배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용

이 절차는 간단하고 신뢰할 수 있는 중간엽 줄기 세포 유래 세포외 소포 수집의 필요성과 연구 번역에 대한 적용의 필요성을 해결했습니다. 차등 원심분리에 의한 세포외 소포체의 수집은 간단하고, 쉽게 확장 가능하며, 재현 가능하며, 이는 현장에 유용할 것이다. 불명료한}중간엽 줄기세포에서 구별되지 않는 세포외 소포는 현대 질병 치료에서 불명료한} 응용 프로그램입니다.

나는 실수를 두려워하지 않을 것이다. 이 작업은 간단하고 배우기 쉽습니다. 이 간단한 프로그램에는 비디오를 통해 더 잘 표현할 수 있는 많은 세부 사항이 있습니다.

먼저 중간엽 줄기세포를 90% 이상 합류하도록 배양합니다. 각 접시의 배양 배지를 8mL의 보충된 알파-MEM으로 교체합니다. 배양 48시간 후, 배양 배지를 50mL 원심분리기 튜브에 완전히 수집하기 위해 세포를 고르게 성장시켜야 합니다.

이어서, 배양액을 섭씨 4도에서 10분 동안 800 x g로 원심분리한다. 상층액을 1.5mL 원뿔형 튜브로 옮겨 세포 조각과 세포 파편을 제거합니다. 상층액을 섭씨 4도에서 30분 동안 16, 000 x g에서 원심분리합니다.

피펫을 사용하여 현탁액을 초원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 2 시간 동안 150, 000 x g에서 원심 분리합니다. 접시당 50uL의 PBS에 미세소포 펠릿을 재현탁합니다.

상층액을 버리고 엑소좀인 잔류물을 수집합니다. 50 uL의 PBS에 있는 7개의 세포 접시에서 엑소좀을 재현탁합니다. 15mL 튜브에서 1uL의 세포외 소포체를 1, 499uL의 PBS에 희석하고 혼합합니다.

그런 다음 추적 분석기와 호환되는 소프트웨어를 시작합니다. s를 채웁니다.amp증류수로 셀을 채운 다음 기기가 셀 검사를 시작하도록 합니다. 준비된 표준 용액으로 기기를 교정하십시오.

소프트웨어 감지 인터페이스에 표시되는 입자 수가 50에서 400 사이, 가급적이면 200 사이인지 확인하고 확인을 클릭합니다. 다음으로, 샘플 셀을 5mL의 증류수로 헹굽니다. 샘플 분석 전에 1mL의 증류수로 채널을 세척합니다.

소프트웨어 감지 인터페이스에 표시되는 입자 수가 10 미만인지 확인하십시오. 1.5mL 원뿔형 튜브에서 250uL의 PBS로 세포외 소포체를 재현탁합니다. 또 다른 1.5mL 원뿔형 튜브에서 PKH26 염료의 작업 용액을 준비합니다.

재현 탁 된 세포 외 소포를 작업 용액과 혼합하십시오. 실온에서 5분 동안 방치한 다음 EV 고갈 FBS 500uL를 추가하여 반응을 중지합니다. 미세 소포의 경우, 섭씨 4도에서 30 분 동안 16, 000 x g에서 원심 분리합니다.

상청액을 버리십시오. PBS 1mL를 넣어 잔류물을 헹굽니다. 다시 원심분리하고, 상층액을 버리고 결합되지 않은 염료를 제거한다.

미세 소포의 경우, 섭씨 4도에서 30 분 동안 16, 000 x g에서 원심 분리합니다. 잔류물을 200 uL의 PBS로 재현탁시킨다. 슬라이드에 20uL의 현탁액을 떨어뜨리고 형광 현미경으로 관찰합니다.

PBS 200uL에 세포외 소포체를 재현탁한 다음 헤파린 용액과 10:1 부피비로 혼합합니다. 마우스를 꼬리 정맥 이미징 시스템에 놓습니다. 스위치를 눌러 레버를 들어 올립니다.

꼬리 정맥 일러스트 레이터의 도움으로 꼬리 정맥을 통해 세포 외 소포 현탁액을 체계적으로 주입하십시오. NTA를 이용한 입자 크기 분포 분석은 인간 중간엽 줄기 세포에서 추출한 엑소좀의 크기가 40 내지 335 nm이고, 피크 크기가 약 100 nm인 것으로 나타났다. 또한, 미세 소포의 크기는 50 내지 445 nm이고, 피크 크기는 150 nm이다.

엑소좀의 형태학적 특성화는 엑소좀이 전형적인 컵 모양을 나타내는 것으로 나타났습니다. 세포외 소포체는 PKH26에 의해 효율적으로 표지되었으며, 이는 형광 현미경뿐만 아니라 표지된 펠릿으로 육안적으로 관찰되었습니다. 중간엽 줄기세포의 불명료한 부분에 남아 있는 방출된 EV를 완전히 수집하기 위해서는 세포가 고르게 불어넣어야 하기 때문에 상등액 수집 시 작업자가 주의를 기울여야 합니다.

주입의 성공을 검증하기 위해, 형광 표지된 EV의 생체 내 분포 또는 생착의 특정 조직 부위의 동결 절편에 대한 생체 내 이미징을 수행할 수 있습니다.