 부하에 미치는 영향을 비침습적으로 정량화할 수 있는 방법이 없습니다. 양전자 방출 단층 촬영(PET) 이미징은 생체 내 시공간 분포 및 살아있는 피험자에서 B 세포의 부담에 관한 매우 구체적이고 정량적인 정보를 제공할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다.
이 논문은 인간 재조합 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 1-125로 유도되는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 잘 확립된 MS의 잘 정립된 B 세포 기반 마우스 모델에서 인간 CD19+ B 세포에 특이적인 PET 추적자를 합성하고 사용하는 방법을 보고합니다. 여기에서는 in vivo PET 이미징을 사용하여 뇌와 척수에서 CD19+ B 세포를 검출하고 정량화하는 데 최적화된 기술을 설명합니다. 또한 이 논문은 중추신경계 조직에서 CD19 추적자 결합의 고해상도 자가방사선 촬영과 함께 골수, 척수 및 비장을 포함한 질병 관련 장기의 생체 외 감마 계수를 위한 간소화된 방법을 보고합니다.

hCD19-mAb는 그림 2와 같이 DOTA 접합 및 64Cu로 방사성 표지되었습니다. EAE 및 순진한 마우스는 64Cu-DOTA-hCD19-mAb를 주사한 후 18-24시간 후에 PET/CT 스캔을 받았습니다(그림 3). PET/CT 이미지는 PET 분석 소프트웨어를 사용하여 공동 등록하고, CNS 조직은 수동 ROI 또는 반자동 3D 뇌 지도책을 사용하여 분석했습니다. ROI의 방사성 추적자 결합(그림 4)은 순진한 마우스보다 EAE 마우스에서 더 높았습니다. 생체 외 감마 계수 및 ARG는 순진한 마우스에 비해 EAE 마우스의 척수(요추 및 경추 흉부 분절 모두)와 뇌(ARG만 해당)의 결합이 증가했음을 보여주었습니다(그림 5 및 그림 6). 관류된 마우스의 생체 외 감마 계수는 또한 비장, 대퇴골 및 골수를 포함한 말초 장기에서 방사성 추적자 결합이 감소한 것으로 나타났으며(그림 5), 이 EAE 모델에서 B 세포가 말초를 떠나 CNS에 침투하는 것과 일치했습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig02.jpg"> 그림 2: 품질 관리 데이터 외에도 64개의 Cu 표지된 인간 특이적 CD19 단클론 항체, 16C4-TM mAb(64Cu-DOTA-hCD19-mAb)를 생성하기 위한 접합 및 방사성 표지 체계. (A) hCD19-DOTA 접합체(스케일 아님)를 생성하기 위해 DOTA-NHS-에스테르와 hCD19 단클론 항체의 반응 및 64 Cu-CuCl3와 방사선 표지를 하여 64Cu-DOTA-hCD19-mAb를 생성합니다. (B) 대표적인 ITLC 크로마토그래피. 40-60cm의 피크는 방사성 표지 항체입니다. 결합되지 않은 64Cu-CuCl3 는 이동상과 함께 이동하며 200 내지 240 cm까지 존재할 것이다. 이 크로마토그래프에는 검출 가능한 유리 64Cu-CuCl3 이 없습니다. (C) 방사성 표지 항체의 품질 관리 사양. 약어: DOTA-NHS 에스테르 = 1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid mono-N-hydroxysuccinimide ester; ITLC/HPLC = 순간 박막 크로마토그래피/고성능 액체 크로마토그래피; MALDI/LC-MS = 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화/액체 크로마토그래피-질량분석법; CPM = 분당 카운트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig03.jpg"> 그림 3: 움직임을 최소화하면서 척수와 뇌의 고품질 이미징을 가능하게 하기 위해 PET 스캐너 내에서 3D 프린팅 베드에 마우스를 고정하는 방법을 보여주는 사진. (A) 발열체와 마취 튜브가 장착된 3D 프린팅된 4개의 마우스 스캐너 베드("마우스 호텔"이라고도 함). (B) 척추의 직진도를 최대화하기 위해 앙와위 자세에서 마취된 마우스; 각 마우스의 베드 위치가 기록됩니다. (C) 생쥐는 호흡에 영향을 주지 않으면서 뇌의 움직임을 최소화하기 위해 머리를 가로질러 테이프를 단단히 붙이고 배를 가로질러 호흡의 움직임을 최소화했습니다. (D) 마우스 베드가 스캐너 내에 배치되고 스캐닝 베드에 테이프로 고정되어 있습니다. 마취 튜브를 스캐너에서 침대로 연결하고 이소플루란을 2%로 설정했습니다. 스캐너 도어를 닫기 전에 적절한 이소플루란 수준을 보장하기 위해 마우스 호흡을 모니터링했습니다. 약어: PET = 양전자 방출 단층 촬영. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig04.jpg"> 그림 4: PET 분석 소프트웨어를 사용한 척수 이미지 및 뇌 분석 및 결과. (A) i) 흉추 및 경추에서 요추를 분리하고 오츠 임계값 설정을 위한 이미지를 준비하기 위해 척추에 그려진 ROI(분홍색 및 황갈색). ii ) 척추뼈(청록색 및 빨간색)는 Otsu Thresholding을 사용하여 분할되었습니다. iii ) 그런 다음 척추뼈를 3D ROI 메뉴에서 변경할 수 없도록 만들고 척수를 경추/흉부(보라색) 및 요추(네이비) ROI로 나눕니다. iv) 척추 ROI를 제거하고 척수 ROI와 대표 뇌 아틀라스를 적용했습니다. (B) %ID/g로 표현된 다양한 중추신경계 영역의 PET 결과의 대표 분석은 각 동물 내 심장의 ROI로 정규화되었습니다. PET 획득은 PET/CT 이미징을 통한 10분 정적 스캔이었습니다. 패널 A에 표시된 반자동 뇌 아틀라스 접근 방식을 사용하여 정량화된 뇌 영역. iv) 대표적인 결과는 뇌 및 흉부 척수에서 추적자 결합의 유의성 또는 유의한 증가 경향을 보여줍니다. 스튜던트 t-검정(*: p &lt; 0.0332)을 사용하여 수행된 통계량입니다. 약어: PET = 양전자 방출 단층 촬영; ROI = 관심 영역; CNS = 중추 신경계; CT = 컴퓨터 단층 촬영; %ID/g = 조직 그램당 주입된 투여량 비율; EAE = 실험적 자가면역 뇌척수염. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig05.jpg"> 그림 5: %ID/g로 표현된 EAE 및 순진한 마우스의 다양한 장기에서 체외 감마 계수의 대표적인 정량화. PET 스캔 후, 마우스에 PBS를 관류하여 혈액에 존재하는 방사성 추적자를 제거하고, 혈액에 상주하는 CD19+ B 세포에 결합한 방사성 추적자를 제거하고, 각 장기의 정확한 무게를 갖기 위해 장기를 신속하게 해부하고 무게를 측정했습니다. EAE 마우스의 비장과 골수에서 추적자 결합이 순진한 마우스에 비해 현저히 감소합니다. 증가된 방사성 추적자 결합은 EAE 마우스의 요추 및 경추/흉부 척수 분절 모두에서 관찰됩니다. 뇌는 방사성 추적자 신호가 크게 증가하지 않았지만 상당한 증가 추세를 보이고 있습니다. 스튜던트 t-검정(*: p &lt; 0.0332; ****: p &lt; 0.0001)을 사용하여 수행된 통계량입니다. 약어: PET = 양전자 방출 단층 촬영; %ID/g = 조직 그램당 주입된 투여량 비율; EAE = 실험적 자가면역 뇌척수염; PBS = 인산염 완충 식염수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig06.jpg"> 그림 6: Ex vivo ARG 이미지는 EAE의 시상 뇌 절편 및 전체 척수에서 64개의 Cu-DOTA-hCD19-mAb 결합을 순진한 마우스와 비교하여 보여줍니다. 디지털 형광체 저장 필름은 약 10번의 반감기(127시간 또는 5일) 동안 방사성 조직 샘플에 노출된 후 형광체 이미저를 사용하여 스캔했습니다. 결과 이미지는 순진한 마우스의 뇌 절편에 비해 EAE 마우스의 뇌에서 시각적으로 더 높은 신호를 보여주며, 이는 이 모델5에서 B 세포를 포함하는 것으로 알려진 영역으로 인해 예상됩니다. 특히, EAE 쥐 뇌 절편의 뇌간, 소뇌 및 심실에서 증가된 추적 신호가 있습니다. EAE 쥐 뇌 절편에 대한 신호의 이러한 증가는 위에서 자세히 설명한 전뇌 PET 정량화에서 발견된 내용을 반영합니다. 유사하게, 순진한 척수에 비해 경추/흉부 및 요추 척수 분절에서 방사성 추적자 결합이 증가했으며, 이는 생체 외 감마 계수를 사용하여 발견된 것을 반영합니다. 약어: PET = 양전자 방출 단층 촬영; EAE = 실험적 자가면역 뇌척수염; 벤트 = 심실; Cb = 소뇌; BS = 뇌간; TSc = 흉추 및 경추 척수 결합; LSc = 요추 척수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S1: CD45R/B220을 사용한 순진한 쥐 및 EAE 쥐 뇌 조직의 CNS 조직 염색. B 세포는 EAE 마우스의 뇌간, 수막 및 백질에서 관찰됩니다 (n = 7 EAE, n = 5 순진한 마우스, 동물 당 평균 4 개의 절편). 이 수치는 5부터입니다. 눈금 막대 = 시상 뇌 영상에서 5mm(저배율[1x]), 뇌간, 수막 및 소뇌 백질에서 100μm(고배율[20x]). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/Suppl%20Fig%201.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 논문은 인간 특이적 항-CD19 단클론 항체를 방사선 표지하는 방법론과 생체 내 PET 이미징, 생체 외 감마 계수 및 자가 방사선 촬영 접근법을 사용하여 다발성 경화증 마우스 모델의 중추 신경계 및 말초 조직에서 B 세포를 정량화하는 데 사용하는 방법을 자세히 설명합니다.

양전자 방출 단층 촬영을 사용한 실험적 자가면역 뇌척수염 마우스 모델에서 CD19+ B 세포 이미징

Multiple sclerosis (MS) is the most common demyelinating central nervous system (CNS) disease affecting young adults, often resulting in neurological ...

이 기술은 PET 이미징을 사용하여 중추 신경계에서 B 세포의 생체 내 분포 및 역학을 설명합니다. 우리의 접근 방식은 영향을 받은 척수로 인해 분석이 더 어려워지는 신경 질환을 연구하는 데 유용합니다. 따라서 우리 기술에는 몇 가지 주요 장점이 있습니다.먼저, 다양한 B 세포 서브셋을 캡처하고 생체 내에서 시각화할 수 있는 pan B 세포 바이오마커를 추적하는 새로운 도구를 만들었습니다. 둘째, 당사의 척수 분석 분석법은 이 부위의 PET 신호를 매우 정확하고 재현 가능한 정량화할 수 있습니다. 우리 기술의 가장 큰 장점은 질병에 구애받지 않는다는 것입니다.전임상부터 임상 PET 영상까지 B 세포 및/또는 척수가 관심 있는 모든 시나리오에서 사용할 수 있습니다. 방사선 표지를 하고 항체를 마우스에 주입한 후 18-24시간 후에 아이 젤을 눈에 도포하여 마우스가 스캔할 수 있도록 준비합니다. 4개의 마우스 스캐닝 베드에 이소플루란이 1.5%로 설정된 가열 패드가 장착되어 있는지 확인합니다.마우스를 스캐닝 베드의 누운 자세에 놓고 마우스 꼬리를 부드럽게 당겨 척추를 곧게 펴십시오.마우스가 누운 자세가 되면 부드러운 현미경 테이프로 머리와 배에 단단히 테이프로 붙여서 호흡 동작을 최소화합니다. 실험실 노트북에 각 마우스의 스캔 위치를 기록합니다. 첫 번째 그룹을 확보한 후 침대를 닫고 CT 스캔을 실행하여 침대 배치를 확인합니다.CT Center Field of View를 클릭하고 침대가 제자리에 있으면 CT 테스트 스캔을 실행하여 배치가 올바른지 확인합니다. 침대 위치가 만족스러울 때까지 반복합니다. 스캐너 베드에 작은 흰색 테이프를 붙여서 나머지 연구를 위한 올바른 베드 배치를 표시합니다.모션 컨트롤러 메뉴를 열고 PET Center Field of View를 클릭하여 마우스를 PET 링으로 이동합니다. 침대가 PET 링에 있으면 실행을 클릭하여 스캔 시퀀스를 시작하고 스캐너가 PET 스캔을 자동으로 완료할 때까지 기다렸다가 CT 획득을 위해 PET 링에서 CT로 이동합니다. 실험용 자가면역 뇌척수염(EAE)은 질병 진행으로 인해 척추의 만곡이 뚜렷하기 때문에 등을 대고 스캔하면 척추를 곧게 펴는 데 도움이 됩니다.동물의 등쪽을 절개하고 피부와 털을 제거하여 척추를 노출시킵니다. 목의 척추, 흉곽 바로 아래, 골반 상단을 통해 세 개의 횡평면을 따라 절단하여 요추와 경추 및 흉부 부위를 분리합니다. 분절된 척추를 조심스럽게 제거하여 요추와 경추 흉부의 두 조각을 얻습니다.그런 다음 요추 척수가 보일 때까지 골반 끝에서 척추를 조심스럽게 다듬어 요추 척주를 분리합니다. 요추 척수를 배출하려면 PBS로 채워진 슬립 팁 주사기를 사용하고 엄지와 검지를 사용하여 주사기와 척추 사이에 밀봉을 만듭니다. PBS를 주사기를 통해 부드럽게 밀어 흡수 패드로 척수를 배출하고 경추 쪽에서 주사기를 삽입하여 경추 흉추 척수에 대해 반복합니다.감마 카운팅 튜브에 척수 조직을 넣습니다. 건조 중량을 기록하고 PBS를 추가하여 조직이 튜브 바닥에 있는지 확인하여 건조를 방지합니다. 계산할 준비가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 놓습니다.척수의 관심 영역 분석을 시작하려면 탐색 메뉴에서 3D 관심 영역 도구를 엽니다. 관심 영역 머리글 아래에서 메뉴 하단의 더하기 기호를 사용하여 요추 관심 영역, 경추 흉부 관심 영역, 요추 골격, 흉부 골격, 요추 척수, 흉추 척수 등 6개의 관심 영역을 만듭니다. PET 신호의 시각적 간섭을 방지하려면 F3을 클릭하여 PET를 끕니다.3D 관심 영역 도구 연산자 상단으로 이동하여 커서 기호 오른쪽에 있는 실선을 클릭하여 3D 페인트 모드 및 침식/팽창 메뉴를 엽니다. 구를 선택하고 크기를 20픽셀로 변경합니다. 마찬가지로 팽창을 더하기 5로 설정합니다.계속 진행하기 전에 메뉴 하단으로 이동하여 요추 관심 영역이 선택되어 있는지 확인하십시오. CT에서 척추의 L6 척추를 찾습니다. L6 위의 척추 1개부터 시작하여 엉덩이 위의 5개 척추뼈 위에 대략적인 요추 관심 영역을 그립니다.그런 다음 관심 있는 경추 흉부 영역으로 전환하고 척추의 나머지 부분을 두개골 기저부까지 추적합니다. 일반화된 관심 영역을 그린 후 연산자의 맨 위로 이동하여 Segmentation Algorithms 메뉴를 선택합니다. 드롭다운 메뉴에서 Otsu Thresholding을 선택한 다음 입력에 대해 요추 관심 영역을 선택하고 메뉴 하단에서 요추 골격이 선택되었는지 확인합니다.Image(이미지) 옆의 드롭다운 메뉴에서 CT 스캔이 선택되어 있는지 확인합니다(여기에 숫자 0으로 표시됨). Apply(적용)를 클릭하고 경추 흉부 관심 영역과 흉부 골격에 대해 절차를 반복합니다. Otsu 임계값을 사용하여 골격 관심 영역을 만든 후 탐색 메뉴로 돌아가 관심 영역을 삭제하거나 거친 요추 및 경추 흉부 관심 영역 모두에 대해 H 열을 선택하여 숨깁니다.두 스켈레탈 관심 영역에 대해 I 열을 체크 표시하여 편집할 수 없도록 합니다. 마지막으로 3D Region of Interest Tool Operator의 상단으로 돌아가 3D Paint 메뉴로 이동하여 관심 척수 영역을 그립니다. [구] 도구를 다시 선택하고 요추와 흉부의 골격 내에서 척수를 추적하여 메뉴 하단에서 올바른 관심 영역이 선택되었는지 확인합니다.관심 영역을 지우려면 Command/Control을 클릭하고 지울 부분 위에 그립니다. 세 평면 모두에서 척수 관심 영역을 확인하여 관심 영역이 척추 외부에 그려져 있지 않은지 확인합니다. PET 신호가 꺼진 경우 척수 관심 영역을 그린 후 F3 키를 눌러 PET를 다시 켜거나 Visual Controller를 선택하고 PET 막대를 클릭합니다.탐색 메뉴로 돌아갑니다. 그리드 아이콘을 클릭하여 테이블을 표시합니다. 테이블을 스프레드시트 소프트웨어에 복사하고 파일을 저장합니다.PET 이미징은 순진한 쥐에 비해 EAE 쥐의 뇌와 흉부 척수에서 높은 방사성 추적자 결합을 보여주었습니다. 생체 외 감마 계수는 요추 및 경추 흉추 분절과 EAE 마우스의 뇌에서 결합이 증가했음을 보여주었습니다. 생체 외 자가방사선 촬영 이미지는 순진한 생쥐에 비해 EAE 생쥐의 시상 뇌 절편, 특히 뇌간, 소뇌 및 심실에서 방사성 추적자 결합이 증가했음을 보여주었습니다.유사하게, 증가된 방사성 추적자 결합은 순진한 척수에 비해 EAE 마우스의 경추 흉부 및 요추 척수 세그먼트 모두에서 관찰되었습니다. PET 이미징 및 감마 카운팅 후 유세포 분석 및 면역조직화학과 같은 분자생물학 기술을 통해 PET 신호와 관심 대상 간의 관계를 조사할 수 있습니다. 우리의 기술은 연구자들이 뇌졸중, 다발성 경화증, 기타 자가면역 질환 및 암을 포함한 여러 질병 영역에서 B 세포의 생체 내 역할에 대해 질문할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질과 불활성화된 결핵균의 조합을 주입하여 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하는 방법을 보여줍니다. 이 모델을 통해 연구원들은 질병 메커니즘을 연구하고 치료 개입을 테스트할 수 있습니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염 유도

이 동영상은 뇌로 이동하는 자가반응성 T세포를 활성화하기 위해 미엘린 유래 펩타이드에 보조제를 주입하여 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유발하는 방법을 보여줍니다. 백일해 독소는 혈액 뇌 장벽 투과성을 증가시켜 이러한 T 세포와 다른 면역 세포가 뇌로 들어갈 수 있도록 하기 위해 투여됩니다. 이러한 면역 세포는 탈수초화를 일으켜 신경 전달 장애와 EAE 발병을 유발합니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 발생

이 비디오에서는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 사용하여 다발성 경화증의 마우스 모델을 구축합니다. 마우스에 뉴런 펩타이드와 보조제가 포함된 에멀젼을 주입하여 자가반응성 T세포를 활성화하는 면역 반응을 유발합니다. 그 다음에는 백일해 독소(PTX)를 주입하여 혈액뇌장벽 투과성을 높여 자가반응성 T세포가 뇌에 침투할 수 있도록 합니다. 이 침투는 궁극적으로 수초성 손상을 초래하는 신호 폭포를 시작하여 다발성 경화증의 탈수초성 상태를 모방합니다.

이 원고는 다양한 질병 단계에서 각각 유세포 분석 및 정량적 PCR을 사용하여 림프절, 비장, 혈액 및 척수의 면역 세포 분포 및 mRNA 사이토카인 수치를 평가하는 방법과 함께 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델의 유도 및 채점 방법을 설명합니다.

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

우리는 생체 살아있는 생물 발광 및 근적외선 SJL / J 마우스에서 다발성 경화증에 대한 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 모델에서 시신경염과 뇌염의 이미징 기술을 보여준다.

마우스의 다발성 경화증의 EAE 모델에서 시신경염 및 뇌 염증의 생물 발광 및 근적외선 영상

여기, 선물이 vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 혈관 단위의 장애를 조사 하는 프로토콜. 우리는 특별히 명과 limitans에서 혈액-뇌 장벽 침투성 및 백혈구 마이그레이션에 관련 된 gelatinase 활동을 확인 하는 방법 주소.

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

이 원고는 마우스에서 활성 실험자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 중추신경계(CNS)에서 침투된 림프구의 분리 및 특성화 방법도 림프구가 CNS 자가면역 질환의 발병에 어떻게 관여하는지 보여주기 위해 제시된다.

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

이 프로토콜은 다발성 경화증의 동물 모델에서 양성막 방출 단층 촬영 (PET) 이미징에 의해 생체 내 골수 (탈량 및 재마일레네이션)에서 모니터링하는 것을 목표로합니다.

다발성 경화증의 리솔레시틴 쥐 모델에서 골린 함량의 생체 내 측정을 위한 양전자 방출 단층 촬영

이 프로토콜은 임상적으로 이용가능한 플랫폼으로 생체내에서 키메라 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 T 세포를 비침습적으로 추적하는 방법론을 기술한다.

키메라 항원 수용체 T 세포의 동적 이미징 [18F]테트라플루오로보레이트 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영

본 프로토콜은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질을 사용하는 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 임상 스코어링 시스템을 사용하여 질환 과정을 모니터링하는 것을 설명한다. 실험적 자가면역 뇌척수염 관련 증상은 마우스 대퇴골 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석 및 오픈 필드 테스트를 사용하여 분석되어 질병 과정을 종합적으로 평가합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 다양한 평가 지표

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증(MS)의 동물 모델로, 인간 질병과 강력한 체액성 자가면역 반응을 공유합니다. 여기에서는 EAE 면역 마우스의 혈청에서 자가항체를 정량화하기 위한 간단하고 유연한 ELISA 프로토콜을 보고합니다.

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice on Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (실험적 자가면역 뇌척수염 시 마우스의 자가반응성 항체 정량화)

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