Name: 성인 아프리카 청록색 Killifish의 뇌 조직에서 핵의 부드러운 분리, 노화 연구를위한 자연적으로 수명이 짧은 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 배우세요 아프리카 청록색 킬리피시 뇌 조직에서 핵을 부드럽게 분리하는 최적화된 프로토콜을. 단일세포 수준에서 노화 메커니즘을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

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일부 패널은 BioRender.com 로 생성되었습니다. 우리 실험실에서의 이 연구는 NIA T32 AG052374 BT에 대한 박사후 교육 보조금, 노화 뇌의 가소성을 위한 Simons Collaboration의 일환으로 Simons Foundation의 보조금, Navigage Foundation의 파일럿 보조금 및 BAB에 대한 Hanson-Thorell Family 상의 지원을 받았습니다.

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에 제시된 프로토콜은 킬리피쉬 뇌에서 고품질 핵을 재현 가능하게 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 킬리피쉬 뇌에 적용된 전형적인 포유류 기반 뇌핵 분리 프로토콜이 지속적으로 우리 손의 핵 품질을 저하시켰기 때문에 킬리피쉬 뇌를 위해 특별히 설계되어야 했습니다. 우리는 이것이 포유류의 뇌 세포 용해에 필요한 가혹한 조건에 반응하여 용해되고 응집되는 포유류에 비해 킬리 피쉬 뇌의 상대적 미엘린 함량이 낮기 때문이라고 생각합니다. 이 프로토콜은 척추 동물의 뇌 노화의 비용 및 시간 효율적인 모델에서 단일 세포 수준에서 뇌 노화의 탐구를 용이하게하기 때문에 노화 및 킬리 피쉬 분야의 발전입니다. 
이 프로토콜은 신선 또는 냉동 샘플에 강력하지만 신선 또는 냉동 조직을 사용할 때 다운스트림 응용 분야를 고려해야 합니다. 냉동 조직은 샘플을 수집하는 동안 몇 달 동안 수집하고 보관할 수 있기 때문에 종종 편리합니다. 이러한 샘플은 snRNA-seq와 같은 애플리케이션에 안전하게 사용될 수 있습니다. 그러나 샘플을 동결하면 핵 구조가 파괴되어 ATAC-seq21로 염색질 풍경을 정확하게 측정 할 수 있습니다. 따라서 벌크 ATAC-seq 또는 snATAC-seq와 같은 다운스트림 애플리케이션의 경우 냉동 뇌 대신 새로 해부된 뇌를 사용하는 것이 좋습니다. 또한 뇌 균질화 이후의 모든 단계를 병렬로 수행 할 수 있기 때문에이 프로토콜은 합리적인 시간 내에 여러 샘플을 실행할 수 있으므로 얼음에서의 장기간 배양으로 인한 RNA 분해를 제한합니다.
또한, 핵 추출을 수행하는 후 신선한 (몇 시간 이내에) 완충액을 준비하는 것이 필수적입니다. 우리는 BSA뿐만 아니라 세제도 프로토콜을 시작하기 직 전에 버퍼에 추가되어야 한다는 것을 발견했습니다. 염(PBS, NaCl 등)만을 포함하는 완충액은 농축액으로 만들어 필터 멸균(0.22μm)하여 실온에서 무기한 보관할 수 있다. BSA 스톡 용액은 핵 추출 후 며칠 이내에 4°C에서 제조, 멸균 및 저장될 수 있지만(분말로 제조된 경우) 프로토콜을 수행하기 직전에 항상 이 프로토콜에 사용되는 완충액에 첨가해야 합니다. 그러나 프로토콜 당일에 BSA 솔루션을 준비하는 것이 좋습니다. 타사의 미리 만들어진 BSA 용액을 사용하는 경우, 개봉하지 않은 새 병을 사용하는 것이 좋습니다. 새로운 BSA를 사용하면 일반적으로 핵 준비에서 파편 함량이 낮아집니다.
신선 또는 냉동 샘플을 입력으로 사용하든 핵 분리 후 핵 품질을 평가하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 과용해를 방지하기 위해 특별히 설계되었지만 이것이 핵 품질 손실의 가장 일반적인 원인입니다. 과잉 용해는 용해 완충액에서 너무 많은 시간을 소비하거나, 표준 보어 피펫 팁을 사용한 과도한 피펫팅과 같은 핵의 지나치게 거친 취급 또는 핵 분리와 다운스트림 적용 사이에 소요되는 과도한 시간(>1시간)으로 인해 발생할 수 있습니다. 과도하게 용해된 핵은 종종 핵 주변부를 손상시켜 DNA를 누출시키고 응집을 유발합니다(그림 2B). 이것은 증가된 다수의 멀티플릿으로 이어질 것이고 다운스트림 응용, 특히 snRNA-seq를 방해할 배경 핵산에 기여할 것이다. 두 특성 모두 핵 분리 후 현미경으로 평가할 수 있습니다. 과도한 핵 응집이 관찰되면 과다 용해 가능성을 줄이기 위해 용해 단계 배양을 단축하는 것이 좋습니다. 핵 싱글릿을 증가시키기 위한 대안적인 방법으로서, 형광-보조 세포 분류 (FACS)가 이 프로토콜의 다운스트림 싱글렛에 대해 농축하기 위해 사용될 수 있다. 그러나 동결된 조직에서 이미 깨지기 쉬운 핵으로 작업할 때 분류 중에 발생하는 전단 응력으로 인해 핵 파열이 증가하여 주변 RNA/DNA가 증가할 수 있습니다. 또한 여러 샘플을 처리할 때 핵에 대한 FACS 수율 정렬을 실행하는 데 필요한 시간은 다른 샘플이 분류되는 동안 모든 핵 샘플이 몇 시간 동안 얼음 위에 남아 있어야 한다는 점에 주목합니다. 따라서 FACS 접근법과 병행하여 여러 샘플을 처리 할 때 대기 시간이 증가하면 전반적인 핵 품질이 저하되고 RNA 분해 위험이 증가 할 수 있습니다. 따라서 FACS가 이중 속도 감소를 원하는 경우 수율 분류 후 파편 함량을 다시 확인하고 잠재적 인 경고로 단일 세포 RNA-seq 응용 프로그램에 대해 RNA 품질 저하 가능성을 고려하는 것이 좋습니다. 
핵 수와 일중항 비율의 정확한 추정치는 거의 모든 다운스트림 "omics" 응용 분야에 필수적이며 가장 중요합니다. 크기별로 핵을 쉽게 게이트하고 계수할 수 있는 능력으로 인해 유세포분석은 우리가 평가한 가장 정확한 핵 계수 방법입니다. 또는 Invitrogen의 Countess 2 FL 자동 세포 카운터 또는 DeNovix CellDrop 자동 세포 카운터와 같은 세포 카운터를 사용하여 핵을 정량화할 수 있습니다. 참고로, Invitrogen의 Countess 2 FL 자동 세포 카운터와 DeNovix는 파편을 핵으로 계산하여 핵 수를 과대평가하는 경향이 있으며, 이는 수동 크기 게이팅이 필요할 수 있음을 의미합니다. 또한 유세포 분석기를 사용하면 핵의 순도를 쉽게 평가할 수 있습니다. 단중항 대 다중 핵의 상대적 비율을 현미경으로는 어려운 정량적 방식으로 식별할 수 있습니다. 이는 snRNA-seq 및 snATAC-seq에 매우 중요한데, 이는 이러한 프로토콜이 다운스트림 분석에서 제외되어야 하는 다중 샘플의 잉여로 어려움을 겪을 것이기 때문입니다. 다중 항목 외에도 "파편"(단편화 된 핵, 세포 파편)의 상대적 비율은 유세포 분석으로 정량화 할 수 있으며,이 물질은 종종 배경 신호 및 손상된 단일 핵 "omics"데이터에 기여할 수있는 오염 핵산을 포함하기 때문에 상대적으로 낮아야합니다. 
이전에 기술된 핵 분리 프로토콜과 마찬가지로, 원래 조직에서 세포 유형의 비율은 핵 준비19에서 충실하게 요약되지 않을 수 있으므로 주의해서 해석해야 합니다. 참고로, 모든 teleosts와 마찬가지로, 아프리카 청록색 킬리 피쉬는 핵 적혈구를 가지고 있으며, 이는 또한 핵 준비에서 나타날 것으로 예상됩니다. 이러한 핵은 헤모글로빈 유전자의 더 높은 발현/접근성에 의해 snRNA-seq 및 snATAC-seq 데이터 세트에서 식별될 수 있으며 원하는 경우 계산적으로 제외될 수 있습니다.

척추동물의 뇌 노화 메커니즘을 이해하는 것은 알츠하이머 및 치매와 같은 노화 관련 신경퇴행성 질환을 해결하는 데중요합니다1. 아프리카 청록색 킬리 피쉬 (Nothobranchus furzeri)는 포로 상태에서 사육 할 수있는 가장 수명이 짧은 척추 동물이며 짧은 수명과 연령 관련인지 장애로 인해 우수한 뇌 노화 모델 2,3,4,5입니다. 최근 단일 핵 RNA-seq (snRNA-seq) 및 시퀀싱을 통한 트랜스포자제 접근 가능 염색질에 대한 단일 핵 분석 (snATAC-seq)과 같은 단일 세포 "오믹스"기술의 출현으로 연구자들은 전례없는 해상도 6,7,8로 노화 된 뇌를 조사 할 수있었습니다. 이러한 방법은 뉴런과 같은 뇌 세포의 회복이 종종 6,7,8,9,10을 분리하기에는 너무 어렵 기 때문에 핵 분리에 의존합니다. 그러나, 대부분의 공개된 핵 분리 프로토콜은 포유동물 모델 유기체 11,12,13,14,15에 대해 최적화된다. 따라서, 현재 노화 연구2 분야에서 떠오르는 새로운 모델 유기체로서 킬리피쉬의 뇌핵을 분리하는 데 대한 충족되지 않은 요구가 있기 때문에, 이 프로토콜의 목표는 동결된 뇌 킬리피쉬 조직으로부터 고품질 핵을 분리하는 방법을 확립하는 것이다.
여기에서는 일반적으로 사용 가능한 재료를 사용하여 킬리피쉬 뇌에서 고품질 핵을 분리하는 능률적이고 강력한 워크플로가 설정됩니다. 이 프로토콜은 아프리카 청록색 킬리 피쉬의 낮은 미엘린 함량 뇌, 냉동 조직의 취약성 및 시퀀싱 관련 응용 분야의 주변 파편 함량을 줄여야 할 필요성을 수용하기 위해 마우스 뇌에 대한 10x Genomics 프로토콜에서 수정되었습니다16. 실제로, 포유류의 뇌 조직17,18에 대해 이전에 최적화 된 프로토콜은 냉동 킬리 피쉬 뇌에 사용될 때 핵 품질 저하 (즉, 과잉 용해) 및 / 또는 높은 파편 함량을 초래하여 미세 유체 공학을 사용하는 단일 핵 RNA-seq에 대한 권장 사항에 따라 snRNA-seq와 함께 사용하기에 적합하지 않습니다 (보충 그림 1).
핵 분리 외에도 현미경 및 유세포 분석을 통해 핵 품질과 수율을 평가하는 방법을 보여줍니다. 이 문서에서는 최적 결과와 최적이 아닌 결과의 예를 제공하고 문제 해결에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 냉동 킬리피쉬 뇌를 위해 설계 및 최적화되었지만 갓 해부된 킬리피쉬 샘플에 대한 주요 수정 없이 사용할 수도 있습니다. 이 방법을 사용하여 분리된 킬리피쉬 뇌핵은 다운스트림 애플리케이션으로 단일 핵 RNA-seq(snRNA-seq)에 사용하도록 최적화되었지만 snATAC-seq 및 벌크 ATAC-seq에도 사용할 수 있어야 합니다.

<table><tbody><tr><td>0.4% Trypan Blue 솔루션</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Bioland</td><td>PBS01-03</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 코니클 원심분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 티슈 그라인더</td><td>Kimble</td><td>885300-0002</td><td>Dounce Homogenizer</td></tr><tr><td>5 mL 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>5M 염화나트륨, 분자생물학 등급</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS 헹굼 용액</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>이는 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (유세포 분석에 사용)</td></tr><tr><td>잔해물 제거 용액</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-398</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBInd Tube</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Echo Revolve microscope (60x objective 장착)</td><td>Echo</td><td>NA</td><td>카탈로그 번호가 없습니다. 핵을 육안으로 검사하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Falcon 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브, 5 mL</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td>FACS 튜브</td></tr><tr><td>FLOWMI 세포 여과기, 40 &mu; M</td><td>SP Bel-Art</td><td>136800040</td> 프로토콜 염산 Sigma-Aldrich 258146-500 mL에서 <td>온팁 필터로 지칭</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>TRIS pH를 8.0에서 7.4로 낮추는</td></tr><tr><td>데 사용 Leica EZ4 해부 범위</td><td>Leica</td><td>NA</td><td>카탈로그 번호</td></tr><tr><td>없음 MACS BSA 재고 솔루션</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130091376</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (70 &mu; M)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 유세포 분석기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>NA</td><td>카탈로그 번호 없음</td></tr><tr><td>염화마그네슘, 육수화물, 분자 생물학 등급(분말)</td><td>Millipore</td><td>442611</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 16R 원심분리기</td><td>ThermoScientific</td><td>75003629</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glass</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Micro Slides Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 대체</td><td>Roche</td><td>(Roche) 11332473001/ 카탈로그: 983739 P 코드: -102368106 (Sigma Aldrich)</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Surfact-Amps 세제 용액</td><td>ThermoFisher</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free HyPure 분자 생물학 등급 Water</td><td>HyClone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>NxGen RNase 억제제 (50,000 U)</td> <td>Lucigen</td><td>30281-2</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide 용액</td><td>MBL</td><td>FP00010020</td><td></td></tr><tr><td>PureBlu DAPI 핵 염색 염료</td><td>Biorad</td><td>1351303</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 피펫 팁 (초저 잔류, 여과) 10 &micro; L, 20 &마이크로; L, 200 &마이크로; L 및 1000 &micro; L 사이즈</td><td>USA Scientific</td><td>#1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S (MS 222)</td><td>Syndel</td><td>Tricaine10G</td><td>Syndel은 제약 등급 Tricaine</td></tr><tr><td>TRIS, 1 M, pH 8.0</td><td>VWR</td><td>E199-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>와이드 보어 피펫 팁</td><td>Axygen</td><td>T-1005-WB-C</td><td></td></tr>에 대한 FDA 승인 제공업체입니다</tbody></table>.

성인 아프리카 청록색 killifish의 뇌 조직에서 핵의 부드러운 분리, 노화 연구를위한 자연적으로 수명이 짧은 모델

Gentle Isolation of Nuclei from the Brain Tissue of Adult African Turquoise Killifish, a Naturally Short-Lived Model for Aging Research

척추 동물 시스템에서 단일 세포 분해능으로 뇌 노화를 연구하는 것은 비용, 시간 및 기술적 제약으로 인해 여전히 어렵습니다. 여기에서는 자연적으로 수명이 짧은 척추동물 아프리카 청록색 킬리피시 Nothobranchius furzeri의 뇌에서 단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq) 라이브러리를 생성하는 프로토콜을 시연합니다. 아프리카 청록색 킬리 피쉬는 4-6 개월의 수명을 가지고 있으며 비용 효율적인 방식으로 수용 할 수 있으므로 척추 동물의 뇌 노화를 연구하는 데 드는 비용과 시간 장벽을 줄일 수 있습니다. 그러나 젊은 물고기와 노인 물고기의 뇌에서 다운 스트림 단일 세포 실험에 충분한 품질의 핵을 분리하기 위해서는 맞춤형 프로토콜이 필요합니다. 여기에서는 고품질 단일 핵 오믹 라이브러리 생성의 중요한 단계인 성인 아프리카 청록색 킬리피쉬의 뇌에서 고품질 핵을 분리하기 위한 경험적으로 최적화된 프로토콜을 시연합니다. 또한, 우리는 오염 배경 RNA를 줄이는 단계가 세포 유형을 명확하게 구별하는 데 중요하다는 것을 보여줍니다. 요약하면,이 프로토콜은 비 전통적인 척추 동물 모델 유기체에서 뇌 노화를 연구 할 가능성을 보여줍니다.

여기에 설명된 킬리피쉬 뇌핵 분리 프로토콜은 킬리피쉬에 대해 특별히 최적화되어 있으며 그림 1에 요약되어 있습니다. 핵 추출 외에도 프로토콜은 분리된 핵의 품질과 양을 평가하는 다양한 방법을 자세히 설명합니다. 그림 2는 광학 현미경으로 평가한 건강한(그림 2A) 및 건강하지 않은(그림 2B) 핵의 예를 보여줍니다. 다운스트림 분석에 적합한 건강한 핵(그림 2A)은 손상되지 않은 막을 가진 일중항 핵으로 존재합니다. 그림 2B에 도시된 바와 같이, 이 프로토콜(및 다른 핵 분리 프로토콜)의 가장 일반적인 실패 모드는 손상된 핵막을 특징으로 하는 과용해된 핵의 생성이다. 이것은 종종 핵 응집으로 이어지고 파열된 핵에서 핵산의 누출로 인해 다운스트림 응용 분야의 배경 신호에 기여할 수 있습니다. 과도한 응집이 관찰되면 도스 단계에서 더 부드럽게 하거나 용해 완충액에서 배양 시간을 줄이는 것이 좋습니다.
이 프로토콜은 유세포 분석을 사용하여 분리 된 핵의 수를 정량화하고 샘플에서 다중 핵의 상대적 비율을 결정합니다. 또한 유세포분석을 사용하여 핵 샘플의 다운스트림 분석에 해로운 영향을 미칠 수 있는 오염 파편, 종종 파열된 핵 조각 및 기타 세포 파편의 상대적 함량을 평가할 수 있습니다. 대표적인 흐름 데이터는 그림 3에서 볼 수 있습니다. 고품질 핵 분리 절차는 1) 작은 파편 분획, 2) 단일 핵 대 다중 핵의 높은 분율 (핵 분획의 80 % &gt;)을 생성합니다. 핵산을 염색하는 PI 염색을 사용하면 일중항 핵을 파편 및 다중 핵에서 분리할 수 있습니다. 그림 3A 는 파편으로 오염된 제제의 예인 반면, 그림 3B 는 고품질 실험의 예입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig01.jpg"> 그림 1: 킬리피쉬 뇌핵 분리 워크플로우. 냉동 또는 신선한 킬리피쉬 뇌에서 핵을 분리하기 위한 실험 워크플로. 일단 분리되고 평가되면, 핵은 다양한 다운스트림 "오믹스" 분석에 사용될 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig02.jpg"> 그림 2: 현미경을 통한 핵 품질 평가. 핵을 0.4% 트리판 블루 용액에서 1:1로 혼합하고 60x에서 명시야 이미징으로 에코 회전 현미경으로 시각화했습니다. (A) 고품질 핵의 예. 핵은 일중항으로 존재하고 핵막은 손상되지 않습니다. (B) 품질이 좋지 않은 핵의 예. 핵막이 손상되고 핵이 이중선으로 뭉쳐지고 있는데, 이는 맨 위 핵의 상단에서 누출되는 것을 볼 수 있는 끈적끈적한 DNA의 누출로 인한 것 같습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig03.jpg"> 그림 3: 유세포분석에 의한 핵 정량화 및 순도 평가. 핵 샘플을 PI의 1:100 희석으로 염색하고 유세포분석기에서 실행하였다. 핵은 (A,B)의 오른쪽 상단 사분면에 단일항 및 다중 형태로 존재하며, 단일선은 사건의 가장 낮은 구름으로 존재하고 이중선, 삼중항 등이 오름차순으로 이어집니다. 파편은 가장 왼쪽 두 사분면의 이벤트로 표시됩니다. (A) 파편 제거 단계가 생략되고 파편이 사건의 &gt;40%를 차지하는 저품질 핵 준비의 예. (b) 파편 제거 단계가 포함된 고품질 핵 샘플의 예. 이 예에서 파편은 유세포 분석기에 의해 등록 된 모든 이벤트의 &lt;10 %를 차지합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>샘플 유형(브레인 2개)</td>
			<td>평균 수율 (4 개의 독립적 인 준비)</td>
		</tr><tr><td>5주 남성 두뇌</td>
			<td>3.59 ± 1.76 x 105</td>
		</tr><tr><td>10 주 남성 두뇌</td>
			<td>6.41 ± 1.33 x 105</td>
		</tr><tr><td>15 주 남성 두뇌</td>
			<td>14.59 ± 2.05 x 105</td>
		</tr><tr><td>5주 여성 두뇌</td>
			<td>2.54 ± 0.75 x 105</td>
		</tr><tr><td>10 주 여성 두뇌</td>
			<td>4.66 ± 1.29 x 105</td>
		</tr><tr><td>15주 여성 두뇌</td>
			<td>7.95 ± 3.51 x 105</td>
		</tr></tbody></table>표 1 : 성별과 연령에 따른 아프리카 청록색 킬리 피쉬의 두 뇌에서 평균 기대 수확량. 105 개의 핵으로 표현된 평균 수율은 각 범주에서 4개의 독립적인 핵 제제에 대한 평균의 표준 오차±.
보충 그림 1: 표준 프로토콜을 사용한 핵 분리 품질과 냉동 킬리피쉬 뇌에 대한 최적화된 프로토콜 비교. (A) 현미경에 의한 핵 품질 평가. 핵을 0.4% Trypan Blue 용액에서 1:1로 혼합하고 60x에서 명시야 이미징으로 현미경으로 시각화했습니다. (B) 유세포분석에 의한 핵 및 파편 부하 정량화. 핵 샘플을 PI의 1:100 희석으로 염색하고 유세포분석기에서 실행하였다. (C) 다양한 벤치마킹 프로토콜을 사용한 현미경 및 유세포 분석에 의한 품질 평가 메트릭 요약. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/2022-07-06_FIgure_S1_v3.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: 파편 제거 단계의 개략도 . (A) 파편 제거 계획 전 원심 분리 층. (B) 원심분리 후 상청액 제거 계획. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/2022-07-06_Figure_S2_JOVE_Revision.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서 우리는 단일 핵 RNA 시퀀싱 또는 시퀀싱을 사용한 트랜스포자제 접근 염색질에 대한 단일 핵 분석(ATAC-seq)과 같은 다운스트림 애플리케이션을 위해 수명이 짧은 척추동물 모델 Nothobranchius furzeri의 뇌에서 핵을 분리하는 프로토콜을 제시합니다.

성인 아프리카 청록색 Killifish의 뇌 조직에서 핵의 부드러운 분리, 노화 연구를위한 자연적으로 수명이 짧은 모델

Studying brain aging at single-cell resolution in vertebrate systems remains challenging due to cost, time, and technical constraints. Here, we ...

이것은 노화 연구를 위한 새로운 척추동물 모델인 아프리카 청록색 킬리피쉬의 냉동 뇌를 사용하는 단일 핵 시퀀싱 실험을 위한 고품질 핵 분리를 위한 최초의 최적화된 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 핵을 매우 부드럽게 분리하여 더 많은 수초가 있는 뇌를 가진 다른 유기체에 최적화된 더 가혹한 프로토콜과 구별되며, 이는 킬리피쉬에서 사용될 때 핵이 분해되는 결과를 초래합니다. 이 방법은 단일 세포 수준에서 뇌 노화를 이해하는 데 도움이 될 것입니다.더 부드러운 핵 분리가 필요한 다른 조직으로 잘 번역되어야합니다. 이 프로토콜은 사용자 친화적입니다. 가장 까다로운 작업은 파편 제거를위한 그라디언트 원심 분리로, 빠르고 지저분한 것보다 느리고 정확한 것이 좋습니다.이 절차를 시연하는 것은 아리 애들러 (Ari Adler)와 브라이언 티피 (Brian Teefy), 연구실 기술자이자 베나 윤 연구소의 박사후 연구원입니다. 킬리 피쉬를 해부 한 후, 얼어 붙은 뇌 조직을 얼음에서 10 분 동안 해동하고 2 밀리리터 dounce 균질화기의 얼음처럼 차가운 핵 용해 완충액 1 밀리리터에 뇌를 담근다. 샘플을 용해하는 동안 균질화기를 얼음 위에 유지하고 기포가 발생하지 않도록 하십시오.원고에 설명된 대로 조직을 두드리고 샘플을 dounce 균질화기의 얼음 위에 2분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 70마이크로미터 셀 필터를 통해 샘플을 5%BSA로 사전 코팅된 15밀리리터 원추형 튜브에 변형시킵니다. 70마이크로미터 세포 필터 위에 세척 버퍼를 피펫팅하여 샘플에 4밀리리터의 핵 세척 버퍼를 추가하고 튜브를 5회 부드럽게 뒤집어 혼합합니다.스윙 버킷 로터를 사용하여 섭씨 4도에서 10분 동안 500G의 샘플을 원심분리합니다. 상청액을 액체 폐기물 용기에 부드럽게 부어 버립니다. 샘플을 똑바로 세우고 P1000 피펫을 사용하여 남은 세척 버퍼를 제거합니다.넓은 구멍의 P1000 피펫 팁으로 1 밀리리터의 핵 세척 완충액에 핵을 즉시 재현 탁하십시오. 그런 다음 4 밀리리터의 핵 세척 완충액을 추가하여 샘플을 5 밀리리터로 가져오고 이전에 설명 된대로 혼합하십시오. 원심분리에 의해 세포를 펠릿화한다.상청액을 버리고 넓은 구멍의 피펫 팁으로 1 밀리리터의 핵 세척 완충액에 핵을 다시 현탁시킵니다. 이제 핵을 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 300마이크로리터의 파편 제거 용액을 세포 현탁액에 추가하고 혼합물이 균질해질 때까지 넓은 보어 팁으로 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.튜브를 약간 비스듬히 잡고 P1000 피펫을 사용하여 핵 용액 위에 1mg의 핵 세척 버퍼를 부드럽게 덮습니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 3000G의 스윙 버킷 로터에서 샘플을 원심분리합니다. P1000 피펫을 사용하여 상위 두 단계를 완전히 폐기하십시오.하단 레이어를 5%BSA로 사전 코팅된 15밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 핵 세척 완충액으로 부피를 15 밀리리터로 가져오고 튜브를 세 번 뒤집어 혼합합니다. 스윙 버킷 로터에서 섭씨 4도에서 10분 동안 1000G에서 튜브를 원심분리합니다.상청액을 조심스럽게 제거하고 넓은 보어 피펫 팁을 사용하여 150 마이크로리터의 핵 세척 완충액에 펠릿을 즉시 재현탁합니다. 300마이크로리터로 설정된 표준 보어 피펫 팁으로 전환합니다. 전체 샘플을 파이펫팅한 다음 40마이크로미터 팁식 필터를 파이펫 팁 끝에 부착합니다.필터를 통해 샘플을 낮은 DNA 결합, 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 강제로 배출하여 샘플을 필터링합니다. FACS 튜브에서 여과된 핵 샘플 10마이크로리터를 권장 유세포분석 버퍼 90마이크로리터에 재현탁합니다. 샘플을 밀리리터당 1마이크로그램의 최종 농도로 요오드화프로피듐으로 염색합니다.원고에 설명된 대로 작업 공간을 설정한 후 오른쪽 하단 모서리에 있는 재생 아이콘을 눌러 흐름을 시작합니다. 측면 산란 영역과 HDRT를 비교하여 샘플에 기포 또는 덩어리가 있는지 확인합니다. 또한 측면 산점도와 정방향 산점도를 비교하여 이벤트가 창 범위 내에서 누적되는지 확인합니다.확대 보기의 경우 측면 분산 영역 대 PerCP-Vio700-A 플롯을 두 번 클릭합니다. 왼쪽 상단 도구 모음에서 수직선이 있는 버튼을 클릭하여 사분면 게이트를 선택합니다. 그런 다음 측면 분산 영역과 PerCP-Vio700-A 플롯의 아무 곳이나 클릭하면 플롯 내부에 사분면이 나타납니다.사분면 구분선의 아무 곳이나 클릭하고 커서를 밀어 사분면 배치를 수정합니다. 왼쪽 상단 사분면에 파편이 있고 오른쪽 상단 사분면에 핵이 포함되도록 사분면을 배치합니다. 사각형, 회색, I 아이콘을 클릭하여 속성 창을 엽니다.영역 기능 탭으로 이동하여 상단 항목 옆에 녹색 확인 표시가 있는지 확인하여 전체 플롯이 선택되었음을 나타냅니다. 함수 목록에서 마이크로리터당 개수를 클릭하여 녹색 확인 표시를 생성합니다. 확인을 클릭하면 각 사분면에 마이크로리터당 개수가 표시됩니다. 메트릭.영역 함수 탭에서 카운트 및 백분율 합계를 선택하여 원하는 경우 원시 카운트와 백분율을 봅니다. 왼쪽 위 도구 모음에서 다각형 단추를 클릭하여 이 인구 주위에 다각형 게이트를 그립니다. 그런 다음 한 번 클릭하고 마우스를 밀어 게이트의 선형 세그먼트를 그립니다.다시 클릭하여 완료하고 다음 게이트를 시작한 다음 두 번 클릭하여 게이트를 완료합니다. 게이트의 경계를 클릭하고 마우스를 밀어 게이트의 위치를 변경합니다. 게이트의 정점을 클릭하여 모양을 수정하면 게이트 모집단의 마이크로리터당 개수가 나타납니다.손상되지 않은 막을 가진 단일 핵으로 나타난 건강한 핵은 다운 스트림 분석에 적합합니다. 그러나 건강에 해로운 핵은 손상된 핵막이 특징이며, 이는 핵 응집으로 이어지고 다운스트림 응용 분야의 배경 신호에 기여할 수 있습니다. 핵은 오른쪽 상단 사분면에 단일항 및 다중 형태이며, 단일 렛은 가장 낮은 이벤트 구름으로 이어지며 이중 및 삼중 항이 오름차순으로 이어집니다.파편은 파편 제거 단계가 생략된 저품질 핵 준비에서 가장 왼쪽 두 사분면의 이벤트로 표시됩니다. 파편은 사건의 40 % 이상을 차지합니다. 그러나 고품질 실험에서 파편은 모든 사건의 15 % 미만을 차지합니다.오염을 줄이기 위해 파편 제거 원심분리 단계 후 중간층을 완전히 제거하는 것이 필수적입니다. 이 프로토콜을 사용하여 분리된 핵은 단일 세포 수준의 전사체 및 후성유전학적 정보를 얻기 위해 단일 핵 RNA 시퀀싱 또는 ATAC 시퀀싱에 사용할 수 있습니다. 이 기술을 통해 연구자들은 노화 연구를위한 자연적으로 수명이 짧은 척추 동물 모델 유기체 인 아프리카 청록색 킬리 피쉬의 단일 세포 수준에서 뇌 유전자 조절을 탐구 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 성체 제브라피시에서 형광 표지된 T 세포 급성 림프구 백혈병(T-ALL) 종양 세포를 분리하고 트리판 블루 염료를 사용하여 정량화하는 기술을 설명합니다.

형광 표지된 T-ALL 세포 분리: 성체 제브라피시에서 T-ALL 세포를 분리하는 방법

이 비디오는 뇌 조직을 기계적으로 파괴하여 유충 제브라피시 뇌에서 뉴런, 대식세포 및 미세아교세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 정제된 세포 집단은 게놈 분석에 추가로 사용할 수 있습니다.

제브라피시 유충에서 뇌 세포 분리: 제브라피시 뇌 조직에서 온전한 뉴런, 대식세포 및 미세아교세포를 얻는 기술

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여기에서 우리는 전체 뇌 또는 telencephalic, tectal 또는 성인 zebrafish의 뇌의 소뇌 영역 중 하나에서 파생 neurosphere 분석을 사용하여 성인 신경을 검사 할 수있는 재생 가능한 방법을 제공한다. 또한, 우리는 제브라 피쉬 neurosphere를 유전자 발현을 조작하는 절차를 설명한다.

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이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 vitrification (NIV) 절차 전체 zebrafish testes cryopreserve에 몰입 했다. 또한, 5 개의 다른 zebrafish 긴장에서 방법의 반복성 시험 되었다.

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우리는 신경 세포, 대 식 세포 및에서 생리 및 병 적인 조건 하에서 애벌레 zebrafish 두뇌 microglia 분리 프로토콜을 제시. 절연, 시 RNA 유전자 식 프로필 분석 하이 셀에서 추출 됩니다. 이 프로토콜 정량 및 transcriptomics 같은 다운스트림 분석에 대 한 높은-품질 RNA의 컬렉션에 대 한 수 있습니다.

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여기에서, 우리는 형질전환 성 외피염 예쁜꼬마선에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 살아있는 뉴런 세포의 특정 그룹의 단순 분리를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 특정 뉴런에 초점을 맞춘 다양한 생체 내 연구를 가능하게하고 추가 단기 배양세포를 분리 할 수있는 능력을 갖는다.

둥근 벌레 예쁜꼬마선충에서 특정 신경 인구의 격리

단일 핵 절연은 세포막의 해리 및 세제 기반 과구화에 의존하며 최적화가 필요하며 기술 적 유물을 도입하는 경향이있는 단계입니다. 당사는 전체 조직에서 직접 그대로 핵을 신속하게 분리하기 위한 세제 및 효소 없는 프로토콜을 시연하여 단일 핵 RNA-seq(snRNA-Seq) 또는 ATAC-seq에 적합한 핵을 산출합니다.

세제 및 효소 없는 방법을 사용하여 조직 전체에서 핵 분리

여기서 우리는 생체 내 최대 애벌레와 청소년 단계에서 제브라피시 배아 뇌를 이미지화하는 방법을 제시합니다. 전기 생리학적 접근법에서 채택된 이 미세침습 절차는 성숙한 뉴런의 세포 및 세포 세포 이하 세부 사항에 대한 액세스를 제공하며 뇌 기능 및 약물 개입을 특성화하기 위한 광유전학 및 신경 약리학과 결합될 수 있습니다.

두개골과 피부 제거에 의해 깨어 얼룩말 물고기 애벌레와 청소년에서 완전히 활성 뇌 조직의 생체 내 이미징

배우세요 아프리카 청록색 킬리피시 뇌 조직에서 핵을 부드럽게 분리하는 최적화된 프로토콜을. 단일세포 수준에서 노화 메커니즘을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

성인 아프리카 청록색 Killifish의 뇌 조직에서 핵의 부드러운 분리, 노화 연구를위한 자연적으로 수명이 짧은 모델

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