Name: 배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 배우세요 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포를 차등 원심분리법으로 분리하고 형광 현미경으로 특성화하는 방법을. 이 재현 가능한 프로토콜은 세포 간 소통 및 치료 적용 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (32000974, 81930025 및 82170988)과 중국 박사후 과학 재단 (2019M663986 및 BX20190380)의 보조금으로 지원되었습니다. 우리는 기초 의학을위한 국립 실험 교육 시범 센터 (AMFU)와 공군 의과 대학 군사 의료 혁신 센터의 분석 및 테스트 중앙 연구소의 도움에 감사드립니다.

모든 동물 시술은 제4군 의과대학 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 국립 보건원(National Institutes of Health Guide)의 실험 동물 관리 및 사용 가이드(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었습니다. 8주령의 C57Bl/6 마우스(암컷 또는 수컷 모두 선호 없음)를 사용했습니다. 본 연구에 사용된 냉동보존된 인간 탯줄 유래 중간엽(UCMSC)은 상업적 공급원으로부터 입수하였다( 재료 표 참조). 인간 세포의 사용은 제 4 군 의과 대학 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 배양
<ol><li>피펫, 피펫 팁, 10cm 페트리 접시, 자동 온도 조절 장비(수조), 고무 장갑, 75% 알코올, 배양 배지(37°C에서 배양), 치명적인 소 혈청(FBS) 및 100x 페니실린-스트렙토마이신(P/S) 용액( 재료 표 참조).</li>
	<li>20% FBS와 1% P/S를 보충하여 시중에서 판매되는 α-MEM(alpha-Minimum Essential Medium)을 준비합니다. 알림: EV의 분리 및 분석에 사용되는 모든 용액을 초순수 여과수 정수 시스템으로 만든 초순수 여과수에 희석합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>냉동보존된 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(UCMSC)를 37°C 수조에서 녹여 액체 질소로부터 회수합니다.</li>
	<li>용융된 세포 현탁액을 5mL의 배양 배지가 있는 15mL 튜브로 빠르고 부드럽게 옮깁니다(단계 1.2). 4°C에서 5분 동안 500 x g 로 원심분리합니다.</li>
	<li>멸균 피펫으로 상청액을 제거하고 세포 침전물을 유지합니다. 배양액 2mL를 원심분리기 튜브에 넣고 세포를 부드럽게 재현탁합니다.</li>
	<li>10cm 페트리 접시에 세포를 시드하고 배양액 8mL를 총 10mL에 추가합니다.</li>
	<li>세포 배양기에서 37°C의 5%CO2 에서 중간엽 줄기세포를 배양한다.</li>
</ol>2. Exos 및 MV의 분리를 위한 차동 원심분리
<ol><li>중간엽 줄기세포가 >90% 합류점으로 성장하면 각 접시 8mL에 대해 20% EV 고갈 FBS 및 1% P/S가 보충된 α-MEM으로 배양 배지를 교체합니다. 알림: FBS를 4°C, 1,50,000 x g 에서 밤새 원심분리하여 EV 및 기타 불순물을 제거합니다.</li>
	<li>48시간 배양 후 배양 배지(단계 2.1)를 50mL 원심분리기 튜브에 수집합니다.</li>
	<li>MSC 배양 배지를 4°C, 800 x g 에서 10분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>상층액을 깨끗한 1.5mL 원뿔형 튜브로 옮겨 세포 조각과 세포 파편을 제거합니다. 알림: EV 수율을 높이려면 1.5mL 원뿔형 튜브를 사용해야 합니다.</li>
	<li>상층액을 4°C, 16,000 x g 에서 30분 동안 원심분리한다. 펠릿은 MVs입니다. 세포의 각 접시로부터의 MVs를 50 μL의 PBS로 재현탁시켰다.</li>
	<li>단계 2.5에서 원심분리하여 얻은 상층액을 피펫으로 옮겨 초원심분리기 튜브를 세척한다. 4 °C에서 2시간 동안 1,50,000 x g 로 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 버리고 잔류물인 Exos를 수집합니다. 50μL의 PBS에 있는 7개의 세포 접시에서 Exos를 재현탁합니다. 참고: 여섯 번째 통과 UCMSC는 EV 절연에 사용됩니다. 실험용으로 충분한 MV와 엑소를 얻으려면 일반적으로 7-8개의 배양된 세포가 필요합니다. EV 샘플은 다음 특성화 단계 또는 치료적 적용을 위해 즉시 사용되며, 이는 저장되지 않는 것이 좋습니다. 주의 : EV의 반복적인 동결 및 해동을 피하고 단기적으로는 -4°C가 아닌 80°C에서 EV를 보관하는 것이 가장 좋습니다.</li>
</ol>3. 중간엽 줄기세포에서 EV의 입자 수 및 크기 분포 검출
참고: 크기 분포 평가를 위해 나노 입자 추적 분석(NTA)은 상업적으로 이용 가능한 나노 입자 추적 분석기에 의해 수행됩니다( 재료 표 참조).
<ol><li>1μL의 EV(2.5단계 및 2.7단계)를 PBS 1,499μL에 희석하고 15mL 튜브에서 충분히 혼합합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 추적 분석기를 작동하십시오. 먼저 호환되는 소프트웨어를 시작합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>샘플 셀을 증류수로 채운 다음 기기가 셀 검사를 시작하도록 합니다.</li>
	<li>준비된 표준 용액으로 기기를 교정하십시오. 소프트웨어 감지 인터페이스에 표시되는 입자 수가 50-400(가급적이면 약 200)인지 확인합니다. 확인을 클릭합니다. 참고: 1mL의 증류수에 1μL의 보정 용액( 재료 표 참조)을 재구성하여 1차 용액을 생성한 다음 1차 용액 100μL를 취하여 25mL의 증류수를 첨가하여 표준 용액(1:250,000)을 준비합니다. 이 작업 시약을 4°C에서 일주일 동안 보관하십시오.</li>
	<li>샘플 셀을 증류수 5mL로 헹굽니다.</li>
	<li>샘플 분석 전에 1mL의 증류수로 채널을 세척합니다. 소프트웨어 감지 인터페이스에 표시되는 입자 수가 10 미만인지 확인하십시오.</li>
	<li>1 단계에서 준비한 EV 샘플 3.1 mL를 주입합니다. 기기의 사용 설명서에 따라 소포 테스트를 수행하십시오. 주의 : 샘플과 증류수는 신중한 수동 제어 하에 1mL/s의 일정한 속도로 0.5mL 주사기로 주입됩니다.</li>
</ol>4. 투과전자현미경(TEM)에 의한 EV 형태의 특성화
<ol><li>199μL의 PBS에 2.7단계의 EV를 1μL로 희석하고 충분히 혼합합니다. 20μL의 EV 현탁액 방울을 formvar/탄소 코팅된 정사각형 메쉬( 재료 표 참조)에 추가하고 3분 동안 그대로 두십시오.</li>
	<li>작은 여과지로 여분의 액체를 제거하고 표면을 약간 건조시키기 위해 15초 동안 그대로 두십시오.</li>
	<li>40초 동안 1.5% 포스포텅스텐산 방울로 EV 샘플을 부정적으로 염색합니다.</li>
	<li>과도한 인산 텅스텐 산을 제거하고 표면을 약간 건조시키기 위해 15 초 동안 그대로 두십시오.</li>
	<li>formvar/탄소 코팅된 정사각형 메쉬가 포함된 샘플을 여과지로 덮인 깨끗한 접시에 넣습니다. 투과 전자 현미경으로 이미지를 관찰하고 캡처합니다. 참고: 이 과정에서 Exos를 예로 들어 보겠습니다.</li>
</ol>5. MSCs 유래 전기차의 라벨링
<ol><li>EVs 추출(단계 2.5) 후 1.5mL 원뿔형 튜브에 250μL의 PBS로 재현탁합니다.</li>
	<li>PKH26 염료의 작업 용액을 준비하기 위해 또 다른 1.5mL 원추형 튜브를 사용하십시오. 희석제 C 250μL로 희석된 PKH26 표지 시약 1μL을 사용하십시오(본 연구에 사용된 상업적으로 이용 가능한 EV 라벨링 키트의 구성 요소, 재료 표 참조). 알림: 사용 직전에 작업 용액을 준비하십시오. 주의 : 과도한 PKH26 염료 또는 사전 희석 없이 라벨을 부착하면 EV가 손상될 위험이 있습니다.</li>
	<li>매달린 EV를 작업 용액과 혼합합니다. 실온에서 5분 동안 방치한 다음 EV 고갈 FBS 500μL를 추가하여 반응을 중지합니다.</li>
	<li>MVs의 경우, 4°C, 16,000 x g 에서 30분 동안 원심분리하고, 상청액을 피펫으로 버린다. PBS 1mL를 넣어 잔류물을 헹굽니다.</li>
	<li>4°C, 16,000 x g 에서 30분 동안 원심분리하고, 상청액을 버리고 결합되지 않은 염료를 제거하였다.</li>
	<li>잔류물을 200 μL의 PBS로 재현탁시킨다. 슬라이드에 현탁액 20μL를 떨어뜨리고 형광 현미경으로 관찰합니다. 참고: 이 과정에서 MV를 예로 들어 보겠습니다.</li>
</ol>6. MSC-EV의 국소 이식 및 전신 주사
알림: 다음 절차의 경우 주입하기 전에 EV를 얼음 위에 놓으십시오.
<ol><li>아래 단계에 따라 국소 이식을 수행하십시오.<ol><li>마우스를 4%(vol/vol) 이소플루란으로 마취합니다. 시술 중 1%-3% 이소플루란에서 마취를 유지하십시오.</li>
		<li>수술 전에 시술 후 통증을 최소화하기 위해 진통제에 5mg/kg 카르프로펜(IP)을 투여합니다.</li>
		<li>상처 절제 전에 등털을 면도하고 10% 포비돈 요오드와 75% 에탄올을 3회 번갈아 가며 등쪽 표면을 소독합니다.</li>
		<li>생검 펀치( 재료 표 참조)를 사용하여 등쪽 피부에 직경 1cm의 전체 두께 상처를 만듭니다.</li>
		<li>100μL의 PBS에 2개의 접시에서 MSC 유래 EV를 재현탁하고 4개의 부위가 있는 각 상처 주위의 상처 베드의 피하층에 주사를 투여합니다. 참고: 마우스당 평균 100μg의 EV(10cm 세포 접시 2개에서 EV)를 주입합니다. 쥐 모델에서 n = 5의 실험을 설정하기에 충분한 EV를 생산하려면 10cm 중간엽 줄기 세포 접시 10개가 필요합니다.</li>
		<li>치료 후, 마우스를 멸균 거즈로 감싸고 깨어날 때까지 단열 패드 ( 재료 표 참조)에 올려 놓으십시오.</li>
		<li>생쥐가 충분한 의식을 회복 할 때까지 방치하지 않도록하십시오. 완전히 회복 될 때까지 생쥐를 다른 동물의 회사로 돌려 보내지 마십시오.</li>
		<li>필요에 따라 수술 후 2일차와 3일차에 추가 용량의 진통제를 투여합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>전신 주사를 수행하십시오.<ol><li>MSC 유래 EV를 PBS 200μL에 재현탁한 다음 헤파린 용액과 10:1 부피비로 혼합합니다.</li>
		<li>마우스를 꼬리 정맥 이미징 시스템에 넣습니다( 재료 표 참조). 스위치를 눌러 레버를 들어 올립니다.</li>
		<li>IV 주사 전에 알코올 패드를 사용하여 꼬리 정맥을 소독하십시오. 그 후, 6.2.1 단계에서 제조된 현탁액을 생쥐에게 꼬리 정맥을 통해 체계적으로 주입한다. 절차는 꼬리 정맥 일러스트 레이터의 도움을받습니다. 알림: 헤파린과 혼합한 직후 EV 현탁액을 주입하십시오. 마우스당 평균 100μg EV(10cm 세포 접시 2개에서 나온 EV)를 주입합니다. 쥐 모델에서 n = 5의 실험을 설정하기에 충분한 EV를 생산하려면 10cm 중간엽 줄기 세포 접시 10개가 필요합니다. 주의: 마우스 꼬리 정맥 주사는 일반적으로 부피가 200μl로 제한됩니다. 주사는 천천히 진행되어야 하며 바늘이 정맥에서 벗어났음을 암시하는 융기나 저항이 보이면 멈춰야 합니다. 생쥐가 컬링 및 떨림과 같은 불리한 임상 징후를 보이면 대량 주사, 빠른 주사 또는 독성/아나필락시스에 대한 충격 반응일 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Williams, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+provide+neuroprotection+and+improve+long-term+neurologic+outcomes+in+a+swine+model+of+traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).</li>
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</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

EV는 항원 제시, 유전 물질 수송, 세포 미세 환경 변형 등을 포함한 다양한 생물학적 활동에서 중요한 역할을 하기 위해 부상하고 있습니다. 또한, 질병의 광범위한 적용은 질병의 진단과 치료를 위한 새로운 접근법과 기회를 제공한다21. EV의 치료 응용 구현은 성공적인 분리 및 특성화를 기반으로 합니다. 그러나 표준화된 분리 및 정제 방법의 부족과 낮은 추출 효율로 인해 EV 연구가 방해를 받고 있습니다. 이 기사는 주로 배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 EV의 쉽게 실현 가능한 추출 및 특성화 프로토콜과 국소 주사를 통해 조직 복구를 촉진하고 정맥 주사로 전신 질환을 치료하는 데 라벨링 및 사용할 수 있는 추가 응용 프로그램을 소개합니다. EV 분리를 위한 중간엽 줄기세포의 재현성은 UCMSC의 신생아 기원, 세포의 표준 배양 및 후기 계대 없음을 사용하여 보존됩니다. 이 원고에서는 각각 엑소스와 MV라는 용어가 차등 원심분리 속도에서 수집된 EV를 지칭하는 데 사용되었...

줄기세포는 자가 재생 능력과 번역 잠재력이 있는 미분화 만능 세포입니다1. 중간엽 줄기세포(MSC)는 실험실에서 쉽게 분리, 배양, 확장 및 정제되며, 이는 여러 번 계대배양한 후에도 줄기세포의 특성을 유지합니다. 최근 몇 년 동안, 중간엽 줄기세포가 치료적 용도에서 측분비 방식으로 작용한다는 견해를 뒷받침하는 증거가 증가하고 있다 2,3. 특히 세포외 소포체(EV)의 분비는 중간엽 줄기세포의 생물학적 기능을 매개하는 데 중요한 역할을 합니다. 대부분의 세포 유형에서 방출되는 이질적인 막 나노입자인 EV는 엑소좀(Exos), 미세소포(MV) 및 더 큰 세포자멸사체(4,5)라는 하위 범주로 구성됩니다. 그 중 엑소스는 40-150nm 크기로 가장 널리 연구된 EV로 엔도솜 기원이며 생리학적 조건에서 활발하게 분비됩니다. MV는 직경 100-1,000nm의 세포 원형질막 표면에서 직접 탈락하여 형성되며, 이는 포스파티딜세린의 높은 발현과 공여 세포의 표면 마커의 발현을 특징으로 한다6. EV에는 RNA, 단백질 및 기타 생리 활성 분자가 포함되어 있으며, 이들은 모 세포와 유사한 기능을 가지며 세포 통신, 면역 반응 및 조직 손상 복구에 중요한 역할을 합니다7. MSC-EV는 재생 의학에서 강력한 무세포 치료 도구로 널리 연구되어 왔다8.
MSC 유래 EV의 분리 및 정제는 연구 및 응용 분야에서 공통적인 문제입니다. 현재, 차등 및 밀도 구배 초원심분리(9), 한외여과 공정(10), 면역자기 분리(11), 분자 배제 크로마토그래프(12) 및 미세유체 칩(13)이 EV의 분리 및 정제에 널리 사용되고 있다. 각 접근법의 장점과 단점으로 인해 수집 된 EV의 양, 순도 및 활성을 동시에 만족시킬 수 없습니다14,15. 본 연구에서, 배양된 중간엽 줄기세포로부터 EV의 분리 및 특성화에 대한 차등 원심분리 프로토콜이 상세히 제시되며, 이는 효율적인 치료 사용을 지원하였다 16,17,18,19,20. 형광 표지, 국소 이식 및 전신 주입과 같은 일련의 다운스트림 접근법에 대한 이 방법의 적응성이 추가로 예시되었습니다. 이 절차를 구현하면 중개 연구에서 MSC-EV의 간단하고 신뢰할 수 있는 수집 및 적용에 대한 필요성을 해결할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>10% 포비돈-요오드 (베타딘)</td><td>Weizhenyuan</td><td>10053956954292</td><td>상처 소독</td></tr><tr><td>보정 용액</td><td>입자 Metrix</td><td>110-0020</td><td>NTA 기기 보정</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Sigma</td><td>53716-49-7</td><td>진통제</td></tr><tr><td>꼬리 정맥 이미저&nbsp;</td><td>KEW 생명 과학</td><td>KW-XXY</td><td>꼬리 정맥 이미저</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5418R</td><td>원심분리</td></tr><tr><td>치명적 소 혈청</td><td>Corning</td><td>35-081-CV</td><td>UCMSCs Formvar</td></tr><tr><td>/carbon-coated square mesh</td><td>PBL Assay Science의</td> 배양;<td>24916-25</td><td>투과 전자 현미경</td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Zhongke Life Science</td><td>Z8G5JBMz</td><td>동물 후처리 관리</td></tr><tr><td>헤파린 용액</td><td>StemCell</td><td>7980</td><td>전신 주입</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD 생명 과학</td><td>R510-22</td><td>동물 마취</td></tr><tr><td>최소 필수 매체 알파 베이직 (1x)</td><td>Gibco</td><td>C12571500BT</td><td>배양 UCMSCs</td></tr><tr><td>나노 입자 추적 분석기</td><td>Particle Metrix</td><td>ZetaView PMX120</td><td>나노 입자 추적 분석</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td> <td>Meilunbio</td><td>MA0015</td><td>Resuspend EV</td></tr><tr><td>페니실린 / 스트렙토 마이신</td><td>프로셀 생명 과학</td><td></td><td>PB180120 UCMSCs</td></tr><tr><td>포스 포 텅스텐 산</td><td>배양 Solarbio</td><td>12501-23-4</td><td>투과 전자 현미경</td></tr><tr><td>피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3120000224</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 적색 형광 세포 링커 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26</td><td>라벨링 EV</td></tr><tr><td>피부 생검 펀치</td><td>Acuderm</td><td>69038-10-50</td><td>피부 결함</td></tr><tr><td>소프트웨어 ZetaView</td><td>Particle Metrix</td><td>버전 8.05.14 SP7&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>온도 조절 장비</td><td>Grant</td><td>v-0001-0005</td><td>수조</td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>HITACHI</td><td>HT7800</td><td>투과 전자 현미경</td></tr><tr><td>UCMSCs</td><td>Bai'ao&nbsp;</td><td>UKK220201</td><td>상업적으로 UCMSCs</td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman</td><td>XPN-100</td><td>원심분리</td></tr><tr><td>초순수 여과수 정화 시스템</td><td>Milli-Q</td><td>IQ 7000</td><td>초순수 준비</td></tr></tbody></table>

배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

세포외 소포(EV)는 대부분의 세포 유형에서 방출되는 이질적인 막 나노입자이며 유기체 항상성의 생리학적 조절자 및 병리학의 중요한 지표로 점점 더 인식되고 있습니다. 한편, 접근 가능하고 통제 가능한 질병 치료제를 확립할 수 있는 엄청난 잠재력이 나타나고 있습니다. 중간엽 줄기 세포(MSC)는 배양 시 다량의 EV를 방출할 수 있으며, 이는 효과적인 조직 재생을 촉진하고 우수한 확장성과 재현성으로 광범위한 치료 적용을 촉진할 수 있는 가능성을 보여주었습니다. MSC-EV를 수집하고 적용하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜에 대한 요구가 증가하고 있습니다. 여기서는 추가 응용 분야를 위해 배양된 인간 중간엽, 엑소좀 및 마이크로베지클에서 대표적인 EV를 분리하고 특성화하기 위해 차등 원심분리를 기반으로 하는 상세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 방법의 적응성은 라벨링, 국소 이식 및 전신 주입과 같은 일련의 다운스트림 접근 방식에 대해 표시됩니다. 이 절차의 구현은 중개 연구에서 간단하고 신뢰할 수 있는 MSC-EV 수집 및 적용의 필요성을 해결할 것입니다.

배양된 인간 UCMSC의 MV 및 엑소는 실험 워크플로우에 따라 분리됩니다(그림 1). NTA 결과는 인간 중간엽 줄기세포의 엑소 크기가 40nm에서 335nm까지 범위이고 피크 크기가 약 100nm이고 MV의 크기가 50nm에서 445nm이고 피크 크기가 150nm임을 보여줍니다(그림 2). MSC 유래 엑소의 형태학적 특성은 전형적인 컵 모양을 나타냅니다(그림 3). EV는 PKH26에 의해 효율적으로 라벨링되며, 이는 라벨링된 펠릿과 형광 현미경으로 전체적으로 관찰됩니다(그림 4). MSC 유래 EV의 국소 및 전신 주사는 피부 상처 주위 또는 꼬리 정맥을 통해 수행됩니다(그림 5). 따라서, 엑소 및 MV는 성공적으로 분리되고 후속 실험에 적용된다.
...

본 프로토콜은 배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 대표적인 EV(엑소좀 및 마이크로베시클)를 분리하고 특성화하기 위한 차등 원심분리를 설명합니다. 이러한 EV의 추가 응용 프로그램도 이 기사에서 설명합니다.

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

이 절차는 간단하고 신뢰할 수 있는 중간엽 줄기 세포 유래 세포외 소포 수집의 필요성과 연구 번역에 대한 적용의 필요성을 해결했습니다. 차등 원심분리에 의한 세포외 소포체의 수집은 간단하고, 쉽게 확장 가능하며, 재현 가능하며, 이는 현장에 유용할 것이다. 불명료한}중간엽 줄기세포에서 구별되지 않는 세포외 소포는 현대 질병 치료에서 불명료한} 응용 프로그램입니다.나는 실수를 두려워하지 않을 것이다. 이 작업은 간단하고 배우기 쉽습니다. 이 간단한 프로그램에는 비디오를 통해 더 잘 표현할 수 있는 많은 세부 사항이 있습니다.먼저 중간엽 줄기세포를 90% 이상 합류하도록 배양합니다. 각 접시의 배양 배지를 8mL의 보충된 알파-MEM으로 교체합니다. 배양 48시간 후, 배양 배지를 50mL 원심분리기 튜브에 완전히 수집하기 위해 세포를 고르게 성장시켜야 합니다.이어서, 배양액을 섭씨 4도에서 10분 동안 800 x g로 원심분리한다. 상층액을 1.5mL 원뿔형 튜브로 옮겨 세포 조각과 세포 파편을 제거합니다. 상층액을 섭씨 4도에서 30분 동안 16, 000 x g에서 원심분리합니다.피펫을 사용하여 현탁액을 초원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 2 시간 동안 150, 000 x g에서 원심 분리합니다. 접시당 50uL의 PBS에 미세소포 펠릿을 재현탁합니다.상층액을 버리고 엑소좀인 잔류물을 수집합니다. 50 uL의 PBS에 있는 7개의 세포 접시에서 엑소좀을 재현탁합니다. 15mL 튜브에서 1uL의 세포외 소포체를 1, 499uL의 PBS에 희석하고 혼합합니다.그런 다음 추적 분석기와 호환되는 소프트웨어를 시작합니다. s를 채웁니다.amp증류수로 셀을 채운 다음 기기가 셀 검사를 시작하도록 합니다. 준비된 표준 용액으로 기기를 교정하십시오.소프트웨어 감지 인터페이스에 표시되는 입자 수가 50에서 400 사이, 가급적이면 200 사이인지 확인하고 확인을 클릭합니다. 다음으로, 샘플 셀을 5mL의 증류수로 헹굽니다. 샘플 분석 전에 1mL의 증류수로 채널을 세척합니다.소프트웨어 감지 인터페이스에 표시되는 입자 수가 10 미만인지 확인하십시오. 1.5mL 원뿔형 튜브에서 250uL의 PBS로 세포외 소포체를 재현탁합니다. 또 다른 1.5mL 원뿔형 튜브에서 PKH26 염료의 작업 용액을 준비합니다.재현 탁 된 세포 외 소포를 작업 용액과 혼합하십시오. 실온에서 5분 동안 방치한 다음 EV 고갈 FBS 500uL를 추가하여 반응을 중지합니다. 미세 소포의 경우, 섭씨 4도에서 30 분 동안 16, 000 x g에서 원심 분리합니다.상청액을 버리십시오. PBS 1mL를 넣어 잔류물을 헹굽니다. 다시 원심분리하고, 상층액을 버리고 결합되지 않은 염료를 제거한다.미세 소포의 경우, 섭씨 4도에서 30 분 동안 16, 000 x g에서 원심 분리합니다. 잔류물을 200 uL의 PBS로 재현탁시킨다. 슬라이드에 20uL의 현탁액을 떨어뜨리고 형광 현미경으로 관찰합니다.PBS 200uL에 세포외 소포체를 재현탁한 다음 헤파린 용액과 10:1 부피비로 혼합합니다. 마우스를 꼬리 정맥 이미징 시스템에 놓습니다. 스위치를 눌러 레버를 들어 올립니다.꼬리 정맥 일러스트 레이터의 도움으로 꼬리 정맥을 통해 세포 외 소포 현탁액을 체계적으로 주입하십시오. NTA를 이용한 입자 크기 분포 분석은 인간 중간엽 줄기 세포에서 추출한 엑소좀의 크기가 40 내지 335 nm이고, 피크 크기가 약 100 nm인 것으로 나타났다. 또한, 미세 소포의 크기는 50 내지 445 nm이고, 피크 크기는 150 nm이다.엑소좀의 형태학적 특성화는 엑소좀이 전형적인 컵 모양을 나타내는 것으로 나타났습니다. 세포외 소포체는 PKH26에 의해 효율적으로 표지되었으며, 이는 형광 현미경뿐만 아니라 표지된 펠릿으로 육안적으로 관찰되었습니다. 중간엽 줄기세포의 불명료한 부분에 남아 있는 방출된 EV를 완전히 수집하기 위해서는 세포가 고르게 불어넣어야 하기 때문에 상등액 수집 시 작업자가 주의를 기울여야 합니다.주입의 성공을 검증하기 위해, 형광 표지된 EV의 생체 내 분포 또는 생착의 특정 조직 부위의 동결 절편에 대한 생체 내 이미징을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

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