Name: 유세포분석을 통한 노화 종양 세포의 식별 및 농축을 위한 원적색 형광 노화 관련 β-갈락토시다아제 프로브 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: 배우세요 유세포분석을 이용한 화학요법 유도 노화 종양 세포의 신속한 정량화 방법을. 이 기법은 두 가지 마커를 사용하여 노화 세포 식별의 신뢰성을 높이고, 후속 분석을 위한 세포 농축이 가능합니다.

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유세포분석 기기에 대한 지원을 해주신 시카고 대학교의 세포분석 및 항체 핵심 시설에 감사드립니다. 시카고 대학의 동물 연구 센터는 동물 주택을 제공했습니다.

<ol><li>Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+escape+from+therapy-induced+senescence+as+a+model+of+disease+recurrence+after+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy.</a> Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).</li>
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<li>Georgakopoulou, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+lipofuscin+staining+as+a+novel+biomarker+to+detect+replicative+and+stress-induced+senescence.+A+method+applicable+in+cryo-preserved+and+archival+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues.</a> Aging. 5 (1), 37-50 (2013).</li>
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<li>Burd, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+tumorigenesis+and+senescence+in+vivo+with+a+p16%28INK4a%29-luciferase+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model.</a> Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).</li>
<li>Liu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+exhibiting+strong+p16+%28INK4a%29+promoter+activation+in+vivo+display+features+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).</li>
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<li>González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li>
</ol>

저자는이 연구에 대해 선언 할 이해 상충이 없습니다.

지난 10여 년 동안 유세포분석은 종양 면역학의 새로운 인기, 저비용 유세포분석기의 개발 및 학술 기관의 공유 기기 시설 개선으로 인해 암 연구에서 보다 일반적인 분석 플랫폼이 되었습니다. 대부분의 최신 기기에는 보라색, 청록색 및 적색에서 원적색 광학 어레이가 장착되어 있기 때문에 다색 분석이 이제 표준입니다. 따라서, 이 DDAOG 프로토콜은 광범위한 유세포분석기와 호환될 가능성이 높다. 물론 모든 유세포분석기는 사용자가 평가해야 합니다. DDAOG 분석에 추가 형광단(예: 형광성, 접합 항체)을 추가할 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. 채널 간 형광단 혼선의 평가는 다른 모든 관련 채널에서 시각화된 단일 염색 대조군을 사용하여 수행해야 합니다. 중첩이 관찰되면, 스펙트럼 보상은 전형적인 방법에 따른 보정을 위해 수행될 수 있다(20 ).
본원에 나타낸 연구 결과는 주로 DDAOG 유세포분석 분석이 세포 또는 종양에서 화학요법 약물...

노화 세포는 정상적인 생물학적 노화 동안 일반적으로 수년에 걸쳐 유기체에 축적되지만 방사선 및 화학 요법을 포함한 다양한 암 치료에 의해 유발 된 손상에 대한 반응으로 종양 세포에서도 빠르게 발전 할 수 있습니다. 더 이상 증식하지는 않지만 치료 유도 노화(TIS) 종양 세포는 치료 내성에 기여하고 재발을 유발할 수 있습니다1,2,3. TIS 세포에 의해 분비되는 인자는 면역 회피 또는 전이를 촉진하여 종양 악성 종양을 악화시킬 수 있습니다 4,5. TIS 세포는 복잡한 상황별 표현형, 변경된 대사 프로필 및 고유한면역 반응을 발달시킵니다6,7,8. 따라서 다양한 암 치료 접근법에 의해 유도 된 TIS 종양 세포의 확인 및 특성화는 암 연구 커뮤니티의 지속적인 관심 주제입니다.
TIS 종양 세포를 검출하기 위해, 종래의 노화 분석은 주로 노화 마커 효소 인 리소좀 베타-갈 락토시다 제 GLB19의 증가 된 활성을 검출하는 것에 기초하여 널리 사용된다. 중성에 가까운(산성이 아닌) 리소좀 pH에서 검출하면 노화 관련 베타-갈락토시다아제(SA-β-Gal)를 특이적으로 검출할 수 있습니다10. 수십 년 동안 사용되어 온 표준 SA-β-Gal 분석은 청색 발색 베타 갈락토시다제 기질인 X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드)을 사용하여 광학 현미경으로 고정 세포에서 SA-β-Gal을 검출합니다11. X-Gal 분석을 통해 일반적으로 사용 가능한 시약 및 실험실 장비를 사용하여 TIS를 정성적으로 시각적으로 확인할 수 있습니다. 기본 투과광 현미경은 청색 발색의 존재를 평가하는 데 필요한 유일한 기기입니다. 그러나 X-Gal 염색 절차는 감도가 부족할 수 있으며 때로는 색상이 발생하는 데 24시간 이상이 필요합니다. 염색 후에는 광학 현미경으로 청색 발색의 강도 수준을 나타내는 세포를 계수하는 것을 기반으로 개별 노화 세포의 낮은 처리량, 주관적인 점수가 이어집니다. X-Gal은 세포 불투과성이므로 이 분석에는 다운스트림 분석을 위해 회수할 수 없는 용매 고정 세포가 필요합니다. 동물이나 환자의 제한된 샘플로 작업 할 때 이는 큰 단점이 될 수 있습니다.
C12-FDG(5-도데카노일아미노플루오레세인 디-β-D-갈락토피라노사이드, 녹색) 및 DDAOG(9H-(1,3-디클로로-9,9-디메틸아크리딘-2-온-7-일)β-D-갈락토피라노사이드, 원적색)를 포함한 세포 투과, 형광 효소 기질을 사용하는 개선된 SA-β-Gal 분석은 이전에 문헌12,13,14,15에 나타났습니다. DDAOG의 화학적 프로브 구조 및 광학적 특성은 보충 그림 S1에 나와 있습니다. 이러한 세포 투과성 프로브를 사용하면 고정되지 않은 살아있는 세포를 분석할 수 있으며, 발색성 프로브가 아닌 형광 프로브는 고함량 스크리닝 기기 및 유세포분석기를 포함한 신속한 고처리량 형광 분석 플랫폼의 사용을 용이하게 합니다. 분류 유세포분석기는 다운스트림 분석(예: 웨스턴 블로팅, ELISA 또는 'omics)을 위해 세포 배양 또는 종양으로부터 살아있는 노화 세포의 농축 개체군을 회수할 수 있습니다. 형광 분석은 또한 정량적 신호를 제공하여 주어진 샘플 내에서 노화 세포의 백분율을 보다 정확하게 결정할 수 있습니다. 생존성 프로브 및 형광단 표지 항체를 포함한 추가 형광 프로브를 쉽게 추가하여 SA-β-Gal 이상의 표적을 다중화 분석할 수 있습니다.
DDAOG와 유사하게 C12-FDG는 SA-β-Gal의 형광 프로브이지만 녹색 형광 방출은 세포16에 리포푸신 응집체가 축적되어 노화 중에 발생하는 고유 세포 AF와 겹칩니다. 원적색 DDAOG 프로브를 활용하여 녹색 셀룰러 AF를 노화를 확인하기 위한 보조 매개변수로 사용할 수 있습니다17. 이는 SA-β-Gal 외에 두 번째 마커를 사용하여 분석 신뢰성을 향상시키는데, 이는 종종 노화18에 대한 단일 마커로서 신뢰할 수 없을 수 있습니다. 노화 세포에서 내인성 AF의 검출은 표지가 없는 접근 방식이므로 DDAOG 기반 분석의 특이성을 확장하는 빠르고 간단한 방법입니다.
이 프로토콜에서 우리는 시험관 내 배양에서 생존 가능한 TIS 종양 세포를 식별하거나 마우스에서 확립된 약물 처리 종양에서 분리하기 위한 신속한 이중 매개변수 유세포분석 분석으로 DDAOG 및 AF를 사용하는 것을 보여줍니다(그림 1). 이 프로토콜은 광범위한 표준 상용 유세포분석 분석기 및 분류기와 호환되는 형광단을 사용합니다(표 1). 표준 유세포분석 분석을 이용한 생존가능한 노화 세포의 백분율의 정량이 가능하다. 원한다면, 선택적인 면역표지 단계를 수행하여 관심있는 세포 표면 항원을 노화와 동시에 평가할 수 있다. 확인된 노화 세포는 표준 형광 활성화 세포 분류(FACS) 방법론을 사용하여 농축할 수도 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64176/64176fig01.jpg"> 그림 1: 실험적 워크플로. DDAOG 분석의 요점을 요약한 개략도. (a) TIS 유도 약물을 포유동물 배양 세포에 첨가하거나 종양 보유 마우스에 투여한다. 그런 다음 TIS의 발병에 시간이 허용됩니다 : 세포의 경우, 치료 후 4 일; 마우스의 경우 총 22 일, 5 일마다 3 회 치료와 7 일 회복. 세포가 수확되거나 종양이 현탁액으로 해리됩니다. (B) 샘플을 Baf로 처리하여 30 분 동안 SA-β-Gal 검출을 위해 리소좀 pH를 조정합니다. 그런 다음 DDAOG 프로브를 60 분 동안 추가하여 SA-β-Gal을 검출합니다. 샘플을 PBS에서 2x 세척하고, 생존성 염색을 간단히 첨가한다(15분). 임의로, 샘플은 개방 형광 채널에서 형광 항체로 염색될 수 있고/있거나 추후 분석을 위해 고정될 수 있다. (C) 샘플은 표준 유세포 분석기를 사용하여 분석됩니다. 생존 가능한 세포는 빨간색 DDAOG (SA-β-Gal을 나타냄) 대 녹색자가 형광 (리포 푸신)을 보여주는 점도표로 시각화됩니다. TIS 세포의 백분율을 결정하기 위한 게이트는 처리되지 않은 대조군 샘플에 기초하여 확립된다(도시되지 않음). 분류 세포분석기(FACS)를 사용하는 경우 TIS 세포를 수집하여 추가 시험관 내 분석을 위해 배양에 다시 넣거나 분자 생물학 분석을 위해 용해 및 처리할 수 있습니다. 약어 : DDAO = 9H- (1,3- 디클로로 -9,9- 디메틸 아 크리 딘 -2- 온); DDAOG = DDAO-갈락토사이드; TIS = 치료 유도 노화; FL-Ab = 형광단-접합 항체; Baf = 바필로마이신 A1; SA-β-Gal = 노화-관련 베타-갈락토시다제; PBS = 인산염-완충 식염수; FACS = 형광 활성화 세포 분류. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64176/64176fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>형광단</td>
			<td>감지</td>
			<td>전 / 엠 (nm)</td>
			<td>사이토 미터 레이저 (nm)</td>
			<td>세포계 검출기/대역통과 필터(nm)</td>
		</tr><tr><td>다오그</td>
			<td>사β갈</td>
			<td>645/6601</td>
			<td>640</td>
			<td>670 / 30</td>
		</tr><tr><td>AF</td>
			<td>리포푸신</td>
			<td>&lt; 600</td>
			<td>488</td>
			<td>525 / 50</td>
		</tr><tr><td>이력서450</td>
			<td>생존 능력</td>
			<td>408/450</td>
			<td>405</td>
			<td>450 / 50</td>
		</tr><tr><td>체육</td>
			<td>항체/표면 마커</td>
			<td>565/578</td>
			<td>561</td>
			<td>582 / 15</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 형광단 및 세포분석기 광학 사양. 이 프로토콜에 사용되는 세포분석기 사양은 총 4개의 레이저와 15개의 방출 검출기가 있는 기기에 대해 나열됩니다. 645/660 nm에서 검출된 DDAOG는 SA-β-Gal1에 의해 절단된 프로브의 형태이다. 절단되지 않은 DDAOG는 460/610nm에서 낮은 수준의 형광을 나타낼 수 있지만 프로토콜의 세척 단계에 의해 제거됩니다. 약어 : DDAO = 9H- (1,3- 디클로로 -9,9- 디메틸 아 크리 딘 -2- 온); DDAOG = DDAO-갈락토사이드; AF =자가 형광; PE = 피코 에리트 린; SA-β-Gal = 노화 관련 베타-갈락토시다아제.

<table><tbody><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Research Products International</td><td>B40500</td><td></td></tr><tr><td>블레오마이신 설페이트&nbsp;</td><td>Cayman</td><td>13877</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>US Biological</td><td>A1380</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Violet 450 AM 생존 염료</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65-0854-39</td><td>eBioscience</td></tr><tr><td>DPP4 항체, PE 접합체</td><td>Biolegend</td><td>137803</td><td>Clone H194-112</td></tr><tr><td>세포주: A549 인간 폐 선암종</td><td>미국형 배양 컬렉션</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>세포주: B16-F10 마우스 흑색종</td><td>미국형 배양 컬렉션</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기, 100 &마이크로; m</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>DDAO-Galactoside</td><td>Life Technologies</td><td>D6488</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 매체 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>독소루비신, 염산염 주사 (USP)</td><td>Pfizer</td><td>NDC 0069-3032-20</td><td></td></tr><tr><td>독소루비신, PEGylated liposomal (USP)</td><td>Sun Pharmaceutical</td><td>NDC 47335-049-40</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M</td><td>Life Technologies</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Etoposide&nbsp;</td><td>케이맨</td><td>12092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>오메가&nbsp;</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Fc 수용체 차단 시약</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>안티 마우스 CD16/32</td></tr><tr><td>유세포 분석기(세포 분석기)</td><td>Becton Dickinson(BD)</td><td>다양한</td><td>LSRFortessa</td></tr><tr><td>유세포 분석기(세포 분류기)</td><td>Becton Dickinson(BD)</td><td>다양한</td><td>FACSAria</td></tr><tr><td>GlutaMax 100x</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Lonza</td><td>BW17737</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL</td><td>Sigma</td><td>5401020001</td><td>Roche</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16%</td> <td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 100x</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) 1x</td><td>Corning</td><td>MT21031CV</td><td>Dulbecco의 PBS(칼슘 및 마그네슘 제외)</td></tr><tr><td>무지개 보정 입자, 울트라 키트</td><td>SpheroTech</td><td>UCRP-38-2K</td><td>3.5-3.9 &micro; m, 2E6/mL</td></tr><tr><td>RPMI-1640 매체 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 0.9% (USP)</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>2B1324</td><td></td></tr><tr><td>Cytometer 데이터 수집용 소프트웨어, "FACSDiva"</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>n/a</td><td>라이선스 BD에 문의</td></tr><tr><td>Cytometer 데이터 분석용 소프트웨어, "FlowJo"</td><td>TreeStar</td><td>해당 사항</td> <td>없음</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25%</td><td>Life Technologies</td><td>25200-114</td><td></td></tr> 라이센스에 대해 TreeStar에 문의하십시오</tbody></table>.

유세포분석을 통한 노화 종양 세포의 식별 및 농축을 위한 원적색 형광 노화 관련 β-갈락토시다아제 프로브

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

세포 노화는 노화 세포에서 일반적으로 수년에 걸쳐 발생하는 생물학적 손상에 의해 유발되는 증식 정지 상태이지만 다양한 암 치료에 의해 유발 된 손상에 대한 반응으로 종양 세포에서도 빠르게 나타날 수 있습니다. 종양 세포 노화는 노화 세포가 사멸에 내성을 갖게되고 종양 완화를 차단하면서 종양 악성 종양 및 치료 내성을 악화시키기 때문에 일반적으로 바람직하지 않은 것으로 간주됩니다. 따라서 노화 종양 세포의 식별은 암 연구 커뮤니티의 지속적인 관심사입니다. 다양한 노화 분석이 존재하며, 많은 것이 잘 알려진 노화 마커인 노화 관련 베타-갈락토시다아제(SA-β-Gal)의 활성을 기반으로 합니다. 
일반적으로 SA-β-Gal 분석은 고정 된 세포에 발색 기질 (X-Gal)을 사용하여 수행되며 광학 현미경으로 "파란색"노화 세포를 느리고 주관적으로 열거합니다. C12-FDG(녹색) 및 DDAO-갈락토사이드(DDAOG; far-red)를 포함한 세포 투과성 형광 SA-β-Gal 기질을 사용한 개선된 분석은 살아있는 세포의 분석을 가능하게 하고 유세포분석기를 포함한 고처리량 형광 분석 플랫폼의 사용을 가능하게 했습니다. C12-FDG는 SA-β-Gal에 대해 잘 문서화 된 프로브이지만 녹색 형광 방출은 리포 푸신 응집체의 축적으로 인해 노화 중에 발생하는 고유 세포자가 형광 (AF)과 겹칩니다. 원적색 SA-β-Gal 프로브 DDAOG를 활용하여 녹색 세포 자가형광을 노화를 확인하기 위한 보조 파라미터로 사용하여 분석에 신뢰성을 더할 수 있습니다. 나머지 형광 채널은 세포 생존율 염색 또는 선택적인 형광 면역표지에 사용될 수 있다.
유세포 분석을 사용하여 노화 종양 세포의 식별을 위한 이중 매개변수 분석으로 DDAOG 및 리포푸신 자가형광을 사용하는 것을 입증합니다. 생존 가능한 노화 세포의 백분율의 정량이 수행됩니다. 원한다면, 관심있는 세포 표면 항원을 평가하기 위해 선택적인 면역표지 단계가 포함될 수 있다. 확인된 노화 세포는 또한 유세포 분석기로 분류되고 다운스트림 분석을 위해 수집될 수 있습니다. 수집된 노화 세포는 즉시 용해되거나(예를 들어, 면역검정 또는 '오믹스 분석을 위해) 추가로 배양될 수 있다.

SA-β-Gal에 의한 노화의 검출을 위한 X-Gal 및C12-FDG에 대한 DDAOG의 비교가능성을 입증하기 위해 여러 실험을 수행하였다. 먼저, X-Gal을 사용하여 ETO에 의해 유도된 노화 B16-F10 흑색종 세포를 염색하였다(도 2A). ETO 처리 된 세포의 하위 집합에서 강렬한 파란색이 발생한 반면 다른 세포는 덜 강렬한 파란색 염색을 나타 냈습니다. 형태학은 대부분의 ETO 처리된 세포에서 확대되었다. 형광 SA-β-Gal 기질C12-FDG(녹색) 또는 DDAOG(원적색)로 ETO 처리된 세포를 염색한 결과, X-Gal과 유사한 염색 패턴과 강도 변화가 나타났습니다(그림 2B). 그러나, 녹색C12-FDG 방출은 세포 AF와 중첩되었고(도 2C), 이는 노화 세포(...

세포 배양 또는 쥐 종양 모델에서 화학 요법 약물에 의해 유도 된 노화 암 세포의 형광, 유세포 측정 정량화를위한 프로토콜이 제시된다. 선택적 절차에는 공동 면역염색, 대규모 배치 또는 시점 분석을 용이하게 하기 위한 샘플 고정, 유세포 분석 분류에 의한 생존 가능한 노화 세포의 농축이 포함됩니다.

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

당사의 다중 매개변수 유세포분석 프로토콜은 암 생물학 및 치료 분야에서 지속적인 연구 조건인 종양 세포에서 치료 유발 노화의 신속하고 향상된 검출을 가능하게 합니다. 당사의 유세포분석 노화 분석은 기존의 현미경 기반 분석보다 더 빠릅니다. 우리는 노화 세포를 식별하기 위해 하나가 아닌 두 개의 마커를 사용하여 분석 신뢰성을 향상시킵니다.세포를 형광 항체로 공동 염색하여 관심있는 추가 표적을 검출 할 수 있습니다. 유세포분석 분류는 다운스트림 분석을 위해 노화 세포의 집단을 풍부하게 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석은 배양된 암 세포주 또는 부드러운 해리 후 전체 종양 샘플에서 노화 세포를 검출할 수 있습니다.이 기술을 시도하기 전에 사용되는 유세포 분석기의 일반적인 작동 절차를 숙지하는 것이 중요합니다. 권장 유세포분석기 사양에 대해서는 텍스트를 참조하십시오. 약물에 의한 노화 유도 하루 전에 0.25% 트립신 EDTA로 암 세포주 배양을 수확합니다.세포를 섭씨 37도에 5 분 동안 두어 트립신을 활성화하고 세포 단층을 분리합니다. 단층이 눈에 띄게 분리되면 동일한 부피의 완전한 배양 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다. 세포 현탁액을 멸균 원추형 튜브로 옮깁니다.표준 혈구계 방법을 사용하여 세포를 계수하고 밀리리터당 세포를 기록합니다. 세포를 표준 6-웰 플라스틱 배양 플레이트에서 평방 센티미터당 10 내지 10번 내지 10번 내지 10번 세포를 플레이트화한다. 접시를 섭씨 37도에서 5%이산화탄소와 습도로 밤새 배양합니다.다음날, 세포를 에토포사이드와 같은 관심있는 노화 유도제로 처리한다. 그런 다음 노화가 시작될 수 있도록 4 일 동안 배양하십시오. 예상되는 형태 변화에 대해 광학 현미경으로 매일 세포를 검사합니다.노화가 시작된 후 트립신 EDTA를 섭씨 37도에서 5 분 동안 첨가하여 세포를 수확합니다. 세포가 현탁액으로 해리되면 동일한 부피의 완전한 배지로 트립신을 중화시킵니다. 세포 현탁액의 각 웰을 1.7밀리리터 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.세포를 다시 세고 샘플당 동일한 수의 세포를 새 튜브 세트로 분취합니다. 튜브를 섭씨 4도에서 1, 000g에서 5 분간 원심 분리하고 상층액을 제거하십시오. 먼저, DMEM에 바필로마이신 A 마이크로몰 1개의 용액을 세포 펠렛에 첨가하여 배양된 세포 시료의 리소좀 pH를 밀리리터당 10배 내지 6배의 농도로 첨가하고 피펫으로 혼합한다.회전 장치에서 섭씨 37도에서 느린 속도로 30 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 노화 관련 베타-갈락토시다아제를 염색하려면 세척하지 않고 밀리리터당 10마이크로그램의 DDAOG 원액을 샘플에 추가합니다. 직사광선이 비치지 않도록 60분 동안 회전 장치에 두십시오.이전과 같이 튜브를 원심 분리하고 상청액을 제거한 다음 PBS에서 얼음처럼 차가운 0.5 % BSA 1 밀리리터로 펠릿을 씻습니다. 그런 다음 300 마이크로 리터의 희석 된 Calcein Violet 450 AM 용액을 세척 된 세포 펠릿에 첨가하십시오. 어둠 속에서 얼음 위에서 15 분 동안 배양하십시오.세포 샘플을 유세포분석 기기 호환 튜브로 옮깁니다. 데이터 수집 소프트웨어에서 보라색 채널 히스토그램과 원적색 채널 대 녹색 채널 도트 플롯을 엽니다. 낮은 흡기 속도에서 세포분석기 데이터 수집을 시작하고 DDAOG로 염색된 양성 대조군 샘플을 흡기 포트에 놓습니다.샘플 데이터 수집을 시작합니다. 각 플롯 내에 90% 이상의 이벤트가 포함되도록 채널 전압을 조정합니다. 모든 설정이 최적이면 샘플당 10, 000개의 이벤트를 기록합니다.DDAOG로 염색된 차량 전용 제어 샘플을 흡기 포트에 놓습니다. 데이터 수집을 시작하고 샘플당 10, 000개의 이벤트를 기록합니다. 양성 대조군과 비교하여 자가형광 또는 AF 및 DDAO-갈락토사이드 신호의 증가를 확인하십시오.샘플 데이터를 fcs 파일 형식으로 저장하고 유세포 분석 소프트웨어가 장착 된 워크 스테이션 컴퓨터로 파일을 내 보냅니다. 세포 분석 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 획득 한 모든 샘플에 대한 fcs 데이터 파일을로드합니다. 먼저 생존 가능한 셀을 게이트하려면 차량 전용 컨트롤의 샘플 데이터를 두 번 클릭하여 데이터 창을 엽니다.데이터를 보라색 채널 히스토그램으로 시각화합니다. CV 450으로 염색 된 생존 세포는 죽은 세포보다 더 밝은 형광을 기반으로합니다. 단일 게이트 히스토그램 도구를 사용하여 실행 가능한 셀만 포함하도록 게이트를 그립니다.게이트의 이름을 실행 가능하게 지정합니다. 그런 다음 Viable 게이트를 샘플 레이아웃 창에서 다른 셀 샘플로 끌어 게이트를 균일하게 적용합니다. 레이아웃 창을 엽니다.레이아웃 창에서 모든 샘플을 보라색 채널 히스토그램으로 시각화합니다. 생존 가능한 세포 게이팅이 샘플 간에 적절한지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 필요에 따라 조정하십시오.다음으로, 노화 셀을 게이트하려면 차량 전용 컨트롤에 대한 제어된 실행 가능한 셀 데이터를 두 번 클릭하여 데이터 창을 엽니다. 그런 다음 데이터를 원적외선 채널 대 녹색 채널에 대한 점도표로 시각화합니다. 사각형 게이팅 도구를 사용하여 오른쪽 위 사분면에서 DDAO 양성 및 AF 양성 셀이 5% 미만인 게이트를 그립니다.게이트의 이름을 노인으로 지정합니다. 그런 다음 Senescent 게이트를 샘플 레이아웃 창에서 모든 샘플의 실행 가능한 하위 집합으로 끌어 게이트를 균일하게 적용합니다. 레이아웃 창으로 실행 가능한 모든 셀 게이트 하위 집합을 끌어다 놓습니다.실행 가능한 모든 샘플을 원적색 대 녹색 채널 점도표로 시각화하고 결과를 관찰합니다. 노화 게이트가 모든 플롯에서 보이고 차량 전용 제어장치의 게이트가 5% 미만의 노화 셀을 나타내는지 확인합니다. 이제 분석이 완료되었습니다.이제 데이터를 그래픽 및 표 형식으로 원하는 대로 내보낼 수 있습니다. 처리되지 않은 세포와 비교하여 에토포사이드에 의해 유도된 노화 B16-F10 흑색종 세포는 노화 관련 베타-갈락토시다아제 상승에 의한 X-gal의 절단으로 인해 확대된 형태 및 청색 염색을 나타냈습니다. 형광 C12FDG 또는 DDAOG로 에토포사이드 처리된 세포의 염색은 X-gal과 유사한 염색 패턴 및 강도 변화를 보여주었습니다.그러나, 녹색 C12FDG 방출과 겹치는 세포 자가형광은 염색되지 않은 노화 세포에서 축적되는 것으로 나타났다. 대조적으로, 자가형광은 DDAOG의 원적색 방출 범위에서 전형적으로 무시할 수 있었다. 산점도에 대한 유세포분석기 데이터 수집 설정, 5피크 상용 무지개 형광 보정 마이크로스피어 및 염색된 세포의 단일 채널 형광 데이터가 여기에 표시됩니다.B16-F10 흑색종 세포에 대한 DDAOG 유세포분석기 노화 분석 데이터는 에토포사이드에 의해 유도된 치료 유도 노화(TIS)가 생존 세포의 35%에서 발생했으며 세놀리틱 에이전트 ABT-263이 TIS 세포를 거의 제거했음을 보여주었습니다. A549 폐암 세포에서 블레오마이신은 생존 세포의 66 %에서 TIS를 유도했으며 ABT-263은 그 비율을 15로 감소시켰다. ABT-263 단독은 처리되지 않은 증식 세포에 독성이 없었습니다.항체 공동 염색 분석에서 PE 채널 데이터의 히스토그램은 에토포사이드 처리된 세포의 42%가 노화 마커 DPPP4 양성에 대해 양성인 것으로 나타났습니다. 또한 2차원 점도를 사용한 시각화에 따르면 에토포사이드 처리된 세포의 44%가 DDAOG 및 DPP4에 대해 이중 양성인 반면 비히클 전용 세포의 경우 4%가 양성이었습니다. 다음으로 DDAOG 염색된 세포의 고정을 평가하였다.고정되지 않은 대조군 샘플과 비교하여, 고정 샘플은 BLM-처리된 세포에서 노화로 점수가 더 높은 세포의 비율이 더 높은 미처리 세포에서 약간 더 높은 배경을 나타냈다. 이 효과는 밤새 보관된 고정 샘플에서도 관찰되었으며, 섭씨 4도에서 1주일 동안 보관되었습니다. 형태학 및 증식 마커에 의한 농축된 노화 세포 집단의 유세포분석 분류 및 검증이 표시됩니다.분류된 노화 세포는 예상대로 액틴을 형광 팔로이딘으로 염색하여 시각화된 확대된 형태를 나타냈습니다. 증식 마커 Ki67에 대한 신호의 감소를 또한 면역형광 염색에 의해 관찰하였다. 마지막으로, 화학 요법 약물로 치료 한 종양에서 노화의 정량화가 평가되었다.조직의 X-gal 염색은 상대적으로 약했지만 독소루비신 또는 페길화 리포좀 독소루비신으로 치료한 종양, 특히 DDAO-갈락토사이드 흐름 분석에 의해 노화에 대해 양성 점수를 받은 종양에서 청색 염색이 분명했습니다. 예상대로, 식염수 전용 종양은 무시할 수있는 노화를 나타 냈습니다. 여기에서 모든 라이브 셀 분석과 마찬가지로 프로토콜 단계는 효율적이지만 부드럽게 수행되어야 합니다.장기간의 염색 절차 또는 언급 된 시간을 초과하는 배양은 피해야합니다. 노화 세포가 유세포 분석기로 분류되면 면역 분석을 위해 배양물에 다시 넣거나 용해하고 전사체학 또는 단백질체학을 포함한 오믹스 분석을 위해 처리할 수 있습니다. 이 기술을 통해 우리 실험실과 다른 사람들은 DNA 손상, 단백질 발현 및 신진 대사 변화의 정량화를 포함하여 노화 종양 세포의 새로운 특징을 식별 할 수있었습니다.

far-red-fluorescent-senescence-associated-galactosidase-probe-for

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 이중 노화 마커로 치료 유도 노화 암세포를 정량화하기 위한 유세포 분석 기반 분석을 보여줍니다. 노화 세포의 검출 및 정량화에는 β-갈락토시다아제 기질을 사용하는 것이 포함됩니다. 기질은 노화 세포 내에서 활성 리소좀 β-갈락토시다아제에 의해 절단되어 자가형광 리포푸신 과립과 함께 노화 암세포를 표시하는 형광 생성물을 생성합니다.

therapy-induced senescent cancer cells의 유세포 분석 기반 정량화

노화가 방지하거나 종양 논란이 계속 추진할지 여부를 지정합니다. chemotherapeutical 마약 senesce하는 암 세포를 유도 할 수 있기 때문에, 노화를 연구하는 새로운 치료법을 제안 필수적이다. 그러나, 표준 및 널리 사용되는 β-갈 락토시다 분석은 주요 단점을 제공합니다. 우리는 여기에서 노화를 정량화 할 수있는 신속하고 민감한 유동 세포 계측법 기반 분석을 제안한다.

노화 암 세포를 정량화하는 민감한 방법

세포내 선생님 세포 노화의 유도에 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 여기, 우리는 세포 노화 중 선생님 수준 측정을 위한 중요 한 분석 결과 설명 합니다. 우리는 또한 노화 관련 분 비 표현 형, 다양 한 연령과 관련 된 장애에 기여 하는 보도 평가 하기 위한 프로토콜을 제공 합니다.

Oncogene 유도 노화 중 반응성 산소 종 및 정상적인 인간 섬유 아 세포에서 분 비 형 노화 관련의 정량적 측정

세포 노화는 만성 연령 과 관련된 병리 발달의 핵심 요소입니다. 노화 세포를 표적으로 하는 치료제의 식별은 건강한 노화를 연장하기 위한 약속을 보여줍니다. 여기서, 우리는 단일 세포에서 의 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성의 측정에 기초하여 senotherapeutics의 식별을 위해 스크리블하는 새로운 분석방법을 제시한다.

SA-β-갈락토시다아제 계 선별 분석법

여기서 우리는 단일 세포에서 다중 노화 관련 마커의 시각화 및 정량화를 위한 유세포 측정 기반 방법을 제시한다.

치료 유도 노인성 암 세포에서 다중 형광 노화 마커의 동시 이미징 및 유동 세포 측정 기반 검출

이 프로토콜은 인간 지방 조직에서 분리된 기질 혈관 분획에서 노화 관련 베타-갈락토시다제(SA-β-gal) 활성을 객관적이고 단일 세포로 검출하기 위한 반사광 공초점 현미경을 제시합니다. 이 방법은 면역세포화학과 호환되며, 정량 평가를 위한 pH 조절을 포함하고, 기존의 SA-β-갤 염색보다 더 민감하고 주관적인 대안을 제공합니다.

지방 기질 혈관 분율에서 반사광을 이용한 노화 검출

이 논문은 IMR-90 인간 섬유아세포에서 노화 과정에서 리소좀 재형성을 측정하기 위한 생세포 LysoTracker 프로토콜을 제시합니다.

인간 섬유아세포의 세포 노화 정량 평가를 위한 LysoTracker를 이용한 리소좀 프로파일링

효율적인 심사 프로토콜 astroglial 분화 세포종 줄기 세포 (GSCs)에 홍보 하는 작은 분자의 식별을 위해 제공 됩니다. 분석 결과 줄기 세포 감 별 법 기자에 의하여 향상 된 GFP (eGFP)의 식을 인간의 GFAP 발기인에 의해 구동 됩니다 기반으로 합니다.

교류 Cytometry 기반 약물 세포종 줄기 세포의 세포 분화를 촉진 하는 작은 분자의 식별에 대 한 시스템 검사

이 프로토콜은 복구 하 고 비 대상 배경 셀 혼합물에서 희소 한 대상 셀 단일 세포 수준에서 분자 유전 특성에 대 한 준비입니다. DNA 품질은 단일 세포 치료 비 고 (두 심사 기반 및 분석 대상) 단일 셀 응용 프로그램 허용 합니다.

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

Murine orthotopic PDAC homografts immunophenotyping에 실험 절차는 종양 면역 microenvironment 프로 파일링 목표로 합니다. 종양은 수술을 통해 이식 하는 orthotopically. 종양 크기에 200-600 m m3 의 수확 되었고 단일 셀 정지, 여러 면역 표식 FACS 분석 다른 붙일 표시 된 항 체를 사용 하 여 다음을 준비 하는 해리.

Immunophenotyping Orthotopic Homograft (Syngeneic) Murine 기본 KPC 췌 장 Ductal 선 암의 Cytometry로의

배우세요 유세포분석을 이용한 화학요법 유도 노화 종양 세포의 신속한 정량화 방법을. 이 기법은 두 가지 마커를 사용하여 노화 세포 식별의 신뢰성을 높이고, 후속 분석을 위한 세포 농축이 가능합니다.

유세포분석을 통한 노화 종양 세포의 식별 및 농축을 위한 원적색 형광 노화 관련 β-갈락토시다아제 프로브

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