Name: 검은다리진드기의 유전자 편집을 위한 배아 주입 기술, Ixodes 견갑골 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 배우세요 검은다리진드기 배아 주입 기술을 이용한 유전자 편집 방법으로, Ixodes scapularis의 유전자 기능과 병원체 상호작용을 연구할 수 있습니다. 이 기술은 진드기 매개 감염병 백신 개발과 개체군 통제 전략 수립에 기여합니다.

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저자는 Channa Aluvihare와 Yonus Gebermicale, ITF, UMD가 프로토콜 개발의 초기 단계에서 통찰력과 지원을 받았다고 인정합니다. 텅스텐 바늘은 David O'Brochta, ITF, UMD의 관대 한 선물이었습니다. 우리는 I. ricinus 에서이 프로토콜을 테스트하고 통찰력있는 토론을 해주신 Ladislav Simo 박사에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 NIH-NIAID R21AI128393 및 Plymouth Hill Foundation, NY에서 MG-N, 네바다 대학에서 AN까지의 스타트 업 자금, MG-N 및 AN에 대한 국립 과학 재단 보조금 번호 2019609, IGTRCN에서 AS로의 피어 투 피어 보조금.

Ixodes 견갑골 성인은 오클라호마 주립 대학 (OSU)에서 구입하거나 네바다 리노 대학 (UNR) (IACUC 프로토콜 # 21-001-1118)에서 자랐습니다.
1. 배아 수집을위한 암컷 진드기의 준비
알림: 적절한 연령의 알을 수집하려면 알을 낳는 것을 동기화하는 것이 중요합니다. 진드기의 알을 낳는 단서는 불분명하지만 표준 곤충 조건 (27 ° C 온도 및 >90 % 상대 습도 (RH))에서 I. 견갑골 암컷은 숙주 분리 후 약 8 일 후에 알을 낳기 시작합니다. 이 타임 라인은 4 ° C에서 가득 찬 암컷을 저장함으로써 연장 될 수 있습니다. 우리는 알을 낳는 데 부정적인 영향 없이 4°C에서 최대 8주까지 혈액을 먹인 암컷을 보관했습니다. 이러한 조건은 각 곤충에 대해 수정해야 할 수도 있습니다.
<ol><li>모든 암컷은 미세 주사에 사용될 때까지 축축한 여과지가 늘어선 6쿼트 플라스틱 상자에 >90% RH의 4°C에서 보관하십시오.</li>
	<li>주사 일주일 전에 암컷을 4 °C에서 27 °C 인큐베이터로 옮겨 알을 낳습니다.</li>
	<li>암컷이 알을 낳기 시작하면 (27 ° C로 옮긴 후 3-4 일) 끝이 가늘고 붓을 사용하여 알을 제거하고 Gené의 장기 (왁스 샘) 절제를 위해 암컷을 준비합니다. 참고: Gené의 기관은 scutum과 capitulum 사이의 영역(입 부분의 등쪽 기저부)에서 확장되고, 입 부분은 복부 신체 표면(표면과 평행) 위로 구부러지며, 확장된 Gene의 기관은 알을 낳자마자 알을 코팅합니다(그림 1). Gené의 장기를 제거하거나 왁스를 비우기 전에 낳은 계란은 왁스 코팅이 되어 있으며 주사에 적합하지 않으므로 폐기해야 합니다.</li>
	<li>Gené의 장기를 제거하거나 비우려면 점토를 사용하여 복부와 등쪽 모두에서 입 부분이 보이도록 지향된 현미경으로 유리 슬라이드에 충혈된 암컷을 배치합니다(그림 1B, C).<ol><li>이전에 발표 된 프로토콜16 에 따라 텅스텐 와이어를 사용하여 실험실에서 만든 미세한 집게와 텅스텐 바늘을 사용하여 scutum과 입 부분 사이의 영역을 조심스럽게 찌릅니다 (바늘은 상업적으로 구입할 수도 있으며 마이크로 해부 프로브에 부착 할 수 있습니다. 재료 표 참조).</li>
		<li>텅스텐 바늘로 내부로 작업하면서 왁스 글 랜드를 당겨 빼냅니다 (그림 1D, E). 글 랜드를 제거하는 데 몇 분이 걸릴 수 있습니다. 실험실 물티슈를 사용하여 액체 왁스 분비물을 닦아냅니다. 알림: 글 랜드는 입 부분 바로 아래의 복부 쪽에서도 제거 할 수 있습니다. 바늘과 집게로 scutum쪽으로 뒤쪽에 도달하여. 입 부분 주위에 실리콘 접착제를 바르면 Gene의 장기 외전을 차단하고 왁스를 제거하거나 비우는 대신 사용할 수 있습니다 (프랑스 INRAE의 Ladislav Simo 박사와의 개인적인 의사 소통). 충혈 된 진드기는 양면 테이프에 머 무르지 않습니다. 점토를 사용하여 진드기를 "싸는"것은 조작하는 동안 진드기를 제자리에 유지하는 데 도움이됩니다. 집게를 사용하여 진드기와 텅스텐 바늘을 잡고 해부를 유지하십시오. 복부 부분은 바늘로 뚫기가 더 쉽고 저자가 선호합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>글 랜드를 비우려면 1.4 단계에서 언급 한대로 중력 진드기를 배열하십시오. 등쪽의 입 부분 뒤의 영역을 조심스럽게 뚫고 집게를 사용하여 복부 쪽에 압력을가하십시오. 알림: 또는 왁스 글 랜드를 제거 할 필요가 없습니다. 왁스 샘을 비우는 것은 며칠 동안 지속됩니다. 알을 낳는 암컷은 입 부분 주위에 흰색 영역이있어 왁스 샘의 위치를 나타내며 참조로 사용할 수 있습니다.<ol><li>보푸라기가 없는 실험실 물티슈의 가장자리를 놓고 펑크 부위에서 나오는 액체 왁스를 제거합니다. 약간 황색을 띠는 점성 왁스에 비해 투명한 액체 인 혈액 림프 분비를 피하십시오. 대부분의 왁스가 제거 될 때까지 5-10 분이 걸릴 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>조작 후 암컷을 27 ° C (>90 % RH)의 인큐베이터에 넣고 1-2 일 동안 회복시킵니다. 알림: 치료받은 암컷은 보통 회복하고 알을 다시 낳기 시작하는 데 1-2 일이 걸립니다.</li>
	<li>암컷이 다시 알을 낳기 시작하면 가는 붓을 사용하여 갓 쌓인 알을 모으고(알을 낳은 후 0-18시간) 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 참고 : 시간이 지남에 따라 동일한 암컷의 알을 사용하는 경우, 땀샘이 제거되지 않은 경우 알을 낳은 지 4-5 일 후에이 절차를 반복해야합니다.</li>
</ol>2. 미세 주사를 위한 배아 치료
<ol><li>200-0시간 된 계란이 들어 있는 튜브에 5%(무게/부피) 벤잘코늄 클로라이드/물( 재료 표 참조)의 ~0μL(또는 계란 수에 따라 계란을 덮기에 충분한 부피)를 추가합니다. 계란이 튜브 바닥에 가라앉지 않도록 붓으로 계란을 5분 동안 부드럽게 휘젓습니다(자세한 내용은 Sharma et al.4 참조). 마이크로 피펫을 사용하여 상청액을 제거하고 계란을 튜브에 남겨 둡니다. 주의 : 염화 벤잘 코늄은 피부와 눈을 부식 시키므로 장갑과 보안경을 착용하십시오.</li>
	<li>계란이 들어있는 튜브에 ~ 200μL의 증류수 (DI)를 넣고 페인트 브러시로 소용돌이 치고 마이크로 피펫을 사용하여 마이크로 원심 분리 튜브에서 물을 제거합니다. DI 물로 한 번 더 세척을 반복하십시오.</li>
	<li>DI 물로 세척 한 후 5 % (w / v) 염화나트륨 (NaCl)의 ~ 200μL를 넣고 5 분 동안 붓으로 부드럽게 소용돌이 치십시오. 5분 후에 튜브에서 용액을 제거하고 DI 물로 계란을 두 번 씻습니다.</li>
	<li>계란이 들어있는 미세 원심 분리 튜브에 ~ 100 μL의 1 % (w / v) NaCl 용액을 추가합니다. 계란이 주사에 사용될 때까지 1%(w/v) NaCl 용액에 보관하십시오.</li>
	<li>약 한 시간 후에 미세 주사를 시작하십시오. 이 타임 라인은 계란의 적절한 건조를 돕고 파열을 방지합니다. 알림: 계란은 생존에 큰 영향을 미치지 않고 1%(w/v) NaCl 용액에 7-8시간 동안 보관할 수 있습니다. 계란이 주입하기 어렵거나 파열되면 계란이 충분히 건조되지 않고 추가로 5 분 동안 5 % (w / v) NaCl로 추가로 처리 할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 주사 바늘의 제조
<ol><li>알루미노실리케이트 모세관 유리(필라멘트 포함, 재료 표 참조)를 제조업체의 지침에 따라 바늘 풀러에 삽입합니다.</li>
	<li>니들 풀러를 열: 575, 당기기: 20, 속도: 50, 시간: 200 및 압력: 700 설정으로 조정합니다.</li>
	<li>바늘 풀러의 당김 기능을 활성화하고 추가 바늘에 대해 이 과정을 반복합니다.</li>
	<li>뽑은 바늘을 깨끗한 페트리 접시에 담아 모델러의 점토 선에 붙여서 보관하십시오.</li>
	<li>마이크로 로더 팁을 사용하여 주입 혼합물로 바늘을 적재하십시오 ( 재료 표 참조). 참고: 진드기와 모기 배아 주입에 사용되는 바늘의 비교는 그림 2에 나와 있습니다.</li>
</ol>4. 미세 주입을 위한 슬라이드 설정
<ol><li>양면 테이프를 사용하여 두 개의 유리 현미경 슬라이드를 함께 접착하여 계란 정렬을 지원하고 주사 중에 넘어지지 않도록 약 0.5cm의 간격을 둡니다(그림 3A).</li>
	<li>슬라이드 사이의 틈새에 있는 양면 테이프에 투명 필름 드레싱( 재료 표 참조)을 바릅니다. 필름 드레싱을 간격에 완벽하게 맞추십시오.</li>
</ol>5. 배아 미세 주사
<ol><li>단발 붓을 사용하여 슬라이드 설정(위)에서 한 번에 8-10개의 계란을 정렬합니다. 알림: 슬라이드 가장자리에 수직으로 긴 축(그림 3B)으로 정렬된 계란은 세로축이 가장자리에 평행하게 정렬된 계란(그림 3C)보다 주입하기 쉽습니다. 수직 방향의 계란(그림 3B)은 주사를 더 잘 견딜 수 있어 생존율이 높아집니다.</li>
	<li>계란이 정렬 된 슬라이드를 복합 현미경 스테이지에 놓습니다. 보풀이 없는 물티슈를 사용하여 보관된 1% NaCl 용액을 제거합니다.</li>
	<li>채워진 주사 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 연결된 마이크로 인젝터에 부착하십시오 ( 재료 표 참조).</li>
	<li>마이크로 인젝터의 고압 설정(>5,000hPa)을 사용하여 바늘을 계란 표면에 부드럽게 문질러 바늘을 엽니다.</li>
	<li>바늘을 연 후 바늘이 열리는 부분에 따라 미세 주사기의 압력(1,000-2,500hPa)을 줄입니다. 알림: 작은 개구부는 비교적 높은 압력이 필요하고 더 큰 개구부는 더 낮은 압력이 필요합니다. 이것은 주입되는 구조물의 부피를 제어하기 위한 것이다. 바늘 개구부의 크기에 따라 주입량은 1-5 pL로 다양합니다.</li>
	<li>슬라이드의 모든 계란을 가능한 한 빨리 10°-15° 각도로 주입하고 즉시 젖은 종이가 깔린 페트리 접시에 슬라이드를 습도가 높은 조건으로 옮깁니다. 계란이 주입 되 자마자 건조되기 시작합니다. 알림: 한 번에 적은 수의 계란을 주입하면 주입 성공률과 생존 확률이 높아집니다. 바늘은 배아 역류로 막히게됩니다. 팁이 여전히 날카 롭다면 막힌 바늘을 제거하려면 바늘을 슬라이드 가장자리에 첨가 된 1 % NaCl의 작은 물방울로 옮깁니다. 모세관 작용은 작은 막힘을 제거합니다. 바늘이 이미 둔한 경우 교체하십시오.</li>
</ol>6. 배아의 주사 후 관리
<ol><li>주입 된 배아가 들어있는 슬라이드를 축축한 여과지가 늘어선 큰 페트리 접시에 놓습니다. 알림: 적어도 5-6 시간 동안 계란을 방해하지 않는 것이 중요합니다. 이렇게하면 주사 상처가 제대로 밀봉 될 수 있습니다. 교반하면 주사 상처가 열리고 세포질이 흘러 나오기 시작하여 난자가 사망 할 수 있습니다.</li>
	<li>5-6 시간 후, 주입 된 배아가 부착 된 투명 필름 드레싱에 소량의 DI 물을 첨가하십시오. 붓을 사용하여 계란을 부드럽게 옮깁니다. 계란을 작은 페트리 접시(10cm)에 옮기고 DI 물에 담그십시오. 알림: 필름 드레싱을 사용하면 주사 후 계란을 쉽게 제거 할 수 있습니다. 필름 드레싱에 물방울이 추가되는 순간 계란이 물과 함께 움직이기 시작합니다.</li>
	<li>계란을 물에 담그고 페트리 접시를 6쿼트 플라스틱 상자에 넣고 27°C 및 >90% RH의 인큐베이터에 넣습니다.</li>
	<li>처음 며칠 동안은 매일, 그리고 애벌레가 부화하기 시작할 때까지 3-4 일마다 알을 정기적으로 확인하십시오. 알림: 미세 주사 중에 많은 수의 알이 손상된 경우 일주일 후에 DI 물을 부드럽게 배수하면 죽은 알의 곰팡이 성장을 방지할 수 있습니다.</li>
	<li>유충이 주입 된 배아에서 부화하기 시작하면 (현재 실험실 설정을 위해 주입 후 21-25 일) 매일 확인하고 부화 한 유충을 스크린이있는 유리 병으로 옮깁니다. 유충은 수중에서 부화하여 ~ 1-2 주 동안 생존 할 수 있습니다.</li>
	<li>유충4 를 선별하여 알이 눈에 보이는 표현형을 초래할 수 있는 작제물로 주입된 경우.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).</li>
	<li>Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).</li>
	<li>Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).</li>
	<li>Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).</li>
	<li>Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).</li>
	<li>Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).</li>
	<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
	<li>Criscione, F., O&#39;Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).</li>
	<li>Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).</li>
	<li>Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).</li>
	<li>Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).</li>
	<li>Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).</li>
	<li>Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene&#39;s organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).</li>
	<li>Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).</li>
	<li>Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gen&#233;&#39;s) organ in ixodid ticks. Tissue &#38; Cell. 21 (1), 113-122 (1989).</li>
	<li>Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental &#38; Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).</li>
	<li>Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이것은 초기 진드기 배아를 성공적으로 주입하기 위해 개발 된 최초의 프로토콜입니다. ~4%-8%의 생존율이 달성되었으며, 이는 다른 잘 확립된곤충 모델의 배아 주입과 비슷합니다5.
이것이 초기 프로토콜이기 때문에이 프로토콜은 개별 진드기 종에 대해 더욱 정제되고 전문화 될 것으로 예상됩니다. 특히, 주사시기는 종마다 다르며, 배아 발생, 특히 세포화시기의 경우에 따라 달라집니다. 예비 데이터에 따르면 I. 견갑골 알은 산란 후 처음 24 시간 동안 빠른 핵 분열을 거치지 않으며 며칠 후 세포화가 발생합니다 (미공개 데이터). 우리는 이미 플라스미드 전달4, CRISPR 매개 유전자 녹아웃4 및 박테리아 전달 (Wolbachia)에 이 프로토콜을 사용했습니다(표 1). 이 배아 주입 프로토콜은 형질 전환 진드...

틱은 다양한 바이러스, 박테리아, 원생 동물 병원체 및 선충류 1,2를 전염시킬 수있는 의학적 및 수의학적으로 중요한 벡터입니다. 미국 동부에서 검은 다리 진드기 인 Ixodes scapularis는 라임 병 (LD) 병원체 인 스피로 헤테 보렐 리아 부르그 도르 페리의 중요한 매개체입니다. 미국에서 매년 400,000건 이상의 LD 사례가 보고되어 미국에서 가장 많이 매개체 매개 전염병이 되었습니다1. B. burgdorferi 외에도 4 개의 박테리아 (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi 및 Ehrlichia muris eauclarensis), 1 개의 원생 동물 기생충 (Babesia microti) 및 1 개의 바이러스 (Powassan 바이러스)를 포함하여 6 개의 다른 미생물이 견갑골에 의해 전염되어이 진드기 종을 주요 공중 보건 문제로 만듭니다3 . 최근 몇 년 동안 진드기 매개 질병이 더 널리 퍼지고 있지만 진드기에 대한 연구는 진드기의 독특한 생물학과 유전 및 기능 게놈 도구 4,5 적용과 관련된 문제로 인해 모기와 같은 다른 절지동물 벡터에 뒤쳐져 있습니다.
유전자 편집 기술, 특히 CRISPR / Cas9는 이제 비 모델 유기체에서 기능적 유전체학 연구를 실현 가능하게 만들었습니다. 유기체에서 유전성 돌연변이를 생성하기 위해, 배아 주입은 생식계열 6,7,8,9를 변경하기 위한 구축물을 전달하는 데 선호되는 방법으로 남아 있습니다. 그러나 최근까지4, 진드기 알은 배아10,11을 죽이지 않고 주입하기가 너무 어렵거나 불가능한 것으로 간주되었습니다. 계란의 두꺼운 왁스 층, 단단한 융모막 및 높은 타원형 압력은 진드기에 배아 주입을 방해하는 주요 장애물 중 일부였습니다. 성인, 혈액 공급 I. 견갑골은 3-4 주 (약 100 알 / 일)에 걸쳐 최대 2,000 개의 알12 개로 구성된 단일 클러치를 침착시킵니다. 알은 단독으로 낳고, 각 알은 어머니의 선 Gené의 기관13,14,15의 돌출부 또는 "뿔"에 의해 분비되는 왁스로 코팅됩니다. 이 왁스는 계란을 건조로부터 보호하고 항균 화합물15를 함유하고 있습니다. 진드기 알을 성공적으로 주입하려면 왁스 층을 제거하고 융모막을 부드럽게하고 난자를 건조시켜 타원 내 압력을 낮추어 주입이 난자를 돌이킬 수 없게 손상시키지 않도록하는 것이 중요합니다. 성공적인 생식계열 형질전환을 위한 배아 주입의 중요성을 이해하고, CRISPR/Cas9 구조를 전달하고 안정적인 생식계열 돌연변이를 생성하는 데 사용할 수 있는 I. 견갑골에 대한 프로토콜이 개발되었습니다4. I. scapularis 연구에 대한 기여 외에도이 프로토콜은 다른 진드기 종에도 최적화 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>알루미늄 규산 모세 혈관, 필라멘트</td><td>셔터 기구</td><td>AF100-64-10</td><td>배아 주입</td></tr><tr><td>벤잘 코늄 클로라이드 50% 중 물, 25g</td><td>TCI-America</td><td>B0414</td><td>배아 처리, 25g 약 25mL</td></tr><tr><td>여과지</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>주입 후 관리</td></tr><tr><td>겸자</td><td>Thomas Scientific</td><td>300-101</td><td>유전자 기관 조작</td></tr><tr><td>실험실 물티슈</td><td>Genesee Scientific</td><td>88-115</td><td></td></tr><tr><td>마이크로로더 팁</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>당겨진 바늘 로드</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>셔터 기기</td><td>ROE-200</td><td>배아 주입</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 - 일반, 접지 가장자리</td><td>Genesee Scientific</td><td>29-100</td><td>배아 정렬, 접지 가장자리가 선호되며 비스듬한 가장자리는 난자를 보이지 않게 함</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International</td><td>S23020-500.0</td><td>배아 처리</td></tr><tr><td>바늘 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>영구 양면 테이프</td><td>스카치</td><td>34-8716-3417-5</td><td>배아 정렬</td></tr><tr><td>페트리 플레이트</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-107G</td><td>주입 후 관리</td></tr><tr><td>Tegaderm/ 투명 필름 드레싱</td><td>3M 헬스케어</td><td>1628</td><td>배아 정렬</td></tr><tr><td>텅스텐 바늘</td><td>미세 과학 도구</td><td>10130-10</td><td>유전자의 장기 조작</td></tr><tr><td>텅스텐 와이어</td><td>아마존</td><td>B08DNT7ZK3</td><td>유전자의 장기 조작</td></tr><tr><td>XenoWorks 디지털 마이크로 인젝터</td><td>셔터 기기</td><td>MPC-200</td><td>배아 주입</td></tr></tbody></table>

검은다리진드기의 유전자 편집을 위한 배아 주입 기술, ixodes 견갑골

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

진드기는 다양한 바이러스, 박테리아 및 원생동물 병원체를 전염시킬 수 있으므로 의학적 및 수의학적으로 중요한 벡터로 간주됩니다. 진드기 매개 질병의 부담이 커지고 있음에도 불구하고 진드기에 대한 연구는 진드기의 독특한 생물학에 기능 연구를 위한 유전자 변형 도구를 적용하는 데 어려움이 있기 때문에 곤충 질병 벡터에 뒤쳐져 있습니다. 모기 매개 질병을 줄이기 위해 유전 적 개입이 주목 받고 있습니다. 그러나 이러한 개입의 개발에는 배아 주입에 의한 안정적인 생식선 변형이 필요합니다. 이러한 배아 주입 기술은 진드기를 포함한 킬리 세레이트에 부족합니다. 진드기 배아의 외부 두꺼운 왁스 층, 단단한 융모막 및 높은 타원형 압력과 같은 몇 가지 요인은 이전에 진드기에서 배아 주입 프로토콜 개발을 방해했던 몇 가지 장애물입니다. 현재의 연구는 이러한 장애물을 극복했으며 검은 다리 진드기 인 Ixodes scapularis 에 대한 배아 주입 기술이 여기에 설명되어 있습니다. 이 기술은 안정적인 생식계열 변형을 위해 CRISPR/Cas9와 같은 구성 요소를 전달하는 데 사용할 수 있습니다.

I. 견갑골에 대한 성공적인 배아 주입 프로토콜은이 기사에서 설명합니다. 알을 낳는 암컷은 부분적으로 왁스 칠한 알의 건조를 피하기 위해 높은 습도에서 보관되었습니다. 왁스 층을 제거하여 중력 암컷의 유전자 기관(왁스 샘)을 절제하여 진드기 배아를 주입했습니다(그림 1A-E). 목이 짧은 알루미노실리케이트 유리 바늘을 사용했습니다(그림 2). 이 모양은 곤충 알 주사에 사용되는 긴 목(테이퍼진) 바늘보다 압력을 더 잘 견딜 수 있기 때문에 진드기 알 주입에 이상적이었습니다. 진드기 알의 구형은 바늘 삽입 중에 슬라이드에서 알을 굴리는 것을 방지하기 위해 무대 뒤의 슬라이드 플랫폼(그림 3A)이 필요합니다. I. 견갑골의 초기 배아 발달은 알려져 있지 않으므로 생식 세포 형성의시기...

본 프로토콜은 진드기 배아를 주입하는 방법을 기술한다. 배아 주입은 유전자 조작을 위해 트랜스제닉 라인을 생성하는 데 선호되는 기술입니다.

검은다리진드기의 유전자 편집을 위한 배아 주입 기술, Ixodes 견갑골

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

이것은 Chelicerata 종에 대한 최초의 배아 주입 프로토콜입니다. 진드기 배아를 주입하는 능력은 많은 연구 라인, 특히 진드기 유전자 기능과 진드기 병원체 상호 작용에 대한 연구를 열 것입니다. 이 기술은 진드기 유전자의 기능 연구에 대한 향후 작업을 허용하고 유전자 구동 시스템을 사용하여 진드기 개체군 제어의 기초를 제공합니다.이 방법은 진드기와 진드기가 분자 수준에서 보유하고있는 병원체 사이의 상호 작용에 대한 이해를 용이하게합니다. 이를 통해 라임 병 및 기타 병원체에 대한 백신 개발에 사용할 수있는 단백질을 식별 할 수 있습니다. 진드기 병원체 상호 작용 및 먹이를 먹는 동안 진드기에 의한 숙주로의 병원체 전파와 같은 여러 연구 분야가이 연구의 이점을 누릴 것입니다.진드기가 숙주의 면역 반응을 피하는 방법과 DNA 복구 메커니즘의 차이와 같은보다 근본적인 질문도 이제 이해할 수 있습니다. 이 절차를 수행하기 전에 이해해야 할 진드기 생물학의 몇 가지 측면이 있습니다. 배아의 높은 내부 압력은 바늘로 만질 때 파열로 이어집니다.주사를 위해 배아를 준비하는 것은 매우 중요합니다. 시작하려면 암컷을 섭씨 4도에서 섭씨 27도 인큐베이터로 옮겨 주사 일주일 전에 알을 낳습니다. 암컷이 알을 낳기 시작하는 3-4 일 후, Gene의 장기 절제를 위해 암컷을 준비하는 동안 끝이 가늘고 붓을 사용하여 알을 제거하십시오.글 랜드를 비우려면 입 부분이 복부와 등쪽 모두에서 보이도록 현미경으로 유리 슬라이드에 중력 진드기를 배열하십시오. 그런 다음 등 쪽의 입 부분 뒤의 영역을 조심스럽게 뚫고 집게를 사용하여 복부 쪽에 압력을가하십시오. 보푸라기가없는 물티슈의 가장자리를 놓고 펑크 부위에서 나오는 액체 왁스를 제거하십시오.또는 해부로 글 랜드를 비우는 대신 진드기 입 부분 주위에 조직 접착제와 같은 접착제를 사용할 수 있습니다. 암컷이 다시 알을 낳기 시작하면 가는 붓을 사용하여 갓 퇴적된 알을 모아 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 0-18시간 된 계란이 들어 있는 튜브에 약 200마이크로리터의 5% 벤잘코늄 클로라이드 물을 추가합니다.계란이 튜브 바닥에 가라앉지 않도록 붓으로 계란을 5분 동안 부드럽게 휘젓고 마이크로 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 계란을 튜브에 남겨둡니다. 계란이 들어있는 튜브에 약 200 마이크로 리터의 증류수를 첨가하십시오. 붓으로 소용돌이치며 마이크로 피펫을 사용하여 마이크로 원심분리 튜브에서 물을 제거합니다.증류수로 세척 한 후 약 200 마이크로 리터의 5 % 염화나트륨을 넣고 붓으로 5 분 동안 부드럽게 소용돌이 치십시오. 그런 다음 5 분 후에 튜브에서 용액을 제거하고 계란을 증류수로 두 번 씻으십시오. 다음으로, 계란이 들어있는 마이크로 원심 분리기 튜브에 약 100 마이크로 리터의 1 % 염화나트륨 용액을 첨가하십시오.먼저 양면 테이프를 사용하여 계란 정렬을 지원하기 위해 약 0.5cm의 간격을 두고 두 개의 유리 현미경 슬라이드를 함께 접착하고 슬라이드 사이의 간격에 있는 양면 테이프에 투명 필름 드레싱 조각을 적용합니다. 그런 다음 붓을 사용하여 슬라이드 설정에서 한 번에 8-10개의 계란을 정렬합니다. 그런 다음 정렬된 계란이 있는 슬라이드를 복합 현미경 스테이지에 놓고 보풀이 없는 물티슈를 사용하여 1% 염화나트륨 용액을 제거합니다.채워진 주사 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 연결된 마이크로 인젝터에 부착합니다. 다음으로, 마이크로 인젝터의 고압 설정을 사용하여 계란 표면에 부드럽게 문질러 바늘을 엽니다. 바늘을 연 후 바늘의 열림에 따라 마이크로 인젝터의 압력을 줄이십시오.그런 다음 슬라이드의 모든 계란을 가능한 한 빨리 10-15도 각도로 주입하고 풋 페달을 빠르게 밟은 다음 젖은 종이 타월로 페트리 접시에 슬라이드를 습도가 높은 조건으로 즉시 옮깁니다. 주입된 배아가 들어 있는 슬라이드를 축축한 여과지가 깔린 큰 페트리 접시에 5-6시간 동안 넣은 후, 주입된 배아가 부착된 투명 필름 드레싱에 증류수 한 방울을 추가합니다. 그런 다음 붓을 사용하여 계란을 부드럽게 옮깁니다.다음으로 계란을 작은 페트리 접시에 옮기고 증류수에 담그십시오. 계란을 물에 담그고 페트리 접시를 6쿼트 플라스틱 상자에 담아 섭씨 27도 이상의 인큐베이터에 넣고 상대 습도 90% 이상에서 놓습니다. 유충이 주사 후 21 일에서 25 일 사이에 주입 된 배아에서 부화하기 시작하면 매일 확인하고 부화 한 유충을 스크린이있는 유리 병으로 옮깁니다.결과는 12 시간에서 18 시간 사이의 배아 발생 초기에 난자를 주입하고 난자의 긴 축을 슬라이드 가장자리에 수직으로 정렬하면 주입 된 난자의 생존율이 높아진다는 것을 입증했습니다. 주입 된 모든 알 중 최대 8.5 %생존하고 유충이 부화했습니다. 이 절차를 시작하기 전에 2.4단계, 어미 진드기에서 왁스 제거, 3.1-3.4단계, 염화벤잘코늄으로 배아 융모막을 연화하고 염화나트륨 용액으로 배아를 건조시켜 성공적인 배아 주입을 가능하게 하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 방법은 주로 진드기 유전자 편집을 위해 개발되었으며,이를 통해 진드기 유전자 기능을 이해하는 데 도움이되는 녹아웃 및 녹인을 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 진드기 연구에 적용될 수있는 다른 많은 유기체에 사용할 수있는 유전자 편집 도구의 사용을 허용합니다. 그리고 이것은 진드기 분자 생물학 연구를 가속화 할 것입니다.

embryo-injection-technique-for-gene-editing-black-legged-tick-ixodes

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 Nijole Jasinskiene는 뎅그열 발열에 대한 벡터 아르 유전자 변형 Aedes aegypti 모기를 생성하기 위해 사용된 방법을 보여줍니다. 정확하게, microinjection의 바늘을 준비하는 배아를 d​​essicating, 그리고 microinjection을 수행하기위한 기술은 증명됩니다.

트렌스 제닉 모기를 구하는 A. aegypti의 태아의 Microinjection

이 비디오에서는 배아 미세주입 기술을 통해 Anopheles gambiae 모기의 배아에 유전자 드라이브 구조를 전달하는 방법을 보여줍니다. 이 절차를 통해 상동 재조합을 통해 전달된 DNA 구조를 생식세포 세포에 통합하여 형질전환된 모기 개체군을 생성할 수 있습니다.

모기 배아 미세주입: 생식세포 돌연변이를 생성하기 위해 Anopheles gambiae의 배아 난황에 외인성 DNA를 전달하는 기술

지중해초파리(medfly) Ceratitis capitata(Diptera: Tephritidae)는 전 세계 농업 해충입니다. 이 식물의 생물학에 대한 깊은 이해는 메드플라이 개체군을 통제하여 경제적 영향을 줄이는 데 중요합니다. 배아 미세주입(embryo microinjection)은 이 종에서 생식세포 형질전환(germ-line transformation)과 역유전학(reverse genetics) 연구를 모두 가능하게 하는 근본적인 도구입니다.

세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,<em&gt; Ceratitis의 capitata</em

건강한 실험실에서 재배 한 진드기의 생산은 진드기 생물학 및 진드기 - 병원체 상호 작용에 대한 연구에 필수적입니다. 여기서 우리는 마우스에 비용 효과적이고 스트레스가 적은 미성숙 진드기 먹이를위한 간단한 프로토콜을 시연합니다.

사육<em&gt; Ixodes의 scapularis,</em&gt; 블랙 다리 틱 : 마우스에 미성숙 단계를 먹이

Microinjection Nasonia vitripennis 배아의 생성 상속 게놈 수정 하기 위한 필수적인 방법입니다. 여기에 설명 된 microinjection 그리고이 유기 체에서 미래 게놈 조작에 크게 용이 하 게 한다 Nasonia vitripennis 배아의 이식에 대 한 자세한 절차가입니다.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

여기에서 우리는 크리켓 계란을 주입하는 프로토콜을 제시, 크리켓의 많은 실험에서 기초 방법 역할을하는 기술, 포함하되 이에 국한되지 않음, RNA 간섭 및 게놈 조작.

그릴루스 바이마쿨라투스 계란 주입

이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 도구와 함께 작동하도록 최적화된 Culex quinquefasciatus 태아를 위한 미세 주입 절차를 기술합니다. 이 기술은 이 저학질병 벡터에 있는 유전 기술을 구축하는 데 사용될 수 있는 사이트 특정, 유전성, 생식선 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있습니다.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

우리는 사육, 계란의 미세 주입 및 게놈 편집 후 돌연변이 균주를 생성하고 유지하기 위해 파이어 브라트 Thermobia 국산의 효율적인 짝짓기를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

파이어 브라트 Thermobia 국내에서 게놈 편집을위한 계란 미세 주입 및 효율적인 짝짓기

곤충 우사회성의 많은 특성은 식민지 내 의사 소통과 노동 분업에 의존합니다. 미세 주입 및 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 통한 개미 배아의 주요 조절 유전자의 유전자 조작은 진사회적 곤충의 이타적 행동의 본질에 대한 통찰력을 제공합니다.

개미 하르페냐토스 염기 에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 위한 배아 주사

이 논문의 전반적인 목표는 닭 배아에 외인성 물질의 난소 세포 내 주사를 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 접근법은 닭 배아의 발달 생물학을 연구하는 데 매우 유용합니다.

오보에서 닭 배아에 혈관 내 주사

배우세요 검은다리진드기 배아 주입 기술을 이용한 유전자 편집 방법으로, Ixodes scapularis의 유전자 기능과 병원체 상호작용을 연구할 수 있습니다. 이 기술은 진드기 매개 감염병 백신 개발과 개체군 통제 전략 수립에 기여합니다.

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