Name: 생리학적 크기의 미세유체 배양 장치에서 상피 세포 단층의 준비 및 구조 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 배우세요 미세유체 배양 장치에서 상피 세포 단층의 준비 및 구조 평가 방법을. 공초점 레이저 주사 현미경을 활용한 정량적 분석으로 ARDS 및 VILI 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 미세유체 채널 구성에 사용되는 3M 접착제 및 마일라 시트의 절단 패턴을 설계하고 세포 배양 배지 유속 및 주사기 펌프 프로그래밍을 테스트한 Alan Shepardson에게 감사를 표합니다. 자금은 NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 및 Newcomb-Tulane College Dean's Grant에서 제공했습니다.

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

제시된 프로토콜은 단일 채널 미세유체 흐름 어레이의 동적 환경과 기존의 8웰 챔버 커버글라스의 정적 환경에서 NCI-H441 인간 폐 상피 세포의 배양, 가교 고정, 염색, 투과화 및 컨포칼 현미경 시각화를 설명합니다. 모든 미세유체 세포 배양 프로토콜에서 세포 배양 배지의 흐름 조건은 고속 흐름이 세포를 씻어내거나 세포 단층의 정상적인 조립을 방해할 가능성이 있기 때문에 가장 중요합니다. 한편, 저-유동은 유동 특성(30)뿐만 아니라 미세유체 채널의 불투과성 성질에 의해 부과된 확산 제한으로 인해 세포층을 "굶주리게" 또는 "질식시키는"(각각 불충분한 영양소 및 산소 이용가능성) 잠재성을 갖는다. 10분의 대기 기간(세포가 원래 채널을 채웠던 동일한 매체에 부유 상태로 유지됨)으로 시작하여 0.2μL/min의 유속으로 진행한 후 최종적으로 4시간 동안 최대 10μL/min까지 증가함으로써 이러한 경쟁 요구는 세포 부착과 생존을 모두 촉진하기 위해 균형을 이룹니다.
<p clas...

급성 호흡곤란 증후군(ARDS)은 폐 실질의 손상 및 손상의 전파로 인해 발생하는 급성 질환으로, 폐포의 폐부종, 부적절한 가스 교환 및 그에 따른 저산소혈증을 유발합니다1. 이는 전염증성 사이토카인 방출, 호중구 모집, 독성 매개체 방출 및 조직 손상의 주기를 시작하며, 그 자체로 추가적인 염증 반응을 일으킨다2. 또한, 기도를 안정시키고 반복적인 동원/폐위(R/D)로 인한 손상을 방지하는 폐 계면활성제는 ARDS 동안 발생하는 화학적 과정에 의해 비활성화되거나 기능 장애를 일으켜 주변 실질에 추가적인 스트레스와 손상을 초래할 수 있다3. 충분한 손상이 지속되면 적절한 전신 산소 공급을 보장하기 위해 기계적 환기가 필요할 수 있습니다4. 그러나 기계적 환기는 과팽창(volutrauma) 및/또는 체액 폐색 기도의 공기-액체 계면의 R/D(atelectrauma) 동안 부과된 기계적 스트레스로 인한 폐 실질 손상으로 특징지어지는 인공호흡기 유발 폐 손상(VILI)의 가능성을 포함하여 고유한 문제와 트라우마를 부과합니다.5. atelectrauma 모델에서 공기-액체 계면(유체 폐색 세기관지에서와 같이)에 노출된 상피 세포가 경험하는 압력 구배는 투과성 유래 폐쇄 반응(POOR)을 유발할 수 있으며, 이는 손상의 POOR-GET-POORer 선순환으로 이어질 수 있습니다 6,7,8.
체외 실험은 이러한 현상에 대한 미시적 통찰력을 제공할 수 있지만, 생리학적으로 관련된 차원을 가진 미세유체 채널 환경에 대한 현재 연구는 몇 가지 문제에 직면해 있습니다9. 첫째, 세포 배양 조건을 최적화하는 것은 배지 흐름 매개변수, 배양 기간 및 기타 배양 조건이 최적의 세포층 형성을 허용하는 좁은 교차점이 존재하기 때문에 미세유체 환경에서 세포 배양 연구에 상당한 진입 장벽이 됩니다. 여기에는 미세유체 배양 채널 인클로저의 산소 불투과성 특성에 의해 부과되는 확산 제한이 포함됩니다. 이를 위해서는 매체 흐름 매개변수를 신중하게 고려해야 하는데, 낮은 유속은 세포, 특히 입구에서 가장 멀리 떨어진 세포에서 산소를 박탈할 수 있기 때문입니다. 반면에 높은 유속은 세포를 배양 채널 밖으로 밀어내거나 부적절하거나 고르지 않은 층 발달을 초래할 수 있습니다. 확산 제한은 공기-액체 계면(ALI) 배양 장치에서 폴리디메틸실록산(PDMS)과 같은 산소 투과성 물질을 사용하여 해결할 수 있습니다. 그러나, 전기 세포-기질 임피던스 센싱(ECIS) 시스템의 것과 같은 많은 종래의 미세유체 배양 채널은 제조된 인클로저(10)의 특성을 고려할 때, 본질적으로 산소-불투과성이다. 이 프로토콜은 산소 불투과성 인클로저에서 배양된 세포층을 분석하는 기술을 제공하는 것을 목표로 합니다.
배양 조건의 생존 가능성을 비교할 때, 단층의 존재, 표면 토폴로지, 밀도 및 층 두께 균일성과 같은 특정 층 특성의 관찰은 특정 배양 조건 세트에 의해 생성된 세포층이 원하는 사양을 충족하는지 여부를 결정하는 데 필요하며 실제로 실험 설계와 관련이 있습니다. 제한된 평가는 유동 어레이 내의 금 전극에서 배양된 세포의 전기 절연막에 의해 부과된 고주파 교류(AC)(임피던스)에 대한 저항에 의해 생성된 전위(전압)의 측정을 활용하는 ECIS와 같은 방법으로 수행될 수 있습니다. 세포에 가해지는 AC의 주파수를 조절함으로써, 표면 부착 강도, 밀착 접합 형성, 세포 증식 또는 밀도와 같은 세포 및 세포층의 특정 주파수 의존적 세포 특성을 표적으로 삼고 검사할 수 있다11. 그러나 이러한 간접적인 형태의 측정은 실험 초기에 해석하기가 다소 어려우며 세포층의 모든 관련 측면을 정량화하지 못할 수 있습니다. 위상차 현미경으로 세포층을 관찰하는 것만으로도 밀도와 같은 특정 특성의 특성을 알 수 있습니다. 그러나, 단층의 존재 및 층-두께 균일성과 같은 많은 관련 특성들은 명시야, 위상차 또는 형광 현미경 이미징(12)으로는 불가능한 3차원(3D) 평가를 필요로 한다.
이 연구의 목적은 단층의 이미징 기반 검증과 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용하여 세포층 균일성을 평가할 수 있는 필라멘트-액틴 염색 기술을 개발하는 것이었습니다. 필라멘트-액틴(F-actin)은 부분적으로 F-액틴이 세포막을 밀접하게 따라가는 방식으로 인해 형광단 접합체에 대한 적절한 표적으로 간주되어 전체 세포 부피의 시각적 근사치를 허용합니다(13). F-액틴을 표적으로 하는 또 다른 중요한 이점은 F-액틴의 염색이 세포가 경험하는 스트레스와 변형에 의해 부과된 세포골격 파괴 또는 변경을 시각적으로 설명하는 방식입니다. 메탄올과 같은 탈수 고정제는 세포를 평평하게 하여 세포층을 심하게 왜곡하고 그 특성을 변경하는 경향이 있기 때문에 메탄올이 없는 포름알데히드를 사용한 가교 고정은 세포와 세포층의 형태를 보존하는 데 사용되었습니다14,15.
이러한 문제를 완화하기 위한 층 평가 기술의 능력을 결정하기 위해 세포를 기존의 8웰 배양 챔버와 미세유체 채널에서 배양하여 생산된 세포층의 차이(있는 경우)를 평가했습니다. 고정 배양 웰의 경우 8개의 웰 챔버 커버유리 장치가 사용되었습니다. 미세유체 배양을 위해, 유동 어레이(채널 길이 50 mm, 폭 5 mm, 깊이 0.6 mm)는 인간 폐의 호흡 영역에 존재하는 말단 세기관지와 생리학적으로 관련된 치수를 갖는 환경에서 불멸화된 인간 폐 상피(NCI-H441) 세포를 배양하도록 최적화되었다16. 이 프로토콜은 ECIS 플로우 어레이의 배양 환경을 염두에 두고 개발되었지만, 배양된 세포층 특성 또는 배양 조건의 평가가 필요한 모든 산소 불투과성 동적 배양 환경에 적용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>A1R HD25 컨포칼 현미경 시스템</td><td>Nikon</td><td>A1R HD25</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/사양</td></tr><tr><td>ActinGreen 488 ReadyProbes 시약(AlexaFluor 488 팔로이딘)</td><td>Invitrogen</td><td>R37110</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110</td></tr><tr><td>접착 전사 테이프 이중 라이너</td><td>3M</td><td>468MP</td><td>https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/</td></tr> <tr><td>에어 타이트&nbsp; HSW Soft-Ject 일회용 주사기</td><td>Air-Tite RL5</td><td>14-817-53</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml</td></tr><tr><td>BAISDY 4 mil (0.1 mm) 두께의 Mylar 시트</td><td>BAISDY</td><td>AS022</td><td></td></tr><tr><td>https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC Branson Ultrasonics&nbsp; M 시리즈 초음파 세척 욕조</td><td>Branson 초음파</td><td>15-336-100</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 피브로넥틴, Human</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40008</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true</td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘, 마그네슘</td><td>Gibco</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133 ECIS Cultureware 일회용 전극 어레이 8 x 10 ECIS 유동 어레이</td><td>응용 생물물리학</td><td>1F8x10E PC</td><td>https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E</td></tr><tr><td>Enterprise Technology Solutions UV 살균기 캐비닛, 흰색</td><td>Enterprise Technology Solutions</td><td>50-211-1163</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079</td></tr><tr><td>Finnpipette F2 가변 용량 피펫</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642090</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090</td></tr><tr><td>Fisherbrand 50mL 이지 리더 플라스틱 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-21</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; 커버 안경: 직사각형 (#1.5)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-GP</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; 일회용 멸균 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-458</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458 Gibco RPMI 1640 배지</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093</td></tr><tr><td>Image-iT 고정용액(4% 포름알데히드, 메탄올 무함유)</td><td>Invitrogen</td><td>FB002</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002</td></tr><tr><td>ImageJ Fiji</td><td>ImageJ ImageJ</td><td>Fiji</td><td>https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>Immersion Oil F 30 cc</td><td>Nikon</td><td>MXA22168</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/accessories/immersion-oil/specifications</td></tr><tr><td>대용량 리치인 CO2&nbsp; 인큐베이터, 821 L, 광택 스테인리스강</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950</td></tr><tr><td>Laxco LMC-3000 시리즈 명시야 복합 현미경 시스템</td><td>Laxco</td><td>LMC3BF1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1</td></tr><tr><td>Masterflex 피팅, 나일론, 직선, 호스 바브 어댑터에 대한 수 Luer Lock, 1/16" ID; 25/PK</td><td>Masterflex</td><td>ZY-45505-31</td><td>https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&amp; gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 udmwaAuDHEALw_wcB</td></tr><tr><td>마이크로소프트 엑셀</td><td>마이크로소프트</td><td>0016</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547</td></tr><tr><td>National Target 모든 플라스틱 일회용 주사기</td><td>Thermo Scientific</td><td>03-377-24</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8</td></tr><tr><td>NCI-H441 인간 상피 폐 세포</td><td>미국식 배양 컬렉션(ATCC)</td><td>HTB-174</td><td>https://www.atcc.org/products/htb-174</td></tr><tr><td>NE-1600 6채널 프로그래밍 가능한 주사기 펌프</td><td>New Era 펌프 시스템</td><td>NE-1600</td><td>https://www.syringepump.com/NE-16001800.php</td></tr><tr><td>NIS 요소 AR</td><td>Nikon</td><td>NIS 요소 AR</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research</td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes 시약(Hoechst 33342)</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 챔버 커버 글라스</td><td>Thermo Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361 Parafilm M 래핑 필름</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37441</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441</td></tr><tr><td>PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/ 암 루어 입구 x 암 루어 브랜치</td><td>PendoTech</td><td>ZY-19406-49</td><td>https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649</td></tr><tr><td>인산염 완충 용액(PBS), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Gibco</td><td>A3890401</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401</td></tr><tr><td>Reynolds 알루미늄 랩 호일</td><td>Reynolds</td><td>458742928317</td><td>https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Millipore Sigma (Sigma Aldrich)</td><td>47036</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036</td></tr><tr><td>SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>S36917-5X2ML</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML</td></tr><tr><td>Thermo Scientific 1300 시리즈 클래스 II, 유형 A2 생물 안전 캐비닛 패키지</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-100-752PM</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood Tygon Transfer Tubing, BioPharm 백금 경화 실리콘, 1/16" ID x 1/8" OD; 50</td>피트 <td>콜-파머</td><td>EW-95702-01</td><td>https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01</td></tr></tbody></table>

생리학적 크기의 미세유체 배양 장치에서 상피 세포 단층의 준비 및 구조 평가

Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device

시험관 내 미세유체 실험은 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 및 인공호흡기 유발 폐 손상(VILI)과 같은 상태에서 발생하는 미세생리학적 현상에 대한 많은 통찰력을 밝힐 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 인간 폐의 말단 세기관지와 생리학적으로 관련된 치수를 가진 미세유체 채널에 대한 연구는 현재 몇 가지 문제에 직면해 있으며, 특히 주어진 배양 환경 내에서 배지 유속을 포함한 적절한 세포 배양 조건을 설정하는 데 어려움이 있습니다. 제시된 프로토콜은 인간 폐의 말단 세기관지와 생리학적으로 관련된 치수를 갖는 산소 불투과성 미세유체 채널에서 배양된 NCI-H441 인간 폐 상피 세포의 구조를 평가하기 위한 이미지 기반 접근법을 설명합니다. 팔로이딘 기반 필라멘트-액틴 염색을 사용하여 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 세포의 세포골격 구조를 밝혀 개별 세포와 층상 세포를 시각화할 수 있습니다. 후속 정량화는 사용되는 세포 배양 조건이 추가 실험에 적합한 균일한 단층을 생성하는지 여부를 결정합니다. 이 프로토콜은 미세유체 채널과 기존의 고정 웰 환경에서 세포 배양 및 층 평가 방법을 설명합니다. 여기에는 채널 구성, 세포 배양 및 필수 조건, 고정, 투과화 및 염색, 컨포칼 현미경 이미징, 이미지 처리 및 데이터 분석이 포함됩니다.

제시된 방법은 미세유체 배양 채널에서 배양된 상피 세포층의 시각화를 가능하게 하고 검증을 위해 전통적인 고정 웰 세포 배양 환경에서의 시연을 사용합니다. 획득한 이미지는 품질, 신호 강도 및 세포 표적 특이성의 스펙트럼에 존재합니다. 성공적인 이미지는 높은 대비를 보여 주므로 후속 통계 평가를 위해 이미지 분석 및 데이터 정량화가 가능합니다. 실패한 이미지는 흐리거나, 흐릿하거나, 흐릿하거나, 주관적 또는 정량적 평가에 사용할 수 없습니다. 일부 이미지는 주관적인 층 특성 결정에 적합할 수 있지만 정량 분석에는 여전히 품질이 충분하지 않을 수 있습니다. 따라서 프로토콜을 따르는 정도와 주의는 통계 분석을 위한 데이터 소스 역할을 하는 주어진 이미지의 적합성에 직접적인 영향을 미칩니다.
그림 4는 미세유체 동적 배양 환경의 맥락에서 이 기술의 성공적인 사용을 나타내며 두 개의 미세유체 장치의 입구와 출구에서 이미지 획득을 보여줍...

제시된 프로토콜은 미세유체 동적 배양 채널과 기존의 고정 웰 정적 배양 챔버에서 부착 세포층 구조를 시각화하기 위해 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용한 팔로이딘 기반 필라멘트-액틴 염색 기술의 개발 및 사용을 설명합니다. 이 접근법은 세포층 밀도, 단층 형성 및 층 두께 균일성을 평가하는 데 도움이 됩니다.

In vitro microfluidic experimentation holds great potential to reveal many insights into the microphysiological phenomena occurring in conditions such as ...

이 프로토콜은 세포 배양 실험의 진입 장벽을 낮추고 연구자가 동적 미세유체 환경에서 배양된 부착 세포 단층을 평가하고 특성화할 수 있도록 합니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 단층 특성의 정성적 및 정량적 평가를 통해 추가 단층 의존적 실험의 기초가 될 수 있다는 것입니다. 이 방법은 시험관 내에서 폐포 상피의 요약을 가능하게 하여 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 및 인공호흡기 유발 폐 손상(VILI) 동안의 동적 반응을 탐색할 수 있습니다.시작하려면 단일 채널 플로우 어레이를 가져옵니다. 초음파 수조에서 커버 유리 표면을 청소하십시오. 커버 유리를 실온에서 5분 동안 poly-d-lysine에 담그십시오.그런 다음 섭씨 60도에서 30 분 동안 건조시킵니다. 다음으로 Mylar 스페이서에 양면 접착제를 부착합니다. 원고에 기술된 바와 같이 커버 글라스에 레이저로 절단하고, 채널 컷아웃이 정확하게 정렬되도록 한다.직사각형 커버 유리를 맨 아래 접착 스트립에 부착합니다. 껍질을 벗긴 접착 용지를 사용하여 아직 노출된 접착제 부분을 덮습니다. 조립이 완료되면 시공에 단단하고 동일한 압력을 가하십시오.탈 이온수로 채워진 주사기를 사용하여 채널을 헹굽니다. 채널 인클로저를 자외선 살균기로 30분 동안 소독합니다. 멸균 기술을 사용하여 PBS에서 준비된 인간 피브로넥틴 용액으로 채널을 처리하고 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 배양합니다.멸균 층류 후드에서 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 NCI H441 세포 현탁액을 준비합니다. 이 셀 현탁액 0.25ml를 사용하여 채널과 포트의 일부를 채웁니다. 명시야 현미경을 사용하여 세포가 채널 내에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다.미디어 저장소와 스톱콕을 채널에 추가합니다. 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 채널 배양을 시작합니다. 프로그래밍 가능한 주사기 펌프를 사용하여 사용한 배지를 채널에서 빼내고 새 매체를 채널 주입구에 부착된 멸균 매체 저장소에서 채널로 끌어냅니다.화학 흄 후드에서 4 % 포름 알데히드 용액을 DPBS로 희석하여 1 % 용액을 만들고 적절하게 라벨이 붙은 튜브에 보관하십시오. 비슷한 방식으로 2 % 포름 알데히드 용액을 준비하십시오. 포름알데히드 용액을 적절하게 라벨이 붙은 5밀리리터 주사기로 옮깁니다.세척 단계에 사용할 별도의 20밀리리터 주사기에 20밀리리터의 DPBS를 넣습니다. 다음으로, 배양 장치로부터 미세유체 채널을 분리하고, 이를 케미컬 흄 후드에 고정한다. 고정 및 염색 장치를 조립하려면 호스 바브 어댑터에 대한 수 루어 잠금 장치를 통해 3방향 스톱콕의 측면 포트에 이송 튜브 세그먼트를 부착합니다.그런 다음 스톱콕을 플로우 어레이의 입구 포트에 연결합니다. 동일한 유형의 호스 바브 어댑터를 사용하여 기존 스톱콕의 출구 포트에 이송 튜브의 다른 부분을 부착합니다. 마지막으로, 현재 폐기물 라인으로 지정된 두 이송 튜브의 자유 끝을 화학적 및 생물학적 위험에 적합한 폐기물 용기에 고정합니다.스톱콕이 플로우 어레이 입구 포트를 막고 있는지 확인하고 DPBS로 폐기물 라인을 세척합니다. 그런 다음 마개를 돌려 폐기물 라인을 차단하고 2 밀리리터의 DPBS로 세포를 천천히 씻으십시오. 채널을 통해 1% 고정액 2밀리리터를 천천히 밀어 넣습니다.5분 동안 그대로 두었다가 2% 고정제로 반복합니다. 그런 다음 이전에 입증된 바와 같이 신선한 DPBS로 세포를 3회 세척합니다. 원고에 설명된 대로 0.1% 사포닌 용액을 준비합니다.세척 단계에 사용하기 위해 20밀리리터 주사기에 추가 DPBS를 넣습니다. 알루미늄 호일로 튜브를 덮으십시오. 필라멘트 액틴 염색 팔로이딘 시약과 핵 염색 Hoechst 시약을 0.1% 사포닌 용액에 추가합니다.그런 다음 용액을 호일로 덮인 주사기로 옮깁니다. 소량의 투과화 및 염색 용액으로 폐기물 라인을 세척하십시오. 그런 다음 2 밀리리터의 용액을 미세 유체 채널에 주입합니다.빛을 차단하기 위해 알루미늄 호일로 채널을 덮으십시오. 30분 후, 채널을 부드럽게 건조시키기 전에 각각 5분 동안 2밀리리터의 DPBS로 투과화 용액을 씻어냅니다. 마이크로피펫을 사용하여 바닥면을 완전히 덮을 수 있도록 미세유체 채널에 최소한의 소프트 세트 페이드 방지 마운팅제를 도입합니다.그런 다음 채널 끝을 밀봉하십시오. 명시야 현미경을 사용하여 채널이 빛으로부터 보호되도록 용기에 저장하기 전에 세포층의 무결성을 신속하게 확인합니다. 원하는 이미지 매개변수와 조건이 충족될 때까지 참조 스캔 및 z-스택을 수행하여 이미징 위치를 테스트합니다.플로우 어레이 베이스 플레이트를 기준으로 사용하여 채널 길이를 따라 다양한 위치에 z-스택을 구성합니다. 마지막으로 단면 데이터, 깊이 맵 데이터 및 기타 관련 특성을 분석하여 세포층 속성을 평가합니다. 이 기술의 성공적인 사용은 입구와 출구에서 최소 1cm 떨어진 이미지 획득을 통해 미세유체 동적 배양 환경에서 입증됩니다.대표적인 배양 기간 실험에서, 세포를 24시간 동안 배양하였을 때 성공적인 단층 생산이 관찰되었다. 그러나, 48시간 동안 배양하였을 때, 바람직하지 않은 다층 형성이 나타났다. 5개의 미세유체 채널 이미징 위치 각각에서 수집된 데이터는 또한 증가된 배양 기간과 증가된 단면적 사이의 관계를 보여주며, 이는 배양 후 48시간 이내에 고르지 않은 층 형성 또는 과증식이 발생함을 시사합니다.24시간 동안 배양된 미세유체 채널 내 중앙 위치의 깊이 맵이 얻어졌으며, 이는 층 특성의 정성적 평가에 유용하다. 이 프로토콜의 가장 중요한 세 가지 측면은 적절한 채널 구성, 정확한 배양 및 배지 흐름 조건, 고정 및 염색 장치의 신중한 사용입니다. 이 절차에 따라, 전기 세포-기질 임피던스 감지, ECIS 또는 경상 피 전기 저항 (TEER)과 같은 생성 된 세포 단층의 실험적 생존성을 검증하기 위해 다른 방법을 병렬로 사용할 수 있습니다.

preparation-structural-evaluation-epithelial-cell-monolayers

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 세포 캡처 및 문화를 활성화할 수 있습니다 microfluidic 장치의 제조를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는 이러한 microfluidic 채널 내에서 홈과 같은 패턴 microstructures는 셀 수있는 부두 내에서 낮은 전단 응력 영역을 작성하는 데 사용됩니다.

세포 행동 유학을위한 그루브 패턴 Microfluidic 장치

이 프로토콜은 상피 세포와 세균의 동시와 언어 문화 microfluidic 공동 문화 모델을 설명합니다. 이 모델은 putative probiotic 박테리아 변종의 효과를 pathogenesis에 다른 수용성 분자 신호의 역할을 조사뿐만 아니라 화면을 사용할 수 있습니다.

Microfluidic 가용성식이 중재 신호의 상호 작용을 조사하는 상피 세포 박테리아의 공동 문화

이 프로토콜에서는, 우리는 기술의 기반이되는 수직 전이 게시물의 마이크로 액추에이터 어레이의 제조 방법 및이 기본 기술이 모두 2 차원 입체 문화에 높은 처리량 기계 역동적인 세포 배양을 실시하도록 수정할 수 있습니다을 증명 패러다임.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

이 원고는 3 차원 (3D)의 균일 한 배열 세포 외 기질에 둘러싸여 정의 형상의 상피 조직을 설계 할 수있는 소프트 리소그래피 기반 기술을 설명합니다. 이 방법은 세포 형태 및 실험 문맥 다양한 의무가 있고 동일한 복제의 높은 처리량의 선별을 허용한다.

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

3차원(3D) 셀룰러 시스템은 유기발생을 조사하기 위한 관련 모델이다. 담즙 낭종 생산 및 특성화를 위한 하이드로겔 기반 방법이 제안됩니다. 이 프로토콜은 낭종 형성 효율, 크기를 평가하고 기능을 테스트하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법으로 3D 특성화의 장벽을 해명합니다.

기능성 및 편광 담즙 상피 낭종의 생성 및 정량적 특성화

여기에서, 우리는 장 장벽 기능, 투과성 및 수송을 연구하기 위한 인간 오가노이드 유래 장 상피 단층의 제조를 기술한다. 오가노이드가 외부 자극에 대한 원래의 상피 조직 반응을 나타내기 때문에, 이들 모델은 세포주의 확장성과 일차 조직의 관련성 및 복잡성의 이점을 결합한다.

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

현재 프로토콜은 1차 조직(피부, 폐포, 기도 및 장)의 전층 장기 온칩 배양의 성공적인 확립 및 성숙을 위한 Open-Top Organ-Chip의 기능과 필수 배양 양식을 설명하여 시험관 내에서 인간 상피/중간엽 및 혈관 틈새 인터페이스의 다양한 기능적 측면을 조사할 수 있는 기회를 제공합니다.

Reconspartuting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip (개방형 장기 칩에서 인간 상피 조직의 세포 구조 및 기능 재구성)

이 보고서는 혈액-뇌 장벽 모델 구축을 위한 μSiM 플랫폼의 조립, 세포 배양 및 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다.

혈액-뇌 장벽 모델링을 위한 MicroSiM(μSiM) 장벽 조직 플랫폼 사용

이 프로토콜은 개방형 웰 형식과 유체 흐름 기능을 통합하는 재구성 가능한 멤브레인 기반 세포 배양 플랫폼을 설명합니다. 이 플랫폼은 표준 프로토콜과 호환되며 오픈 웰과 미세유체 배양 모드 간의 가역적 전환이 가능하여 엔지니어링 및 생명과학 실험실의 요구 사항을 모두 수용할 수 있습니다.

정적 장벽 조직 모델을 동적 미세생리학 시스템으로 변환

여기에서는 나노섬유막 기반 2층 시스템에서 섬유아세포로 배양된 상피 세포가 어떻게 막에 안정적으로 부착하고 성장할 수 있는지 보여줍니다.

나노섬유막(Nanofibrous membranes)을 이용한 상피세포의 3차원 공동배양 모듈 구축

여기에서는 상피 조직 항상성의 전기기계적 조절을 연구하기 위해 고유한 2층 미세유체 장치를 제작하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 장치는 조직 평면에 수직인 정적 생리학적 전류를 적용하여 세포 간 접착, 증식 및 압출에 영향을 미칩니다. 살아있는 세포 이미징 및 기계적 응력 측정은 이러한 과정의 메커니즘을 보여줍니다.

2층 미세유체 장치를 이용한 조직 항상성의 전기기계적 제어 공개

배우세요 미세유체 배양 장치에서 상피 세포 단층의 준비 및 구조 평가 방법을. 공초점 레이저 주사 현미경을 활용한 정량적 분석으로 ARDS 및 VILI 연구에 활용할 수 있습니다.

생리학적 크기의 미세유체 배양 장치에서 상피 세포 단층의 준비 및 구조 평가

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