Name: In ovo 전기천공에 의한 청각회로에서 깨지기 쉬운 X 정신지체 단백질의 세포 자율 기능 해부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 배우세요 in ovo 전기천공을 이용한 FMRP 세포 자율 기능 분석 방법을. 닭 배아의 청각회로에서 유전자 발현을 선택적으로 조절하여 취약한 X 정신지후증의 병태생리를 규명하는 기술입니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 보조금 (No. 32000697); 광저우 과학 기술 프로그램 (202102080139); 광동 자연 과학 재단 (2019A1515110625, 2021A1515010619); 중앙 대학을위한 기초 연구 기금 (11620324); 지난 대학 교육부 재생 의학 핵심 실험실의 연구 보조금 (No. ZSYXM202107); 중국 중앙 대학 기초 연구 기금 (21621054); 그리고 중국 광동성 의료 과학 연구 재단 (20191118142729581). 지난 대학의 의료 실험 센터에 감사드립니다. 원고를 신중하게 편집해 주신 테라 브래들리 박사에게 감사드립니다.

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<li>Deng, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+regulates+neurotransmitter+release+and+synaptic+information+transmission+by+modulating+action+potential+duration+via+BK+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels.</a> Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).</li>
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FMRP의 세포 자율 기능을 결정하기 위해서는 개별 세포 그룹 또는 세포 유형에서 발현을 조작해야합니다. FMRP의 주요 기능 중 하나는 시냅스 형성과 가소성을 조절하는 것이므로 특정 회로의 각 시냅스 구성 요소를 선택적으로 조작하는 것은 시냅스 통신에서 FMRP 메커니즘을 완전히 이해하기 위한 전제 조건입니다. 닭 배아의 난자 전기천공을 사용하여 시냅스 전 AG 뉴런 또는 시냅스 후 NM 뉴런에서 AG-NM 회로에서 FMRP 발현을 표적으로 하는 방법을 시연했습니다. 이를 위해서는 전기 천공을위한 적절한 발달 단계를 선택하고 배아에 전기 천공 전극을 정확하게 배치하는 것이 중요한 단계입니다. NM 뉴런은 HH1223의 r5/6 수준에서 신경관의 신경 전구 세포에서 발생합니다. 같은 단계에서, 두개골 신경 볏 세포는 신경관의 등쪽 끝에서 달팽이관 전정 신경절로 이동하여 미래의 AG 뉴런<sup class="xre...

취약 X 증후군(FXS)은 지적 장애, 감각 이상 및 자폐 행동을 특징으로 하는 신경 발달 장애입니다. 대부분의 경우 FXS는 초기 배아 단계1에서 시작하여 취약한 X 정신 지체 단백질 (FMRP, Fmr1 유전자에 의해 암호화 됨)의 전반적인 손실로 인해 발생합니다. FMRP는 일반적으로 뇌의 대부분의 뉴런과 신경교 세포와 감각 기관 2,3,4에서 발현되는 RNA 결합 단백질입니다. 포유류의 뇌에서 FMRP는 다양한 신경 활동에 중요한 단백질을 암호화하는 수백 개의 mRNA와 관련이있을 수 있습니다5. 기존의 Fmr1 녹아웃 동물에 대한 연구는 FMRP 발현이 시냅스 신경 전달의 조립 및 가소성에 특히 중요하다는 것을 보여주었습니다6. 여러 조건부 및 모자이크 녹아웃 모델은 축삭 투영, 수지상 패턴 및 시냅스 가소성을 포함한 여러 발달 이벤트 동안 FMRP 작용 및 신호가 뇌 영역, 세포 유형 및 시냅스 부위에 따라 다양하다는 것을 추가로 입증했습니다. 7,8,9,10,11,12,13,14 . 시냅스 전달을 조절하는 FMRP의 급성 기능은 뇌 슬라이스 또는 배양 된 뉴런에서 억제 성 FMRP 항체 또는 FMRP 자체의 세포 내 전달에 의해 연구되었다 15,16,17,18. 그러나 이러한 방법은 개발 중 FMRP 오발현으로 인한 결과를 추적하는 기능을 제공하지 않습니다. 따라서, FMRP의 세포 자율 기능을 조사하기 위한 생체내 방법의 개발이 절실히 필요하며, FXS 환자에서 보고된 이상이 관련 뉴런 및 회로에서의 FMRP 손실의 직접적인 결과인지, 또는 발달 중 네트워크 전반의 변화로부터 유도된 이차적 결과인지를 결정하는 데 도움이 될 것으로 기대된다(19).
닭 배아의 청각 뇌간은 회로 및 시냅스 발달에서 FMRP 조절에 대한 심층 기능 분석에 매우 유리한 모델을 제공합니다. 배아 닭의 뇌에 쉽게 접근 할 수 있고 유전자 조작을위한 난자 전기 천공 기술에 잘 정립 된 기술은 초기 배아 단계의 뇌 발달에 대한 우리의 이해에 크게 기여했습니다. 최근에 발표 된 연구에서이 기술은 FMRP 오발현20,21의 시간적 제어를 허용하는 고급 분자 도구와 결합되었습니다. 여기서, 방법론은 시냅스 전 뉴런과 시냅스 후 뉴런의 선택적 조작을 개별적으로 유도하기 위해 발전됩니다. 이 방법은 청각 뇌간 회로에서 개발되었습니다. 음향 신호는 청각 내이의 유모 세포에 의해 감지 된 다음 청각 신경절 (AG, 포유류에서는 나선형 신경절이라고도 함)으로 전달됩니다. AG의 양극성 뉴런은 말초 과정으로 유모 세포를 자극하고 차례로 중앙 투영 (청각 신경)을 뇌간으로 보내 두 개의 주요 달팽이관 핵 인 마그노 셀룰라 핵 (NM)과 각진 핵 (NA)에서 끝납니다. NM의 뉴런은 구조적으로나 기능적으로 포유류 전방 복부 달팽이관 핵의 구형 덤불 세포와 비슷합니다. NM 내에서 청각 신경 섬유(ANF) 시냅스는 헬드 말단22의 큰 말단을 통해 NM 뉴런의 체세포에 있습니다. 발달 동안, NM 뉴런은 후뇌23의 능형 5 및 6 (r5/6)에서 발생하는 반면, AG 뉴런은 이낭24에 존재하는 신경 모세포로부터 유래된다. 여기에서는 시냅스 전 AG 뉴런과 시냅스 후 NM 뉴런에서 FMRP 발현을 선택적으로 녹다운하는 절차를 별도로 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Egg incubation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 &deg; C 냉장고</td><td>MAGAT</td><td></td><td>수정란 저장에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>난자 인큐베이터</td><td>SHANGHAI BOXUN</td><td>GZX-9240MBE</td><td></td></tr><tr>수정<td>란</td><td>농장 중국 남부 농업 대학</td><td></td><td>난자는 최적의 생존력을 위해 일주일 안에 사용해야 합니다.</td></tr><tr><td>Plasmid preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sigma</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Solarbio</td><td>G1661</td><td>증류수와 오토클레이브에서 0.1% 작동 용액을 만듭니다.</td></tr><tr><td>Plasmid Maxi-prep kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td>Tris-EDTA (TE) buffer에 플라스미드 DNA를 용해시킵니다. endotoxin-free 준비 키트</td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>핵분해효소가 없는 물에서 7.5M 작업 용액을 만듭니다.</td></tr><tr><td>Electroporation 및 Doxycycline 투여</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td></td><td>BTX ECM399</td><td></td></tr><tr><td>1 mL / 5 mL 주사기</td><td>광저우 KANGFULAI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>CNOPTEC</td><td>SZM-42</td><td></td></tr><tr><td>Doxcycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>각 용량마다 신선한 분주액을 사용하고 -20 & deg;C입니다.</td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>BEIBOBOMEI</td><td>RD0910</td><td>0.9-1.1 mm * 100 mm</td></tr><tr><td>실험실 파라 필름</td><td>PARAFILM</td><td>PM996</td><td>투명 필름</td></tr><tr><td>피펫 풀러</td><td>CHENGDU INSTRUMENT FACTORY</td><td>WD-2</td><td>당기는 조건 : 500 °; C 15s</td></tr><tr><td>플래티넘 elctrodes</td><td>홈 메이드</td><td></td><td>직경 0.5 mm, 1.5 mm 간격.</td></tr><tr><td>고무 튜브</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Dissection and Fixation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>RWD</td><td>F11020-11</td><td>팁 크기: 0.05*0.01 mm</td></tr><tr><td>기타 수술 도구</td><td>RWD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>인산염 완충 식염수에 갓 만든 4% PFA 용액은 4°C에 보관할 수 있습니다. C는 최대 1주일 동안 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>DOW</td><td>01673921</td><td>검은색 배경판의 경우 식품 등급의 탄소 분말이 적용됩니다.</td></tr><tr><td>Sectioning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>LEICA</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td>소 가죽에서.</td></tr><tr><td>슬라이딩 마이크로톰</td><td>LEICA</td><td>SM2010</td><td></td></tr><tr><td>Immunostaining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스</td><td>Abcam</td><td>ab150113</td><td>1:500 희석, RRID: AB_2576208</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 염소 안티 토끼</td><td>Abcam</td><td>ab150078</td><td>1:500 희석, RRID: AB_2722519</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab285390</td><td>1: 1000 희석</td></tr><tr><td>Fluoromount-G 장착 매체</td><td>남부&nbsp; Biotech</td><td>Sb-0100-01</td><td></td></tr><tr><td>FMRP 항체</td><td>Y. Wang, Florida State University</td><td>#8263</td><td>1:1000 희석, RRID: AB_2861242</td></tr><tr><td>Islet-1 항체</td><td>DSHB</td><td>39.3F7</td><td>1:100 희석, RRID: AB_1157901</td></tr><tr><td>Netwell plate</td><td>Corning</td><td>3478</td><td></td></tr><tr><td>신경필라멘트 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4142</td><td>1:1000 희석, RRID: AB_477272</td></tr><tr><td>Parvalbumin 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3088</td><td>1:10000 희석, RRID: AB_477329</td></tr><tr><td>SNAP25 항체</td><td>Abcam</td><td>ab66066</td><td>1:1000 희석, RRID:</td></tr> <tr><td>AB_2192052Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe photoshop</td><td>ADOBE</td><td></td><td>이미지 편집 소프트웨어</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>LEICA</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>형광 실체 현미경</td><td>OLYMPUS</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Image-Pro Plus 7.0</td><td>OlYMPUS</td><td></td><td>상용 이미지 처리 소프트웨어 패키지</td></tr></tbody></table>

in ovo 전기천공에 의한 청각회로에서 깨지기 쉬운 x 정신지체 단백질의 세포 자율 기능 해부

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

깨지기 쉬운 X 정신 지체 단백질 (FMRP)은 국소 단백질 번역을 조절하는 mRNA 결합 단백질입니다. FMRP 손실 또는 기능 장애는 지적 장애, 감각 이상 및 사회적 의사 소통 문제를 특징으로 하는 취약 X 증후군(FXS)에서 비정상적인 신경 및 시냅스 활동을 유발합니다. FMRP 기능 및 FXS 발병 기전에 대한 연구는 주로 형질 전환 동물에서 Fmr1 (FMRP를 코딩하는 유전자) 녹아웃으로 수행되었습니다. 여기에서 우리는 닭 배아를 사용하여 회로 조립 및 시냅스 형성 기간 동안 FMRP의 세포 자율 기능을 결정하는 생체 내 방법을 보고합니다. 이 방법은 Fmr1 소형 헤어핀 RNA(shRNA) 및 EGFP 리포터를 포함하는 약물 유도성 벡터 시스템의 단계, 부위 및 방향 특이적 전기천공을 사용합니다. 이 방법을 통해 우리는 청각 신경절 (AG)과 뇌간 표적 중 하나 인 핵 목장 세포 (NM)에서 선택적 FMRP 녹다운을 달성하여 AG-NM 회로 내에서 구성 요소 별 조작을 제공했습니다. 또한 형질주입의 모자이크 패턴은 동물 내 대조군과 이웃 뉴런/섬유 비교를 가능하게 하여 데이터 분석의 신뢰성과 민감도를 향상시킵니다. 유도성 벡터 시스템은 축적된 발달 효과를 최소화하기 위해 유전자 편집 발병의 시간적 제어를 제공합니다. 이러한 전략의 조합은 시냅스 및 회로 개발에서 FMRP의 세포 자율 기능을 해부하는 혁신적인 도구를 제공합니다.

다른 부위와 다른 발달 단계에서 난자 전기 천공을 수행함으로써 우리는 청각 주변부 또는 청각 뇌간에서 선택적 FMRP 녹다운을 달성했습니다.
NM의 FMRP 녹다운 닭 Fmr1에 대한 작은 헤어핀 RNA (shRNA)를 앞서 기술된 바와 같이 Tet-On 벡터 시스템 내로 설계하고 클로닝하였다20. in ovo 전기천공을 위한 설정은 그림 1A에 나와 있습니다. 빠른 녹색으로 착색 된 플라스미드 DNA를 HH12에서 r5 / r6 수준으로 신경관에 주입했습니다 (그림 1B-C). 백금 양극성 전극을 r5/6 수준에서 신경관의 양쪽에 배치했습니다(그림 ...

난자 전기천공을 사용하여 닭 배아의 청각 내이와 달팽이관 핵을 선택적으로 형질감염시켜 회로 조립의 개별 기간 동안 깨지기 쉬운 X 정신 지체 단백질의 세포 그룹 특이적 녹다운을 달성하는 방법을 고안했습니다.

In ovo 전기천공에 의한 청각회로에서 깨지기 쉬운 X 정신지체 단백질의 세포 자율 기능 해부

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to ...

우리의 프로토콜은 개발 중 FMRP의 세포 자율 기능을 조사하는 생체 내 방법입니다. 이것은 취약 X 증후군의 세포 유형 특이적 병태생리학을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 Fmr1 작은 헤어핀 RNA를 포함하는 약물 유도성 벡터 시스템의 스테이지, 부위 및 방향 특이적 전기천공을 사용합니다.이 방법을 사용하면 청각 회로에서 선택적 FMRP 녹다운을 달성합니다. 이 방법은 청각 회로나 전정계에서 다른 유전자의 기능을 조사하는 데에도 적용할 수 있습니다. 쉽게 조작할 수 있도록 난자를 난자 상단에 배치하기 위해 난자를 수평으로 배치하는 것으로 시작합니다.신경관 형질감염을 위해 햄버거와 해밀턴 또는 HH 단계 12가 될 때까지 섭씨 38도에서 46 내지 48시간 동안 배양하고, 이낭 형질감염을 위해 HH 13까지 54 내지 56시간 동안 배양한다. 인큐베이터에서 한 번에 12 개의 알을 제거하십시오. 알을 인큐베이터에서 1시간 이상 방치하면 발달 변화가 발생하고 생존력이 감소합니다.손전등을 사용하여 계란 바닥에서 빛을 비추십시오. 배아의 위치는 달걀 껍질에 어두운 영역으로 나타납니다. 달걀 껍질에 배아의 위치를 연필로 표시하십시오.75 % 에탄올이 함유 된 거즈로 계란을 닦고 가위 끝을 사용하여 계란의 뾰족한 끝에 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 18 게이지 바늘 주사기로 2 밀리리터의 알부민을 제거하십시오. 구멍이 바늘 삽입을 허용할 만큼만 큰지 확인하십시오.새는 알부민을 거즈로 닦아내고 투명 테이프로 구멍을 막으십시오. 연필로 표시된 어두운 부분을 중심으로 투명 테이프로 계란 상단을 덮어 균열을 최소화하고 창 작업 중에 떨어지는 껍질 파편을 방지합니다. 75 % 에탄올이 함유 된 거즈로 모든 수술 도구를 닦고 테이프로 덮인 부위를 75 % 에탄올로 닦으십시오.작은 가위를 사용하여 연필 자국 둘레에 1-2 평방 센티미터의 창을 자릅니다. 아래의 배아가 손상되지 않도록 가위를 평평하게 잡으십시오. 창이 있는 달걀을 10X 접안렌즈와 2X 줌이 있는 실체 현미경 아래에 놓습니다.1 밀리리터 주사기에 잉크 용액을 채운 다음 27 게이지 바늘을 맞 춥니 다. 집게로 바늘을 45도 각도로 구부립니다. 현미경으로 불투명 한 부위의 가장자리에서 조심스럽게 찌르고 배아 아래에 바늘을 삽입하십시오.배아 시각화를 위해 pellucida 영역 아래로 확산되는 약 50 마이크로 리터의 잉크를 주입합니다. 잉크는 배아의 명확한 시각화를 위해 어두운 배경을 형성합니다. 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관을 피펫으로 당깁니다.해부 현미경으로 모세 혈관 바늘의 끝을 집게로 직경 10-20 마이크로 미터로 조심스럽게 엽니 다. 사용할 때까지 피펫을 보관 상자에 보관하십시오. 다음으로, 피펫 끝에 있는 고무 튜브를 통해 부압을 인가하여 0.5 내지 1 마이크로리터의 플라스미드 혼합물로 모세관 피펫을 주사기로 채운다.배아가 꼬리를 가까이에 두고 수직으로 향하도록 현미경 아래에 알을 놓습니다. 한 손으로 또는 3축 매니퓰레이터로 모세관 피펫을 잡고 피펫 끝을 마름모꼴 5-6으로 구동합니다. 꼬리에서 머리 방향으로.팁을 vitellin 막을 통해 등쪽 신경관으로 부드럽게 찌른 다음 피펫을 약간 빼서 팁이 신경관의 내강에 있도록 합니다. 착색된 플라스미드가 마름모꼴 5 내지 6으로 완전히 확산되고 마름모꼴 3 및 마름모꼴 4로 확장될 때까지 기압을 가하여 플라스미드 혼합물을 주입한다. 파란색 플라스미드 용액이 누출 없이 신경관 아래로 빠르게 확산될 때 달성되는 성공적인 주입을 확인하십시오.누출이 발생하면 파란색이 빠르게 사라집니다. 주사 직후, 백금 양극성 전극을 신경관의 양쪽에 놓습니다. 전기 천공기로 12V 및 50 밀리 초 지속 시간의 두 펄스를 제공합니다.양극성 전극의 끝에서 기포를 관찰하고 음극에 더 많은 것을 관찰하십시오. 착색 된 플라스미드 혼합물이 전극의 양극 근처의 신경관 조직으로 들어갈 때 달성되는 성공적인 전기 천공을 확인하십시오. 전기 천공 후 바이폴라 전극을 조심스럽게 제거하십시오.달걀 껍질의 창을 2 인치 정사각형으로 미리 자른 투명 필름 조각으로 덮고 75 % 에탄올을 뿌립니다. 계란을 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 다음 계란으로 진행하기 전에 식염수에서 12볼트와 50밀리초 지속 시간의 10-20펄스를 전달하여 양극성 전극을 청소하십시오.현미경으로 배아가 꼬리가 근처에 수직이되도록 계란을 놓습니다. 모세관 피펫을 잡고 오른쪽 이낭을 배측 방향으로 부드럽게 찌릅니다. 이낭이 파란색 용액으로 채워질 때까지 플라스미드 혼합물을 공기 압력으로 주입하십시오.파란색 플라스미드 혼합물이 이낭 내에 갇혀 누출되지 않을 때 달성되는 성공적인 주사를 확인하십시오. 주사 직후, 이낭에 양극성 전극을 놓고 양극과 음극을 각각 이낭의 앞쪽과 뒤쪽에 위치시킵니다. 전기 천공기로 12V 및 50 밀리 초 지속 시간의 두 펄스를 제공합니다.파란색 플라스미드 혼합물이 전극의 양극 근처의 이낭 조직에 들어갈 때 달성되는 성공적인 전기 천공을 확인하십시오. 전기 천공 후 바이폴라 전극을 조심스럽게 제거하고 달걀 껍질의 창을 투명 필름으로 덮으십시오. 마지막으로 계란을 인큐베이터로 되돌립니다.대표 이미지는 배아 2일째 또는 E2에서 신경관 형질감염 및 신상 털기 치료 후 배아 3일째 또는 E3의 예를 보여줍니다. 단면에 Fmr1 shRNA 및 EGFP를 갖는 형질감염된 세포가 여기에 도시되어 있다. EGFP 발현 세포는 신경관과 뇌간의 한쪽에 국한되었습니다. 형질감염된 쪽에 EGFP 발현 핵 마그노셀룰라리스 또는 NM 뉴런이 있는 E15의 단면이 여기에 표시됩니다.반대쪽 측면에서, EGFP 함유 축삭은 핵 층판 또는 NL의 복부 부분에서 보였다. Fmr1 shRNA의 녹다운 효과는 인접한 비형질감염된 뉴런과 비교하여 형질감염된 NM 뉴런에서 FMRP 면역 반응성의 현저한 감소에 의해 검증되었습니다. FMRP 면역 반응성을 갖는 E19의 청각 신경절이 여기에 표시됩니다. 청각 신경절 뉴런은 형질감염되지 않았다.두개골 신경 볏 세포로부터 유래된 일부 신경교 세포를 형질감염시켰다. 대표적인 이미지는 이낭 형질감염 후 청관의 FMRP 녹다운을 보여줍니다. E9의 청각 덕트는 광범위한 EGFP 형광을 나타냈다.횡단면에서, EGFP- 발현 세포는 기저 유두와 청각 신경절에 위치했다. Fmr1 shRNA의 녹다운 효과는 인접한 형질주입되지 않은 유모 세포와 비교하여 형질감염된 유모 세포에서 감소된 FMRP 면역반응에 의해 검증되었습니다. 유사하게, FMRP 면역 반응성은 형질 전환 된 청각 신경절 뉴런에서 크게 감소했다.형질감염된 청각 신경절 뉴런의 중앙 투영은 특성화된 말단 말단이 있는 청각 신경을 통해 뇌간으로 추적되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 가장 중요한 것은 선택적 형질 주입을위한 전기 천공 부위와 방향을 제어하는 것입니다. 이 절차에 따라 단일 세포 유형 충전, 면역 염색, 질량 스펙트럼에 따른 세포 분류 또는 단일 세포 시퀀싱을 수행하여 형태학적 및 생화학적 수준에서의 변화를 나타낼 수 있습니다.이 기술은 또한 줄기 회로에 대한 청각 귀에서 시간적 제어 및 구성 요소 특이성을 가진 다른 유전자의 선택적 편집을 가능하게 하고 전정 시스템을 조작하도록 수정할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

뉴런 이동은 수많은 세포 자율 및 비세포 자율 요인에 의해 조절됩니다.  이 프로토콜은 유전자 변형 마우스의 표현형이 세포 고유 메커니즘의 파괴 또는 뉴런과 환경 간의 상호 작용 손상으로 인한 것인지 여부를 결정하기 위해 자궁 내 전기천공법을 사용하는 방법을 보여줍니다.

단백질 삭제의 유도를 통해 자궁 내 일렉트로는 형질 전환 모델에서 신경 세포의 마이그레이션에 적자를 정의하려면

우리는 배아 쥐 내이에서 달팽이관 이식의 격리 및 배양을 설명하는 방법을 제시합니다.  또한 구형파 전기천공법을 통해 달팽이관 이식으로 유전자를 전달하는 방법을 보여줍니다. 유전자 전달 기술과 결합된 체외 이식 배양을 통해 연구자들은 발달 중 유전자 발현 변경의 영향을 연구할 수 있습니다.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

여기에서는 해마 발달 중 특정 유전자의 조절 메커니즘을 조사하는 도구를 제공하는 프로토콜을 제시합니다. 자궁외 전기천공법(ex utero electroporation) 및 유기형 절편 배양을 사용하면 단세포에서 관심 유전자의 발현을 상향 및 하향 조절하고 발달 과정에서 이들의 운명을 따를 수 있습니다.

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

뇌 결 heterotopia (PNH) 성인에서 대뇌 피 질의 개발 (MCD)의 기형의 가장 일반적인 형태는 그러나 그것의 유전으로 가장 산발적 인 경우 알 수 없는 남아 있다. 우리는 최근 MCDs에 대 한 비 발한 후보자 유전자를 식별 하 고 직접 그들의 원인이 역할 비보를 확인 하는 전략을 개발 했습니다.

배열 CGH, 전체 exome 시퀀싱과 설치류에 Utero에서 Electroporation 뇌 기형에 대 한 원인 유전자를 식별 하는 새로운 전략

청각 기관은 청각을 중재합니다. 여기에서는 발달 중인 닭 청각 기관에서 청각 전구 세포 증식 및 분화를 연구하기 위해 최적화된 수정된 in ovo micro-electroporation 방법을 제시합니다.

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기

이 논문은 단일 세포 수준과 형광 표지 된 뉴런의 흥분성 뉴런의 연결 구조를 설명하는 자궁 전기 (IUE)에서 사용하는 프로토콜을 제공한다. 조직학은 수지상 및 축삭 돌기를 특성화하는 데 사용됩니다. 급성 슬라이스 전체 셀 기록 흥분성을 조사하기 위해 사용된다.

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

조류와 포유류의 청각 뇌간 신경은 빠른 청력 엔코딩에 특화되어있어 정상적인 청력 기능을위한 기본적인 과정입니다. 이러한 뉴런은 배아 뒷다리의 뚜렷한 전구체에서 발생합니다. 우리는 청각 발달 과정에서 유전자 기능을 연구하기 위해 닭 배아의 뒷배부에 유전자를 발현시키기 위해 일렉트로 포 레이션을 이용하는 기술을 제시한다.

닭 오라클 Brainstem의 Ovo Electroporation에서

자궁 전기기화의 이중은 공간적으로 그리고 일시적으로 분리되는 세포 집단을 표적으로 할 수 있습니다. 이 기술은 정상 조건에서 형광 단백질을 사용하여 그 세포 인구 사이 상호 작용을 구상하는 데 유용하지만 기능적 실험 후 관심의 유전자를 어지니로 조정합니다.

자궁에서 두 배의 자궁 전기화는 시간적으로 그리고 공간적으로 분리된 세포 인구를 표적으로 합니다

병아리는 다양한 연구를 위해 비용 효율적이고 접근 가능하며 널리 이용 가능한 모델 유기체입니다. 여기에서는 조류 내이 발달 및 재생의 기초가되는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 일련의 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.

조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서

배우세요 in ovo 전기천공을 이용한 FMRP 세포 자율 기능 분석 방법을. 닭 배아의 청각회로에서 유전자 발현을 선택적으로 조절하여 취약한 X 정신지후증의 병태생리를 규명하는 기술입니다.

In ovo 전기천공에 의한 청각회로에서 깨지기 쉬운 X 정신지체 단백질의 세포 자율 기능 해부

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