Name: 형광 미토콘드리아를 이용한 조건부 불멸화 마우스 사구체 내피 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 배우세요 형광 미토콘드리아를 이용한 조건부 불멸화 마우스 사구체 내피 세포 분리 방법을. 당뇨병성 신장 질환 치료제 선별을 위한 세포 모델로 활용할 수 있습니다.

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저자는 쥐 내피 세포 분리에 대한 통찰력에 대해 Cijiang He 교수와 Fu Jia 박사에게 감사하고 PhAM절제 마우스와 귀중한 토론을 제공한 Mone Zaidi 교수에게 감사드립니다. 저자는 또한 마운트 시나이에있는 Icahn School of Medicine의 현미경 CORE와 우리가받은 지침에 대해 직원들에게 감사하고 싶습니다. 이 작업은 국립 보건원 보조금 R01DK097253 및 국방부 CDMRP 보조금 E01 W81XWH2010836의 보조금으로 지원되었습니다.

여기에 설명 된 모든 동물 절차는 마운트 시나이의 Icahn School of Medicine의 IACUC에 의해 승인되었습니다. 잭슨 실험실에서 구입한 3마리의 수컷 마우스(H-2Kb-tsA58 광활성화 가능한 미토콘드리아[PhAM]를 갖는 형질전환 마우스)를 사용하고 정상적인 차우 식단을 유지했습니다.
1. 근무 조건 및 준비
<ol><li>70% 에탄올과 UV-C 광선을 사용하여 층류 후드 내부의 작업 공간을 청소하십시오.</li>
	<li>비드의 세척 버퍼를 준비합니다. pH 7.4-8.0에서 0.1M 인산나트륨을 사용하여 완충액-1을 만들고, 칼슘이 없는 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하여 완충액-2를 만들고, 0.1% 소 혈청 항원(BSA), 3mM EDTA, pH 7.4 및 0.1% BSA, pH 8.5를 가진 0.2M 트리스를 사용하여 완충액-3을 만듭니다.</li>
</ol>2. 자성 입자 집중 장치
<ol><li>마그네틱 비드의 제조<ol><li>1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 200μL의 마그네틱 비드(4 x 108 비드)와 200μL의 버퍼-1을 부드럽게 혼합합니다. 참고: 조직 수확 1일 전에 마우스당 200μL의 마그네틱 비드를 준비합니다. 구슬은 사구체를 수확하는 데 사용됩니다.</li>
		<li>튜브를 자성 입자 농축기에 1 분 동안 놓은 다음 상청액을 조심스럽게 흡인하십시오. 자석으로부터 튜브를 제거하고, 세척된 비드를 200 μL의 완충액-1에 재현탁시킨다.</li>
		<li>자성 비드가 들어있는 튜브를 자성 입자 농축기에 1 분 동안 놓고 상청액을 부드럽게 흡인합니다.</li>
		<li>자성 비드를 각각 2x, 5분 동안 세척하고, 튜브를 자성 입자 농축기에 위치시킴으로써 200 μL의 완충액-2를 사용하여 자유 토실기를 불활성화시키고 완충액을 버린다.</li>
		<li>자성 비드를 200μL의 완충액-3에서 4°C에서 24시간 동안 또는 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션하여 나머지 유리 토실기를 비활성화합니다. 튜브를 자기 농축기에 1분 동안 놓고 상층액을 부드럽게 흡인하고 버립니다.</li>
		<li>마그네틱 비드를 200μL의 완충액-2로 4°C에서 5분 동안 1x 세척합니다. 튜브를 자기 농축기에 1분 동안 다시 넣고 상층액을 부드럽게 흡인합니다. 자기 농축기에서 튜브를 제거하고 200μL의 버퍼-2에 자기 비드를 재현탁하여 4 x 108 beads/mL를 얻습니다. 참고: 이 단계에서 비드를 최대 15일 동안 4°C에 방치할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 마우스 신장 사구체 세포의 분리
<ol><li>관류 재료를 준비하십시오 : 30mL 주사기, 25G 나비 바늘. 격리 물질을 준비하십시오 : 멸균 10cm 접시, 메스, 자성 입자 농축기, 40μm 세포 스트레이너, 100μm 세포 스트레이너.</li>
	<li>100% 항생제가 보충된 1x 행크스 밸런스드 소금 용액(HBSS) 1mL를 준비하고 pH를 7.35로 조정합니다. 0.2μm 필터로 용액을 여과하고 오염을 방지하기 위해 후드 아래에 보관하십시오.</li>
	<li>2.1.6단계의 마그네틱 비드 200μL를 1x HBSS 20mL와 혼합합니다. 참고: 각 마우스에 대해 20mL의 HBSS 1x에 희석된 200μL의 비드가 필요합니다.</li>
	<li>1x HBSS 용액, pH 7.35에서 1mg/mL에서 콜라게나제 유형 II(125CDU/mg)의 1mL 분취량을 준비합니다. RPMI를 37°C의 수조에서 10% FCS 배지로 예열한다. 내피 세포 배양 배지를 37°C에서 예열합니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 알림: RPMI는 콜라게나아제를 중화하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>6웰 플레이트의 두 웰을 2mL의 10μg/mL 콜라겐 IV(1mL/웰)로 실온에서 45분 동안 사전 코팅합니다. 플레이트를 1x PBS로 3x 세척하여 콜라겐을 희석하는 데 사용된 아세트산을 제거합니다. 코팅된 플레이트를 즉시 사용하거나 2-8°C에서 최대 4주 동안 보관하십시오. 알림: 건조를 방지하기 위해 투명 필름으로 플레이트를 밀봉하는 것이 좋습니다. 콜라겐 코팅은 세포가 플레이트에 부착되는 것을 용이하게합니다.</li>
	<li>그림 2의 모든 수술 기구를 70% 에탄올을 사용하여 세척하고 살균한 다음 30분 동안 오토클레이브합니다. 70 % 에탄올로 수술 작업 공간을 청소하십시오.</li>
	<li>케타민/자일라진(10mg/mL 케타민 및 1mg/mL 자일라진)을 복강주사하여 마우스를 마취합니다. 동물이 완전히 마취되었는지 확인하려면 발가락 핀치 반사를 확인하십시오.</li>
	<li>마우스의 발을 19G 바늘로 고정하여 해부 플랫폼에 고정하십시오. 가슴과 복부를 70 % 에탄올로 닦고 가위로 가슴을 따라 복부를 엽니 다 (그림 2).</li>
	<li>나비 바늘을 좌심실 (그림 3A)에 삽입하고 약 100μL의 비드 용액 (1.2 단계에서)을 주입하여 혈액 순환을 확장시킵니다.</li>
	<li>19G 바늘로 신장 아래의 하대 정맥을 조심스럽게 부수십시오 (그림 3A). 3.9단계에서 시작된 관류를 계속합니다. 알림: 또는 미니 펌프를 속도: 18.0+, 시간: 5분으로 사용할 수 있습니다. 좋은 관류는 많은 수의 사구체 베어링 자기 구슬을 수확하는 데 중요합니다. 이것은 비 생존 / 말기 절차입니다.</li>
	<li>핀셋으로 지방 조직을 부드럽게 제거하고 얇은 수술 가위 c (그림 2)로 양쪽 신장을 절제하고 얼음 위에 1x HBSS 1mL가 담긴 접시에 넣습니다. 신장을 가위 b(그림 2)로 다진 다음 멸균 메스로 도 3B와 같이 1mm 작은 조각으로 다진다.</li>
	<li>다음으로, 다진 신장을 3.4단계로부터 1mL의 콜라게나제 유형 II와 함께 수평 쉐이커를 사용하여 부드럽게 기울이면서 37°C에서 35분 동안 배양한다. 조직은 그림 3C와 같이이 단계 후에 완전히 소화되어야합니다.</li>
	<li>콜라게나제를 중화하기 위해 10% FBS(3.4단계에서)와 함께 4mL의 RPMI를 추가합니다. 멸균된 100μm 세포 여과기를 통해 소화된 조직을 50mL 튜브로 여과합니다. 멸균 1.5mL 미세 원심분리 튜브의 바닥을 사용하여 소화된 조직을 여과기에 대고 저어 사구체가 통과할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>셀 스트레이너를 15mL의 1x HBSS로 헹군 다음 실온에서 5분 동안 200 x g 의 플로우스루를 원심분리합니다. 이 시점에서 펠릿에는 세 개의 층이 포함됩니다. 사구체가있는 비드는 튜브의 중간 층에서 볼 수 있으며 상층은 세뇨관과 같은 더 작은 구조로 구성되며 하단 층은 파편입니다 (그림 3D).</li>
	<li>상청액과 상단 흰색 층을 조심스럽게 흡인하십시오. 나머지 펠릿에는 사구체와 파편이 있는 구슬이 들어 있습니다(그림 3D). 1.5mL의 1x HBSS로 펠릿을 재현탁하고 2mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>튜브를 자기 농축기 (그림 3E)에 놓고 상청액을 흡입 한 다음 비드를 1x HBSS 1mL로 2x 세척합니다. 이 단계에서 20μL의 세포 현탁액을 슬라이드에 올려 현미경으로 사구체의 존재를 확인합니다(그림 3F, 현탁액의 사구체[검은색 화살표] 및 현탁액의 일부 구슬[노란색 화살표]).</li>
	<li>상청액을 조심스럽게 흡인하고 펠릿을 내피 세포 성장 배지(재료 표)에 재현탁한 다음 깨끗한 2mL 튜브로 옮깁니다. 2μL의 IFNγ(100U/mL)를 튜브에 넣고 세포를 6웰 플레이트의 한 웰에 플레이팅합니다. 세포를 33°C에서 배양한다.</li>
	<li>배양 3일 후, 배지 1mL를 피펫팅하고 1mL의 새 배지로 교체하여 배지를 조심스럽게 교체합니다. 이 단계에서 세포는 사구체 세포의 혼합물로 이질적입니다 (그림 4G). 참고: 성장하는 배양물에는 사구체 세포와 일부 자성 비드가 혼합되어 있습니다(그림 4G). 모든 세포는 녹색의 형광 미토콘드리아를 보여야 합니다.</li>
	<li>배양 7일 후, 배지를 완전히 흡인하고 IFNγ(100U/mL)가 보충된 새로운 내피 세포 성장 배지 2mL로 교체합니다. 이 단계에서 세포는 증식하기 시작하지만 여전히 이질적입니다 (그림 4A).</li>
	<li>배양 10일 후 세포가 ~80% 컨플루언시에 도달하면 단계 5.1에 설명된 대로 트립신을 사용하여 세포를 계대한 다음 콜라겐 IV로 코팅된 T25 플라스크로 옮깁니다.</li>
	<li>1주일(총 ~21일의 배양) 후, 세포를 콜라겐 IV로 코팅된 T75 플라스크에 계대시킨다.</li>
</ol>4. 내피세포 분리를 위한 비드의 제조
<ol><li>양-항-래트 비드를 항-마우스 CD31 항체 3,18,19로 코팅함으로써 시작한다. 각 T75 플라스크에 10μL의 비드를 사용합니다.</li>
	<li>0.1% BSA, 2mM EDTA, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 1x PBS 200μL로 비드 10μL를 3배 세척합니다. 튜브를 농축기 자석에 넣어 매번 세척 버퍼를 피펫팅합니다.</li>
	<li>비드를 200μL의 PBS, 1% BSA, 2mM EDTA, 1% 페니실린/스트렙토마이신에 재현탁합니다. 4.8μL의 쥐 항-마우스 CD31 항체 7,18,19를 추가하고 튜브를 수평 셰이커에 놓고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 혼합한 다음 튜브를 4°C에서 밤새 유지합니다.</li>
</ol>5. CD31 코팅 비드로 사구체 내피 세포 분리
<ol><li>T75 플라스크에 0.25% 트립신 3mL를 넣고 세포를 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 3mL의 내피 성장 배지로 트립신을 중화시키고 세포를 15mL 튜브로 옮긴 다음 200 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상청액을 흡인하고 1% BSA, 2mM EDTA, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 1mL의 PBS에서 세포를 세척한다. 200 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>단계 4에서 제조된 코팅된 비드 200μL에 펠릿을 재현탁하고, 1% BSA, 2mM EDTA, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 PBS 800μL를 첨가한다. 세포를 37°C, 5%CO2에서 연속 진탕하면서 45분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>튜브를 자기 농축기에 넣고 1% BSA, 2mM EDTA, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 1x PBS로 세포를 4x 세척합니다. 100 U/mL IFNγ가 보충된 3 mL의 내피 성장 배지에 세포를 재현탁시킨다.</li>
	<li>6웰 플레이트의 콜라겐 IV 코팅 웰에 1.5mL의 세포/웰을 플레이팅합니다. 세포를 33°C에서 허용 조건 하에서 배양한다. 참고: 분리된 세포는 유인원 바이러스 40(SV40) 대형 T 항원 tsA58을 발현하여, 33°C(허용 조건)에서 연속 증식의 활성화를 가능하게 한다.</li>
	<li>배양 4일 후, 750μL의 배지를 제거하고 100U/mL IFNγ가 보충된 동일한 부피의 신선한 배지로 교체합니다.</li>
	<li>배양 10일에서 14일 후, 488nm 필터가 있는 에피형광 현미경을 사용하여 형광 미토콘드리아를 발현하는 성장하는 CD31 양성 GEC 콜로니(그림 4C)를 확인합니다.</li>
	<li>배양 21일 후 세포는 80%-90% 컨플루언스에 도달했을 수 있습니다. T25 플라스크로 옮깁니다. 컨플루언스에 도달한 후, 세포는 RPMI 성장 배지 및 10% FCS로 유지될 수 있다. 참고: 합류점에 도달하기 전에 세포가 이질적으로 보일 수 있습니다(그림 4B). 그러나 일단 합류하면 조약돌 형태를 얻습니다.</li>
	<li>이 단계에서 세포를 냉동 보존 할 수 있습니다. 80% 컨플루언시에 도달하면 0.25% 트립신 3mL를 세포에 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 10 % FBS가 보충 된 동일한 부피의 성장 배지로 트립신을 중화하십시오.</li>
	<li>200 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세포를 3mL의 동결 배지(RPMI, 20% FBS, 10% DMSO)에 재현탁시킨다. 극저온 튜브에 세포를 분취하여 액체 질소 증기 온도에 보관하십시오.</li>
</ol>6. 미토덴드라2-GEC의 육성
<ol><li>단계 5.10의 냉동 분취액으로부터 세포를 37°C의 수조에서 해동하고 이들을 10mL의 사전 예열된 내피 성장 배지가 있는 15mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>실온에서 5분 동안 200 x g 의 현탁액을 원심분리합니다. 배지를 제거하고, 펠렛을 100 U/mL IFNγ가 보충된 미리 예열된 내피 세포 성장 배지를 사용하여 콜라겐 IV-코팅된T25 cm2 세포 배양 플라스크로 옮기고 33°C에서 배양한다.</li>
	<li>다음날 매체를 교체하십시오. 세포가 보통 5 일 후에 70 % -80 % 컨플루언시에 도달하면 T75cm2 세포 배양 플라스크로 옮깁니다.</li>
	<li>세포를 내피 표현형으로 분화시키기 위해, 세포를 IFNγ가 없는 성장 배지 중 37°C에서 비허용 조건으로 옮긴다.</li>
</ol>7. 미토덴드라2-GEC의 통과
<ol><li>배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하고, 따뜻한 0.25% 트립신-EDTA 용액 (T75cm2 플라스크) 3 mL를 첨가하고, 37°C에서 5분 동안 배양한다.</li>
	<li>세포가 분리되면 5mL의 성장 배지와 피펫을 위아래로 추가합니다. 현탁액을 실온에서 5분 동안 200 x g 으로 원심분리하고, 세포를 새로운 콜라겐 IV 코팅 플라스크 또는 플레이트로 옮긴다. 참고: 패시징은 일주일에 한 번 1:4의 비율로 수행해야 합니다.</li>
</ol>8. 유사 분열의 특성화 덴드라2-GEC
<ol><li>분화된 세포 7,18,19,20에서 CD31에 대한 면역형광 염색을 수행합니다(그림 4D). vWF 및 Isolectin-B4와 같은 다른 마커도 사용하십시오20.</li>
	<li>Dendra2의 미토콘드리아 특이성을 확인하기 위해, 세포를 미토콘드리아 특이적 마커로 표지하여 세포를 100 nM의 미토콘드리아 트래커를 포함하는 성장 배지에서 37°C, 5%CO2에서 30분 동안 배양하였다.</li>
	<li>배지를 제거하고 페놀 레드가 없는 예열된 배지로 세포를 부드럽게 세척하여 라이브 이미징을 수행합니다. 참고: 또는 포름알데히드 고정액(4%)을 사용하여 30분 동안 세포를 고정한 다음 PBS에서 여러 번 세척할 수 있습니다. 고정 셀은 사용 시까지 1x PBS로 4°C에서 보관할 수 있습니다. 유세포 분석을 통한 확인도 가능합니다 : 항 -CD31, 항 -PECAM, 항 -CD45로 세포를 표지하십시오. GEC는 족세포 마커(시냅토포딘, Nphs1, Podxl), 간질 세포 마커(PDGFRβ, 안지오텐시노겐) 및 관형 세포 마커(아쿠아포린, 아미노펩티다제-N)에 대해 음성으로 염색되어야 합니다. 이 마커는 음성 대조군 역할을합니다. 이러한 세포의 미토콘드리아 특이적 Dendra2 발현으로 인해 FITC 채널을 사용하지 마십시오.</li>
</ol>9. 산화 스트레스 또는 고포도당에 대한 반응으로 미토콘드리아 구조 변화의 라이브 셀 이미징
<ol><li>내피 세포 성장 배지를 사용하여 콜라겐 IV로 코팅 된 35mm 유리 바닥 접시에 1 x 105 GEC를 플레이트합니다 (재료 표). 24 시간 후 페놀 레드가없는 배지로 변경하십시오. 세포에는 녹색 형광 미토콘드리아가 있습니다.</li>
	<li>실험 시작 1시간 전에 환경 챔버를 37°C, 5% 습도, 및 5%CO2 로 설정하였다.</li>
	<li>컨포칼 현미경에서 40x/1.2W 대물렌즈를 사용하여 초점을 조정하고 관심 영역을 선택합니다. 세포를 2mL의 5mM 또는 25mM 글루코스와 함께 60분 동안 배양합니다.</li>
	<li>세포를 405nm 레이저(4% 레이저 출력)에 노출시켜 미토콘드리아 하위 집단을 녹색에서 빨간색으로 광변환합니다(그림 5A-B, DE).</li>
	<li>561nm 레이저를 사용하여 변환되지 않은 상태에서 Dendra2를 여기시켜 적색 형광을 시각화합니다. 앞서 설명한 대로 자세한 포토 스위칭 프로토콜을 참조하십시오16. 융합 이벤트는 녹색 매트릭스와 빨간색 매트릭스 융합으로 인해 몇 분 후에 노란색 형광으로 나타납니다(그림 4C, F).</li>
</ol>

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저자는 선언 할 경쟁 재정적 이익이 없습니다.

미토콘드리아는 세포 대사, 항상성 및 스트레스 반응에 중요하며 기능 장애는 신장 질환을 포함한 많은 질병과 관련이 있습니다. 미토콘드리아는 과도한 활성 산소 종 (ROS)의 병리학 적 생성, 세포 내 칼슘 수치의 조절, 세포 사멸 경로 및 세포 골격 역학21,22,23에 역할을합니다.
쥐 GEC의 분리는 적은 수, 크기, 기질 인자 및 생존에 필수적인 다른 사구체 세포와의 상호 의존성 때문에 어렵습니다. 현재 기사에서는 마우스 GEC 분리에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 구체적으로, 우리는 높은 증식 잠재력을 가진 조건부 불멸화 된 세포주를 얻기위한 도구로 형질 전환 마우스를 사용했습니다. 유인원 바이러스 40(SV40) 대형 T 항원 tsA58을 발현하는 형질전환 마우스를, 33°C에서 허용 조건 하에서 연...

사구체는 사구체 여과 장벽 1,2를 통과하는 큰 분자의 통과를 제한함으로써 혈액 여과에 중요합니다. 사구체는 정수리 상피 세포, 족 세포 (내장 상피 세포), 사구체 내피 세포 (GEC) 및 간질 세포3의 네 가지 세포 유형을 포함합니다. 사구체 내피는 큰 여과 부피에 필요한 fenestrae의 존재에 따라 독특한 혈관 구조를 특징으로합니다4. 사구체 내피의 정점 표면은 음전하를 띤 글리코칼릭스 층과 내피와 혈액 사이에 공간을 만드는 내피 표면층이라고 하는 코트로 덮여 있습니다. 이 구조는 알부민과 같은 음전하를 띤 분자의 통과를 제한하고 백혈구 및 혈소판 부착을 방지하는 높은 전하 선택성을 제공합니다5.
GEC는 당뇨병 환경과 관련된 고혈당증과 같은 대사 변화에 매우 민감합니다. 실제로 당뇨병은 유해 물질의 순환 증가, 포도당 대사 경로의 포화 및 세포 산화 환원 균형 방해로 이어집니다 3,6. 또한, 활성 산소 종의 증가는 내피 기능에 영향을 미치는 미토콘드리아 기능 장애를 유도합니다7.
현재 프로토콜의 전반적인 목표는 형광 미토콘드리아 특징을 가진 불멸화 된 사구체 내피 세포를 분리하는 것입니다. 실제로, 일차 GEC의 세포 배양은 제한된 증식 주기 및 초기 노화8를 갖는다. 또한, 형광 미토콘드리아의 존재는 고혈당증 또는 다른 치료에 대한 반응으로 핵분열 및 융합 사건을 검사하는 데 도움이됩니다. 대안으로 다른 실험실에서는 h-TERT를 사용하여 시험관 내9에서 세포를 불멸화했습니다.
여기에 설명 된 방법은 4-6 주 된 동물에서 조건부로 불멸화 된 mitoDendra2 사구체 내피 세포를 분리 할 수 있습니다 (그림 1). 이 상세한 프로토콜은 유인원 바이러스 40 대형 종양 항원 (SV40 TAg) 유전자10,11을 보유하고있는 트랜스 제닉 마우스 (H-2K b-tsA58)의 사용을 설명하여 열 안정성 조건부 불멸화 세포를 생성합니다. tsA58 TAg 유전자 생성물은 마우스 H-2Kb 유전자의 유도성 5' 플랭킹 프로모터의 제어 하에 33°C의 허용 온도에서 기능하며, 이는 인터페론 감마(IFNγ)에 노출시 기저 수준 이상으로 증가하여, 조건부 증식 표현형(12)을 유지한다. H-2Kb는 IFNγ의 부재하에 37°C의 비허용 온도에서 급속히 분해되어, 세포에서 tsA58Tag의 불멸화 기능을 제거하고, 세포가 보다 분화된 표현형13,14,15를 개발할 수 있게 한다. H-2Kb-tsA58 형질전환 마우스를 미토콘드리아 특이적(시토크롬 c 산화효소의 서브유닛 VIII) Dendra2-green을 발현하는 PhAM 마우스와 임의로 교차시켜 형광 미토콘드리아16의 실시간 검출을 가능하게 합니다. Dendra2 녹색 형광은 405nm 레이저16에 노출된 후 적색 형광으로 전환됩니다. 미토콘드리아가 광 전환 후 융합되면 녹색과 노란색 물질의 교환으로 노란색으로 나타나거나 핵분열 7,17을 겪을 때 빨간색으로 나타나는 길쭉한 모양을 형성합니다. mitoDendra2-GEC는 다양한 자극에 대한 GEC 미토콘드리아의 세포 반응을 연구하기위한 훌륭한 도구입니다.

<table><tbody><tr><td>100 &마이크로; m 세포 여과기</td><td>Fisher</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>1ml 인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>25G 나비</td><td>BD</td><td>367298</td><td></td></tr><tr><td>3mm 절삭 가위</td><td>FS T</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>30ml 주사기</td><td>BD Biooscience</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>40 &마이크로; m 세포 여과기</td><td>Fisher</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m 나일론 메쉬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>본 가위</td><td>F.S.T</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>abcam</td><td>ab7388</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 I 형</td><td>코닝</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 II 형</td><td>SIGMA</td><td>C6885</td><td>125CDU / mg</td></tr><tr><td>Collagene 유형 IV</td><td>SIGMA</td><td>C5533-5M</td><td></td></tr><tr><td>Dnase-I</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads 450</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14013</td><td></td></tr><tr><td>내피 세포 성장 매체</td><td>Lonza</td><td>cc-3156</td><td></td></tr><tr><td>Extra fine graefe forceps</td><td>FS</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td>Heat inactivated</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Thermofisher</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>F.S.T Dumont</td><td>E6511</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>IFNg</td><td>세포 과학</td><td>CRI001B</td><td></td></tr><tr><td>Immortomouse</td><td>Jackson laboratory</td><td>32619</td><td>Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ</td></tr><tr><td>L-글루타민 100x</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>자기 입자 집광기</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12320D</td><td></td></tr><tr><td>mitotracker</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>페네실린 스트렙토 마이신 100x</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>PhaM 마우스</td><td>Jackson 실험실</td><td>18397</td><td>B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J</td></tr><tr><td>프로테아제 (10 mg/ml)</td><td>SIGMA</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>GIBCO</td><td>3945</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루베이트 100mM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>표준 패턴 펜치</td><td>&nbsp; F.S.T</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위 - 샤프 블런트</td><td>F.S.T</td><td>14008-14</td><td></td></tr><tr><td>시냅토포딘</td><td>산타</td>크루즈 <td>sc-515842</td><td></td></tr><tr><td>트립신 0.05%</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

형광 미토콘드리아를 이용한 조건부 불멸화 마우스 사구체 내피 세포의 분리

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

사구체 내피 세포 (GEC) 기능 장애는 사구체 여과 장벽 파괴를 시작하고 기여할 수 있습니다. 증가된 미토콘드리아 산화 스트레스는 일부 사구체 질환의 발병기전에서 GEC 기능장애를 초래하는 메커니즘으로서 제안되었다. 역사적으로 생체 내 모델에서 GEC를 분리하는 것은 사구체에서 순수 배양을 분리하는 데 어려움이 있기 때문에 악명이 높았습니다. GEC는 시험관 내에서 복잡한 성장 요구 사항과 매우 제한된 수명을 가지고 있습니다. 여기에서는 형광 미토콘드리아로 조건부로 불멸화 된 GEC를 분리하고 배양하여 미토콘드리아 분열 및 융합 이벤트를 추적 할 수있는 절차를 설명합니다. GEC는 조건부로 증식을 촉진하고 세포 분화를 억제하는 열안정성 SV40 TAg(Immortomouse로부터)를 발현하는 이중 트랜스제닉 마우스의 신장에서 분리되었으며, 모든 미토콘드리아에서 광전환성 형광 단백질(Dendra2)을 분리했습니다(광활성화 가능한 미토콘드리아[PhAM절제] 마우스로부터). 생성된 안정한 세포주는 불멸화 SV40 TAg 유전자의 불활성화 후 세포 분화를 가능하게 하고 미토콘드리아 하위 집합의 광활성화를 일으켜 형광을 녹색에서 빨간색으로 전환합니다. mitoDendra2-GEC를 사용하면 세포를 염색하지 않고도 형광 미토콘드리아의 분포, 융합 및 핵분열 이벤트를 실시간으로 이미징할 수 있습니다.

이 기사에서는 안정적인 형광 미토콘드리아(mitoDendra2-GECs)를 가진 조건부 불멸화 사구체 내피 세포의 분리를 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다(그림 1). 젊은 6-10 주 된 마우스의 사용은 상당한 수의 건강한 세포를 얻는 데 필수적입니다. 배양 3일 후, 세포는 도 3G에 도시된 바와 같이, 분리된 사구체로부터 천천히 성장하기 시작한다. 7일 후, 세포는 이질적이며, 족세포, 정수리 상피 세포 및 간질 세포와 같은 다른 사구체 세포 유형을 나타낸다(도 4A). 70% 내지 80% 컨플루언시에 도달한 후, 다른 사구체 세포를 자성 CD31 표지된 비드를 갖는 내피 세포의 양성 선택을 사용하여 제거하였다(도 4B-C). mitoDendra2...

이 논문은 열안정성 유인원 바이러스 40 및 광활성성 미토콘드리아를 발현하는 트랜스제닉 마우스의 신장으로부터 조건부로 불멸화된 사구체 내피 세포를분리하는 방법을 설명한다. 우리는 구슬, 소화 단계, 파종 및 GECs-CD31 양성의 배양을 사용하여 전체 신장에서 사구체를 분리하는 절차를 설명합니다.

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...

안정적인 형광 미토콘드리아를 가진 불멸화 된 사구체 내피 세포는 시험관 내에서 미토콘드리아 구조에 대한 다양한 자극의 효과를 조사하는 훌륭한 도구입니다. 현재 기사에서 기술된 방법은 많은 수의 사구체 내피 세포를 생성한다. GEC에서 소분자를 테스트함으로써 GEC가 영향을받는 당뇨병 성 신장 질환에 대한 단독 요법을 선별 할 수 있습니다.설명 된 방법은 수행하기 쉽고 특정 장비가 필요하지 않습니다. 그러나 오염 방지를 위해 설명 된 단계를 따르고 장비를 멸균하는 것이 중요합니다. 시작하려면 신장 사구체 세포를 분리하는 데 필요한 관류 및 분리 재료를 작업 공간에 배치하십시오.새로 준비된 행크스 밸런스드 소금 용액 (HBSS)을 0.2 미크론 필터로 여과하고 오염을 피하기 위해 후드 아래에 보관하십시오. 그런 다음 200마이크로리터의 마그네틱 비드와 20밀리리터의 HBSS를 혼합합니다. RPMI를 섭씨 37도의 수조에서 10%FCS 및 내피 세포 배양 배지로 예열합니다.이어서, 6-웰 플레이트의 2웰을 실온에서 45분 동안 콜라겐 IV 밀리리터당 10 마이크로그램의 2 밀리리터로 프리코팅한다. 플레이트를 PBS로 두 번 세척하여 콜라겐을 희석하는 데 사용된 아세트산을 제거한다. 코팅된 플레이트를 즉시 사용하거나 섭씨 2도에서 8도까지 최대 4주 동안 보관하십시오.수술 기구와 작업 공간을 70% 에탄올로 청소하십시오. 이어서, 수술 도구를 30 분 동안 오토 클레이브한다. 마취 된 마우스의 복부를 연 후 나비 바늘을 좌심실에 삽입하십시오.혈액 순환을 확장하기 위해 100마이크로리터의 비드 용액을 주입하려면 19게이지 바늘로 신장 아래의 하대정맥을 조심스럽게 부수고 비드 용액의 관류를 계속합니다. 그런 다음 핀셋으로 지방 조직을 부드럽게 제거하고 얇은 수술 용 가위 C로 양쪽 신장을 절제하고 얼음 위에 HBSS 1 밀리리터가 든 접시에 놓습니다. 멸균 메스로 신장을 1 밀리미터의 작은 조각으로 만듭니다.다진 신장을 1 밀리미터의 신선하게 준비된 콜라게나제 II 형으로 섭씨 37도에서 35 분 동안 수평 셰이커에서 부드럽게 기울입니다. 소화 후 10 % FBS로 4 밀리리터의 RPMI를 추가하여 콜라게나 제를 중화시킵니다. 멸균된 100미크론 세포 여과기를 통해 소화된 조직을 50밀리리터 튜브로 여과합니다.멸균 된 1.5 밀리리터 튜브의 바닥을 사용하여 소화 된 조직을 여과기에 대고 저어 사구체가 통과하도록합니다. 15 밀리리터의 HBSS로 셀 스트레이너를 헹굽니다. 이어서, 유동을 실온에서 5분 동안 200 XG에서 원심분리한다.이 단계에서 튜브에는 3 개의 층이 있습니다. 상층은 세뇨관과 같은 더 작은 구조를 포함하고, 중간 층은 사구체가있는 구슬이며, 하층에는 파편이 들어 있습니다. 상청액과 상단 흰색 층을 조심스럽게 흡인하십시오.그런 다음 사구체와 파편이 들어있는 비드가 들어있는 펠릿을 1.5ml의 HBSS에 다시 현탁시키고 2 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브를 자기 농축기에 넣고 1 밀리리터의 HBSS로 비드를 두 번 세척하기 전에 상청액을 흡인합니다. 20 마이크로리터의 세포 현탁액을 슬라이드에 놓습니다.그런 다음 사구체의 존재에 대해 현미경으로 슬라이드를 관찰하십시오. 다음으로, 펠릿을 내피 세포 성장 배지에 재현탁시키고 현탁액을 2 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 배지 3 밀리리터 당 1 마이크로 리터의 인터페론 감마를 첨가하고 섭씨 33도에서 배양하기 위해 세포를 6 웰 플레이트에 넣습니다.3 일간의 배양 후 1 밀리리터 배지를 조심스럽게 새 배지로 교체하십시오. 이 단계에서 세포는 사구체 세포의 혼합물로 이질적입니다. 7일 후, 배지를 인터페론 감마가 보충된 2밀리리터의 새로운 내피 세포 성장 배지로 교체하여 세포 증식을 시작합니다.10일 후 세포가 80%컨플루언스에 도달하면 트립신을 사용하여 계대배양하고 콜라겐 IV.21일 배양 후 세포를 T-75 플라스크로 옮깁니다. T-75 플라스크에 0.25 % 트립신 3 밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 5 분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 3 밀리리터의 내피 성장 배지로 트립신을 중화시키고 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 옮겨 200 XG에서 5 분 동안 원심 분리합니다.상청액을 흡인하고 1% BSA, 2 밀리몰 EDTA, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 PBS 1밀리리터로 세포를 세척한다. 다시, 펠렛을 200 마이크로리터의 CD31 항체 코팅 비드 및 800 마이크로리터의 PBS에 원심분리하고 재현탁시킨다. 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 지속적으로 흔들어 45 분 동안 세포를 배양합니다.다음으로, 튜브를 자기 농축기에 놓고 BSA, EDTA 및 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 PBS로 세포를 4회 세척합니다. 마지막 세척 후, 인터페론 감마가 보충 된 3 밀리리터의 내피 성장 배지에 세포를 재현 탁시킨다. 콜라겐 IV 코팅된 웰에 웰당 1.5밀리리터의 세포를 6-웰 플레이트에 플레이트하고 섭씨 33도의 허용 조건 하에서 배양한다.4 일 후, 750 마이크로 리터의 배지를 인터페론 감마가 보충 된 새로운 내피 성장 배지로 교체하십시오. 배양 10-14일 후 488나노미터 필터가 있는 에피형광 현미경을 사용하여 형광 미토콘드리아를 발현하는 콜로니인 CD31 양성 사구체 내피 세포 또는 GEC가 성장하는 것을 관찰합니다. 21일 후 또는 세포가 80-90% 컨플루언시에 도달하면 T-25 플라스크로 옮깁니다.10%FCS를 함유하는 RPMI 성장 배지로 배양물을 유지한다. 또는 세포를 냉동 보존할 수 있습니다. 앞서 입증 된 것처럼 트립신을 사용하는 통로 세포.그런 다음 세포를 원심분리하고 펠릿을 3밀리리터의 동결 배지에 재현탁합니다. 극저온 튜브에 세포를 분취하여 액체 질소, 증기 온도에 보관하십시오. 이 프로토콜은 사구체 내피 세포의 단리를 위한 방법을 기술하였다.분리 된 사구체에서 세포는 배양 3 일 후에 천천히 성장하기 시작했습니다. 7일 후, 세포는 이질적으로 나타났고 족세포, 정수리, 상피 및 간질 세포와 같은 다른 사구체 세포 유형을 보여주었습니다. 70 내지 80%컨플루언시에 도달한 후, 내피 세포의 양성 선택을 사용하여 다른 사구체 세포를 제거하였다.MitoDendra2 GECs는 CD31을 발현하고 시냅토포딘 음성 염색에서 알 수 있듯이 족세포 마커에 대해 음성이었습니다. 미토콘드리아 구조에 대한 포도당 농도의 영향을 조사하였다. 정상 포도당 하에서 세포에서 볼 수있는 길쭉한 미토콘드리아와 비교하여, 높은 포도당은 눈에 띄는 스페로이드 모양의 미토콘드리아에 의해 관찰 된 바와 같이 미토콘드리아의 단편화 또는 분열을 유도했습니다.또한 405나노미터 레이저를 사용하여 단일 살아있는 MitoDendra2 GEC에서 선택된 미토콘드리아 하위 집단을 광변환했습니다. 정상 및 고 포도당 농도 처리 된 세포에 대해 선택된 영역에서 녹색에서 빨간색으로 미토콘드리아의 성공적인 광 전환이 표시됩니다. 이 전환을 통해 MitoDendra2 GEC의 융합 이벤트를 목격할 수 있었습니다.정상 포도당 하에서, 미토콘드리아 매트릭스 융합으로 인해 황색 병합 된 녹색 및 적색 형광이 관찰되었다. 대조적으로, 고 포도당 처리 GECs에서, 미토콘드리아는 주로 단편화되었다. 소량의 성장 배지가 있는 6웰 플레이트의 한 웰에 세포를 배치하는 것은 세포가 접시에 부착되도록 하는 데 필수적입니다.분리된 내피 세포는 미토콘드리아 기능 및 구조 연구를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 형광 미토콘드리아 기능을 가진 불멸의 내피 세포의 사용은 약물 발견을 향한 길을 열 것입니다. 작은 분자는 세포에서 테스트 할 수 있으며 라이브 이미징을 수행하여 미토콘드리아 기능에 미치는 영향을 검사합니다.

isolation-conditionally-immortalized-mouse-glomerular-endothelial

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 쥐의 신장에서 온전한 사구체를 분리하는 방법을 설명합니다. 이렇게 얻어진 캡슐화 및 캡슐화되지 않은 사구체는 쥐 신장에서 두정엽 상피 세포 파생물을 배양하는 데 추가로 사용될 수 있습니다.

사구체 분리: 쥐 신장에서 온전한 사구체를 얻는 기술

기본 세포 배양은 특히 특정 발달 단계에서 유전자 변형 마우스 배아에서 세포의 특정 인구를 분석하기위한 유용한 기술이다. 여기서, 배아 심실는 해부와 해리, 항체가 결합 된 구슬 인식하고 자세한 분석을 위해 내피 세포를 분리한다.

배아 심실 내피 세포의 분리

심장 판막 내피 세포(VEC)를 분리하는 능력은 판막 발달, 유지 및 질병의 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다.  여기에서는 FACS를 사용하여 배아 및 성인 Tie2-GFP 마우스에서 VEC를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 발달 및 질병 과정에서 VEC의 기여도를 결정하는 연구를 수행할 수 있습니다.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

혈관 내피 세포는 많은 중요한 심혈관 질환에서 중요한 역할을 합니다. 이 기사에서는 특별한 장비를 사용하지 않고 쥐 대동맥에서 내피 세포를 분리하고 확장하는 간단한 방법을 설명합니다. 당사의 프로토콜은 내피 세포 생리병리학에서 메커니즘을 식별하는 효과적인 수단을 제공합니다.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

이 프로토콜은 이미징 또는 분자 생물학 실험을 수행하기 위해 마우스 관상 동맥 내피 세포를 분리하는 방법을 공유하기 위해 준비되었습니다.

마우스 관상 내피 세포의 분리

이 프로토콜에는 분리 하 고 마우스 기본 신장 관 세포 이후에 하위 신장 생물학 기능 비보 전, 미토 콘 드리 아 생체를 포함 하 여 평가 양식 수 있는 특성화 하는 비용 효율적인 접근 방식을 제공 합니다.

마우스 기본 신장 관 상피 세포의 고립, 특성, 및 높은 처리량 세포 외 유출 분석

이 프로토콜은 세포 수율, 순도 및 생존성에 최적화된 뮤린 출생후 망막 내피 세포의 단리를 위한 방법을 설명한다. 이 세포는 차세대 시퀀싱 접근법에 적합합니다.

차세대 염기서열분석을 위한 뮤린 망막 내피 세포의 분리

이 기사에서는 신생아 마우스에서 일차 폐 내피 세포를 분리하고 배양했습니다.

일차 마우스 폐 내피 세포의 분리

여기에서 우리는 텔로세포를 포함한 쥐의 장 중간엽을 분리하는 프로토콜을 제시합니다. 이들은 마우스 또는 인간 유래 오가노이드와의 공동 배양과 같은 여러 응용 분야에 사용하여 성장을 지원하고 원래 조직의 상황을 더 잘 반영할 수 있습니다.

쥐 장 중간엽의 분리로 텔로세포의 높은 수율

이 연구는 쥐 중간막 세포(MC)와 생체 외 세포 배양을 위한 최적화된 프로토콜을 개발했습니다. 이러한 세포는 세포 성장이나 단백질 발현을 손상시키지 않고 여러 번 배양, 동결, 재생 및 배양할 수 있습니다.

Optimizing Isolation and Purification of Murine Glomerular Mesangial Cells

배우세요 형광 미토콘드리아를 이용한 조건부 불멸화 마우스 사구체 내피 세포 분리 방법을. 당뇨병성 신장 질환 치료제 선별을 위한 세포 모델로 활용할 수 있습니다.

형광 미토콘드리아를 이용한 조건부 불멸화 마우스 사구체 내피 세포의 분리

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