Name: 온전한 Zebrafish 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화에 대한 신속하고 효율적인 시공간 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 배우세요 온전한 Zebrafish 배아에서 시토신 메틸화의 시공간 모니터링 방법을. 화학 물질 노출이 5-Methylcytosine 수준에 미치는 영향을 신속하게 분석하여 후성유전학 및 발달생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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연구 지원은 SAB에 UCR 대학원 부문 펠로우십, SAB에 NRSA T32 교육 프로그램 펠로우십(T32ES018827), DCV에 국립 보건원 보조금(R01ES027576) 및 USDA 국립 식량 농업 연구소 해치 프로젝트(1009609)에서 제공되었습니다.

성인 육종가는 리버 사이드에있는 캘리포니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 승인 동물 사용 프로토콜 (# 20180063)에 따라 취급 및 처리되었습니다.
1. 제브라피쉬 배아 수집 및 화학 물질 노출
<ol><li>성적으로 성숙하고 생식 가능한 성인 수컷과 암컷 제브라 피쉬가 들어있는 탱크에 탱크 내 번식 트랩을 추가하십시오. 수거 최소 12 시간 전에 ~ 9 : 00 AM에 6L 탱크 당 최소 3 개의 트랩을 추가하십시오.이 트랩은 탱크 내에서 알의 수정 및 산란의 대략적인 시간입니다.</li>
	<li>수집 아침에 신선한 노출 용액을 준비하십시오. 노출 용액은 5mL 피펫을 사용하고 60mm 유리 페트리 접시에 5.0mL의 무미립자 시스템 수를 추가하여 준비합니다.</li>
	<li>그런 다음 10μL 유리 미세 모세관 피펫을 사용하여 10μL의 비히클(디메틸 설폭사이드 또는 DMSO) 또는 화학 원액을 유리 접시의 시스템 물로 옮깁니다.</li>
	<li>유리 페트리 접시를 소용돌이 치면 저장 용액이 사라집니다. 유리 페트리 접시에 시스템 물 5.0mL를 더 추가합니다. 유리 페트리 접시를 소용돌이 치며 노출 용액을 균질화합니다.</li>
	<li>각 처리 그룹에 대해 4회 반복하여 치료당 4회 반복을 생성합니다.</li>
	<li>노출 용액을 준비한 후 증발을 최소화하기 위해 유리 뚜껑으로 유리 접시를 덮으십시오.</li>
	<li>각 탱크에서 번식 트랩을 제거하는 동안 탱크에서 제거하기 전에 각 트랩 내의 물이 탱크로 배출되도록 주의하십시오. 트랩이 오른쪽이 위로 향하도록 하십시오.</li>
	<li>번식 트랩을 실험실 싱크대로 옮기고 역삼 투 (RO) 물로 채워진 분출 병을 사용하여 이전에 10 % 표백제에 담그고 물로 헹구어 낸 어망에 헹굽니다. 모든 파편이 제거되고 깨끗한 배아 만 남을 때까지 배아를 헹굽니다.</li>
	<li>RO 물이 채워진 분출 병을 사용하여 어망에서 배아를 100mm 플라스틱 페트리 접시로 옮깁니다. 수정 후 0.75시간(hpf)에 50개의 살아있는 배아를 무작위로 분류하고 과도한 RO 물을 제거합니다.</li>
	<li>미세 주걱을 사용하여 분류 된 배아를 치료 용액에 넣습니다. 모든 배아는 오전 9시 45분 이전에 비히클 또는 치료 용액 내에 있어야 합니다. 유리 접시를 소용돌이 치면 배아가 치료 용액 내에 고르게 코팅됩니다.</li>
	<li>각 처리 그룹에 대해 4 개의 반복 접시 (반복 당 N = 50)를 설정 한 후 유리 뚜껑을 노출 접시 위에 놓고 모든 접시를 2 hpf, 4 hpf, 6hpf, 8 hpf 또는 10 hpf가 될 때까지 28 ° C로 설정된 온도 제어 인큐베이터로 옮깁니다.</li>
	<li>노출 종료 최소 4시간 전에 신선한 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비하고 4°C에서 보관하십시오.<ol><li>핫플레이트를 115°C로 켜고 50mL 원심분리 튜브에 20mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)(2mL의 10x PBS + 18mL의 RO 물)를 만들고 800mg의 파라포름알데히드의 무게를 뽑습니다.</li>
		<li>화학 흄 후드 내에서 1x PBS 용액을 250mL 삼각 플라스크에 옮기고 800mg의 파라포름알데히드를 추가한 다음 2μL의 10N NaOH를 추가합니다. 플라스크 안에 온도계를 놓고 플라스크를 핫 플레이트에 놓고 저으면서 온도를 관찰합니다.</li>
		<li>온도가 62-65°C에 도달하면 핫 플레이트에서 4% PFA를 제거하고 실온(RT)으로 식힙니다. 4% PFA를 4°C에서 보관한다.</li>
	</ol></li>
	<li>노출 기간이 끝나면 인큐베이터에서 배아를 제거하고 모든 살아있는 배아를 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 1mL 피펫을 사용하여 잔류 노출 용액을 흡인합니다. 배아를 흡인하지 마십시오.</li>
	<li>500μL의 냉각된 4% PFA를 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 넣고 여러 번 뒤집어 배아를 4% PFA에 혼합합니다. 배아가 밤새 4 % PFA로 고정되도록하십시오. 참고: 배아가 PFA에 12시간 이상 머무르도록 두는 것은 권장하지 않습니다.</li>
</ol>2. 배아의 탈코리오네이션
<ol><li>다음 날, 4% PFA를 흡인하고, 배아를 1x PBS에 재현탁시키고, 30초 동안 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 필요한 경우 이 단계에서 프로토콜을 중지하고 배아를 4°C의 1x PBS에 최대 48시간 동안 보관합니다.</li>
	<li>플라스틱 전사 피펫을 사용하여 고정 된 배아를 RO 물이 채워진 유리 접시에 조심스럽게 옮기고 30 초 동안 부드럽게 소용돌이 치십시오. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.</li>
	<li>표준 실체 현미경을 사용하여 5.0x 배율의 주사기 바늘을 사용하여 모든 배아를 수동으로 탈균합니다. 바늘 끝을 사용하여 융모막에 구멍을 뚫고 노른자와 세포 덩어리에서 부드럽게 떼어냅니다4.</li>
	<li>배아가 탈육종되면 유리 미세모세관 피펫을 사용하여 최대 25개의 온전한 배아를 하나의 면역화학(IHC) 바구니에 옮기고 IHC 바구니를 96웰 플레이트에 넣습니다. 1mL 피펫을 사용하여 각 웰에서 RO 물을 흡입합니다.</li>
</ol>3. 5-mC 특이 항체를 이용한 면역조직화학
<ol><li>웰당 500μL의 블로킹 완충액(1x PBST + 2% 양 혈청 + 2mg/mL 소 혈청 알부민)에 배아를 재현탁하고 플레이트를 파라필름과 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호합니다. 오비탈 쉐이커(100rpm) 상에서 4°C에서 4시간 동안 배양한다.</li>
	<li>파라필름 랩과 알루미늄을 제거하고 1mL 피펫을 사용하여 각 웰에서 차단 완충액을 흡인합니다. 블로킹 완충액에서 1:100 희석된 단일클론 마우스 항-5-mC 항체 500μL로 교체합니다. 배경 소음을 설명하기 위해 차단 완충액과 함께 인큐베이션될 비히클 대조 배아의 하위 세트를 제외한 모든 배아를 1차 항체와 함께 인큐베이션합니다. 이 단계에서 배아의 무결성을 손상시키거나 배아를 흡인하지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>플레이트를 파라필름 및 알루미늄 호일로 다시 감싸고 플레이트를 오비탈 쉐이커(100rpm)에서 밤새 4°C에서 배양하도록 합니다.</li>
	<li>다음날, 각 웰에서 1차 항체 용액을 제거하고 1x PBS + 0.1% Tween-20(1x PBST)으로 교체합니다. 오비탈 셰이커(100rpm)에서 세척당 15분 동안 1x PBST로 각 웰을 3회 세척합니다.</li>
	<li>1x PBST를 차단 완충액에서 염소 항-마우스 IgG 항체의 1:500 희석으로 대체하고 모든 배아를 2차 항체와 함께 배양합니다. 플레이트를 오비탈 쉐이커(100 rpm) 상에서 밤새 4°C에서 인큐베이션하도록 하였다.</li>
	<li>다음날, 2차 항체를 제거하고, 잔류 용액을 오비탈 쉐이커 상에서 세척 당 15분 동안 1x PBST로 3회 세척한다(100 rpm). 알림: IHC 바스켓이 48x PBS로 채워진 깨끗한 우물에 보관되는 경우 최대 1시간 동안 프로토콜을 중지할 수 있습니다.</li>
	<li>1mL 피펫을 사용하여 각 웰에서 1x PBST를 흡입하고 IHC 바스켓을 RO 물로 채워진 유리 페트리 접시에 넣습니다. 표준 실체 현미경으로 온전한 배아를 96웰 플레이트에 무작위로 분류하여 웰당 하나의 배아를 만듭니다.</li>
	<li>1mL 피펫을 사용하여 개별 웰에서 모든 RO 물을 제거하고 200μL의 1x PBS로 교체합니다. 플레이트를 1 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.</li>
</ol>4. 96웰 플레이트 내 배아의 자동 이미징
<ol><li>투과광 및 FITC에서 2x 대물렌즈로 배아를 고함량 스크리닝 시스템(재료 표)을 사용하여 이미지화합니다. 참고: 각 배아의 형광 이미지는 상기 언급된 배율 및 FITC 필터(19)를 사용하여 자동으로 캡처되었다.<ol><li>자동 초점을 선택하여 카메라의 초점이 플레이트 하단에 있고 하단 두께만큼 오프셋되도록 합니다.</li>
		<li>노출 지속 시간이 100ms인 FITC 파장을 선택하고 자동 초점을 Z 오프셋이 있는 레이저로 설정합니다. 플레이트 획득을 시작하기 전에 여러 웰에서 적절한 이미지 획득을 관찰하고 확인합니다. 알림: 기기는 배아가 포함된 선택된 모든 웰에서 이미지를 자동으로 획득합니다. 96웰 플레이트는 이미지 획득 및 데이터 저장에 약 30분이 소요되었습니다. 획득 기간 동안 이미징 시스템 내의 내부 온도는 RT로 유지되었습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이미지 획득 후 고함량 스크리닝 시스템과 맞춤형 자동 이미지 분석 절차를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다. 96웰 플레이트에서 각 배아를 선택하여 전체 면적과 통합 형광 강도를 분석합니다. 참고: 분석에는 분석에서 데이터 포인트의 오버레이가 포함된 이미지 제공이 포함되었습니다.</li>
	<li>그런 다음 데이터 요소를 표로 만들고 측정 아래로 이동하고 스프레드시트로 데이터 로그 열기 를 선택하여 고함량 심사 시스템에서 내보냅니다. 플레이트 수집 및 데이터 분석 부분은 그림 1에 나와 있습니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>내보낸 스프레드시트를 배포자(dplyr) 패키지를 사용하여 각 웰에 대한 데이터를 정렬, 합산하고 웰 번호로 필터링하는 컴퓨터 프로그램에 업로드합니다. 그런 다음 writexl 패키지를 사용하여 합산된 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다. 5mC 프로그램 코드는 보충 파일 1에 나와 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, H. -Y., Xiong, J., Qi, B. -L., Feng, Y. -Q., Yuan, B. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+existence+of+5-hydroxymethylcytosine+and+5-formylcytosine+in+both+DNA+and+RNA+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals.</a> Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).</li>
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</ol>

저자는이 논문에보고 된 작업에 영향을 미칠 수있는 것으로 알려진 경쟁 재정적 이해 관계나 개인적인 관계가 없다고 선언합니다.

이 프로토콜 중에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 배아를 제거 할 때 발달중인 배아의 이러한 부분은 매우 연약하고 구멍을 뚫기 쉽기 때문에 배아 / 난황낭 / 세포 덩어리의 조직에서 바늘을 멀리 향하게하는 것이 중요합니다. 둘째, 라벨이 붙은 배아를 개별 웰로 옮길 때 유리 피펫을 사용하여 배아가 플라스틱 피펫에 부착되므로 배아를 옮깁니다. 셋째, 전체 장착 IHC를 수행할 때 플레이트가 빛으로부터 보호되는지 확인하십시오. 마지막으로, 전체-장착 IHC 프로토콜을 완료한 후, 플레이트를 이미징 전에 밤새 4°C에서 1x PBS 중에서 배양하도록 허용하는데, 이는 이미징을 방해할 수 있는 자가형광을 최소화할 수 있기 때문이다. 
디코리온화 또는 IHC 동안 절단된 배아가 있는 경우 프로토콜의 나머지 부분에서 이러한 배아를 제외합니다. 형광이 검출되지 않으면 더 오래 (최대 16 시간) 배양하여 해결할 수 있습니다. 이것은 5-mC 특이적 항체이기 때문에 DNA와 RNA ...

효소 변형은 시토신의 활성 메틸화 및 탈메틸화를 5-메틸시토신(5-mC)으로 유도하고 후속 5-mC를 5-하이드록시메틸시토신, 5-포르밀시토신 및 5-카르복실시토신 1,2로 산화시킵니다. 트리스 (1,3- 디클로로 -2- 프로필) 포스페이트 (TDCIPP)는 미국에서 널리 사용되는 난연제로, 수정 후 0.75 시간 (HPF)에서 조기 위장 (6 hpf)까지 초기 배아 노출 후 시토신 메틸화의 궤적을 변경하는 것으로 이전에 입증되었습니다.3,4,5,6,7,8 . 척추동물 내에서 5-mC와 그 변형된 유도체는 초기 배아 발달을 조절하는 데 중요합니다9. 배아의 수정은 부모 DNA의 탈메틸화를 유발하고, 모체 mRNA 분해, 접합체 게놈 활성화 및 접합체게놈의 재메틸화를 유발합니다9. 시토신 메틸화를 활용하는 생물학적으로 관련된 과정에는 히스톤 변형, 전사 기계의 모집, RNA 메틸화, 후성유전학적 재프로그래밍 및 염색질 구조10,11의 결정이 포함됩니다. 시토신 메틸화는 또한 척추동물 종들 사이에서 보존되며, 비정상적인 시토신 메틸화가 유기체의 발달 궤적에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 이해하고 조사하는 것의 중요성을 강조합니다11. 또한, 자궁 내 발달은 산모의 노출에 민감하며 즉각적인 표현형 결과, 성인 질병 감수성에 대한 장기적인 영향 및 유전 된 후성 유전 학적 표시의 세대 간 영향과 같은 불리한 결과를 초래할 가능성이 있습니다12,13,14.
시토신-구아닌 쌍 또는 CpG 섬의 긴 스트레칭은 게놈15,16,17에 걸친 시토신 메틸화의 역학을 특성화하는 것을 목표로 하는 연구자의 주요 초점이었습니다. 전체 게놈 중아황산염 시퀀싱, 감소된 표현 중아황산염 시퀀싱 및 중아황산염 앰플리콘 시퀀싱과 같은 중아황산염 기반 전략은 염기쌍 분해능에서 시토신 메틸화를 조사하기 위한 황금 표준을 나타냅니다. 그러나 시퀀싱 기반 접근 방식은 비용이 많이 들기 때문에 발달 단계에 걸쳐 시토신 메틸화를 모니터링하고 화학 물질당 여러 농도를 모니터링하고 치료당 배아를 복제하는 기능을 배제합니다. 또한 시퀀싱 기반 접근 방식은 공간 국소화에 대한 정보를 제공하지 않으며, 이는 잠재적으로 영향을 받는 세포 유형 및 발달 중인 배아 내 영역을 이해하는 데 중요합니다. 유사하게, 메틸화 의존적 제한 분석, 5-mC 효소 결합 면역 분석법 (ELISAs) 및 5-메틸-2'-데옥시시티딘 (5-mC) 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)과 같은 글로벌 DNA 메틸화 분석은 세포 또는 조직 균질물에 의존하며, 따라서 손상되지 않은 표본12,18 내에서 공간 및 시간에 따른 시토신 메틸화의 국소화 및 크기를 모니터링하는 능력을 배제합니다.
자동화된 생체 내 이미징의 용이성, 유전자 조작, 빠른 자궁 외 발달 시간 및 배아 발생 중 축산으로 인해 제브라피쉬 배아는 초기 배아 발달 동안 불리한 결과에 기여하는 이물질적 매개 경로를 밝히기 위해 생리학적으로 온전한 모델로 계속 널리 사용되고 있습니다. 따라서 아래 프로토콜은 5-mC에 특이적인 시판되는 항체를 사용하여 전체 마운트 면역조직화학(IHC), 자동화된 고함량 이미징 및 통계 분석 전에 프로그래밍 언어를 사용한 효율적인 데이터 처리를 활용하여 개별 온전한 제브라피쉬 배아 내에서 시토신 메틸화의 빠르고 효율적인 시공간 모니터링을 위한 비용 효율적인 전략을 설명합니다.
현재 지식에 따르면,이 방법은 손상되지 않은 제브라 피쉬 배아 내에서 5-mC를 모니터링하는 최초의 방법입니다. 이 방법은 세포 덩어리 내에서 DNA 메틸화의 검출을 가능하게하고 또한 모체에서 접합체로의 전이 동안 노른자 국소화 된 모체 mRNA의 시토신 메틸화를 검출 할 수있는 능력을 갖는다. 전반적으로, 이 방법은 후성유전학적 재프로그래밍 동안 현장에서 시토신 메틸화를 방해할 가능성이 있는 화학물질을 신속하게 식별하는 데 유용할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>540225</td><td></td></tr><tr><td>10-&micro; L 유리 마이크로캐필러리 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>211762B</td><td></td></tr><tr><td>100-mm 플라스틱 페트리 디쉬</td><td>Fisher Scientific</td><td>08757100D</td><td></td></tr><tr><td>10x 인산염 완충 식염수&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>1mL 피펫&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13690032</td><td></td></tr><tr><td>250mL 삼각 플라스크</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB501250</td><td></td></tr><tr><td>5mL 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13690033</td><td></td></tr><tr><td>뚜껑이 있는 60mm 유리 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>08747A</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>720089</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG 항체&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP67110</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2311</td><td></td></tr><tr><td>핫플레이트&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1110016SH</td><td></td></tr><tr><td>In-tank breeding traps</td><td>Aquatic Habitats</td><td>N/A</td><td>이 제품은 Pentair의 Aquatic Habitats 인수 이후 더 이상 사용할 수 없습니다.&nbsp; 조사관은 여러 공급업체에서 제공하는 표준 오프 시스템 사육 탱크를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>투과광과 FITC 필터가 장착된 모든 High-Content Screening 시스템이 적합합니다.</td></tr><tr><td>면역화학(IHC) 바스켓</td><td>해당 없음</td><td>해당</td> 없음 <td>원뿔형 부분이 제거되고 바닥에는 24웰 또는 48웰 플레이트용 크기의 메쉬가 장착된 마이크로 원심분리기 튜브를 사용하여 사내에서 제조됩니다.</td></tr><tr><td>메타익스프레스 6.0.3.1658&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>전체 면적과 통합 형광 강도를 정량화할 수 있는 모든 소프트웨어가 적합합니다.</td></tr><tr><td>마이크로스파튤라</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>2140115</td><td></td></tr><tr><td>단클론 마우스 항-5-mC 항체</td><td>밀리포어 시그마</td><td>MABE146</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>오비탈 쉐이커&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>50998290</td><td></td></tr><tr><td>파라필름&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1337412</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>18612139</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 이송 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>1368050</td><td></td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>RStudio</td><td>N/A</td><td>RStudio는 오픈 소스 소프트웨어이며 https://www.rstudio.com 에서 다운로드할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>양 세럼</td><td>Millipore Sigma</td><td>S3772-5ML</td><td></td></tr><tr><td>스테레오현미경</td><td>Leica</td><td>10450103</td><td></td></tr><tr><td>온도 조절 인큐베이터&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>PR505755L</td><td></td></tr><tr><td>트윈-20&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

온전한 zebrafish 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화에 대한 신속하고 효율적인 시공간 모니터링

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

시토신 메틸화는 척추동물 종에 걸쳐 고도로 보존되어 있으며 후성유전학적 프로그래밍과 염색질 상태의 핵심 동인으로서 초기 배아 발달에 중요한 역할을 합니다. 효소 변형은 시토신의 활성 메틸화 및 탈메틸화를 5-메틸시토신(5-mC)으로 유도하고 이후 5-mC를 5-하이드록시메틸시토신, 5-포르밀시토신 및 5-카르복실시토신으로 산화시킵니다. 후성유전학적 재프로그래밍은 자궁 발달 중 중요한 시기이며, 산모가 화학 물질에 노출되면 자손 내에서 후성유전체를 재프로그래밍할 가능성이 있습니다. 이것은 잠재적으로 즉각적인 표현형 결과, 성인 질병 감수성에 대한 장기적인 영향 및 유전 된 후성 유전 학적 마크의 세대 간 효과와 같은 불리한 결과를 유발할 수 있습니다. 중아황산염 기반 시퀀싱을 통해 연구자는 염기쌍 분해능에서 시토신 메틸화를 조사할 수 있지만 시퀀싱 기반 접근 방식은 비용이 많이 들기 때문에 발달 단계에 걸쳐 시토신 메틸화를 모니터링하고 화학 물질당 여러 농도를 모니터링하고 치료당 배아를 복제하는 기능을 배제합니다. 자동화된 생체 내 이미징, 유전자 조작, 빠른 자궁 외 발달 시간 및 배아 발생 중 사육의 용이성으로 인해 제브라피쉬 배아는 초기 배아 발달 동안 불리한 결과에 기여하는 이생물 매개 경로를 밝히기 위한 생리학적으로 온전한 모델로 계속 사용됩니다. 따라서 상용 5-mC 특이적 항체를 사용하여 전체 마운트 면역조직화학, 자동화된 고함량 이미징 및 통계 분석 전에 프로그래밍 언어를 사용한 효율적인 데이터 처리를 활용하여 개별 온전한 제브라피쉬 배아 내 시토신 메틸화의 빠르고 효율적인 시공간 모니터링을 위한 비용 효율적인 전략을 설명합니다. 현재 지식에 따르면, 이 방법은 초기 발달 동안 제브라피쉬 배아 내에서 in situ 5-mC 수준을 성공적으로 검출하고 정량화한 최초의 방법입니다. 이 방법은 세포 덩어리 내에서 DNA 메틸화의 검출을 가능하게하고 또한 모체에서 접합체로의 전이 동안 노른자 국소화 된 모체 mRNA의 시토신 메틸화를 검출 할 수있는 능력을 갖는다. 전반적으로, 이 방법은 후성유전학적 재프로그래밍 동안 현장에서 시토신 메틸화를 방해할 가능성이 있는 화학물질을 신속하게 식별하는 데 유용할 것입니다.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 고정 및 표지된 제브라피쉬 배아 내에서 형광의 전체 면적과 상대적 강도를 평가하여 치료가 5-mC의 상대적 풍부도에 영향을 미치는지 여부를 결정하는 것입니다. 프로토콜을 완료한 후 형광 실체 현미경을 사용하여 먼저 전체 장착 IHC가 성공했는지 여부를 결정할 수 있습니다. 표지된 배아를 FITC 또는 GFP 필터 하에서 관찰할 때, 양성 결과는 배아 내에서 양성 FITC 신호로 표시되는 반면, 음성 결과는 대조군 배아 내에서 형광이 없는 것으로 표시됩니다. 고함량 스크리닝 시스템을 사용하면 FITC 필터를 사용하여 이미지를 획득하는 동안에도 이러한 결과를 확인할 수 있습니다. 또한 데이터 분석 중에 맞춤형 모듈은 형광의 전체 면적과 통합 강도를 식별하고 정량화합니다. 성공적인 결과의 대표적인 이미지는 그림 1에 나와 있으며, 획득 된 이미지는 맞춤형 모듈에 의해 성공적으로 측정되었으며 개별 데이터 포인트 (파란색 오버레이로 표시됨)는 전체 면적과...

이 논문은 온전한 제브라피쉬 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화의 신속하고 효율적인 시공간적 모니터링을 위한 프로토콜을 설명합니다.

온전한 Zebrafish 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화에 대한 신속하고 효율적인 시공간 모니터링

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

이 프로토콜은 비교적 빠르고 비용 효율적인 방법뿐만 아니라 자동화된 획득 및 분석을 제공하여 일반적인 후성유전학적 바이오마커인 5-메틸시토신의 저감도 스크리닝을 생성합니다. 이 기술의 주요 장점은 사용자가 모델 및 개발 단계에 맞게 최적화 할 수있는 실험 설계를 제공하는 유연성에 있습니다. 이 기술은 화학 물질 노출이 일반적으로 시퀀싱과 같은 값 비싼 높은 trpA 방법을 통해서만 수행 할 수있는 개발 유기체 내에서 5- 메틸 시토신의 상대적 풍부도를 어떻게 변화시키는 지 감지하는 데 사용할 수 있습니다.이 방법은 환경 자극에 대한 반응으로 5- 메틸 시토신의 후성 유전 적 변화를 이해하기 위해 NCG 방법을 활용하는 것을 목표로하는 모든 연구에 유용합니다. 수집 아침에 신선한 노출 용액을 준비하는 것으로 시작하십시오. 60mm 유리 페트리 접시에 미립자가 없는 시스템 물 5밀리리터를 추가합니다.그런 다음 10 마이크로리터 마이크로 모세관 유리 피펫을 사용하여 10 마이크로리터의 디메틸 설폭사이드 또는 화학 원액을 시스템 용수로 옮깁니다. 유리 페트리 접시를 소용돌이 치면 저장 용액이 사라집니다. 유리 페트리 접시에 5 밀리리터의 시스템 수를 더 넣고 접시를 소용돌이 치며 노출 용액을 균질화합니다.증발을 최소화하기 위해 유리 뚜껑으로 유리 접시를 덮으십시오. 다음으로 RO 물이 채워진 분출 병을 사용하여 어망에서 배아를 100mm 접시로 옮깁니다. 수정 후 0.75 시간에 50 개의 살아있는 배아를 무작위로 분류하고 과도한 RO 물을 제거합니다.노출 기간이 끝나면 인큐베이터에서 배아를 제거하십시오. 모든 살아있는 배아를 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 배아를 흡인하지 않고 잔류 노출 용액을 흡인합니다.500 마이크로 리터의 냉장 된 4 % 파라 포름 알데히드를 넣고 배아를 반전시켜 여러 번 혼합하십시오. 배아가 섭씨 4도에서 밤새 고정되고 4%파라포름알데히드가 되도록 합니다. 배아를 고정한 후 4% 파라포름알데히드를 흡인하고 배아를 1X PBS에 다시 보내고 30초 동안 부드러운 피펫팅으로 혼합합니다.유리 피펫을 사용하여 고정 된 배아를 RO 물이 채워진 유리 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 30초 동안 부드럽게 소용돌이치고 이 세척을 한 번 반복합니다. 5배 배율로 설정된 실체 현미경으로 주사기 바늘을 사용하여 배아를 디코레이트합니다.바늘 끝을 사용하여 chorion을 뚫고 노른자와 세포

rapid-efficient-spatiotemporal-monitoring-normal-aberrant-cytosine

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Somitogenesis는 리듬 발달 과정입니다 공간적 패턴 척추 동물의 태아의 몸 축. 이전에, 우리는이 과정을 드라이브주기 유전자를 관찰하는 형광 기자를 사용하여 형질 전환 제브라 피쉬 라인을 개발했다. 여기, 우리의 문화는 체외에서 시간이 지남에 따라이 라인 및 이미지 자신의 진동을 세포를 분산.

단일 세포의 Zebrafish의 분할 시계의 이미징을위한 분산 Presomitic 중배엽 세포 배양의 생성

제브라 피쉬, 작은 열대어, 척추 발달과 질병 중 유전자 기능 연구를위한 대중적인 모델이되고있다. 표적 유전자의 시간적, 공간적 표현에 의해 결정될...

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

세포와 조직에서 단백질 수준은 종종 단단히 단백질 생산 및 통관의 균형에 의해 조절된다. 광 (FDAP) 후 형광 감쇄를 사용하면, 단백질의 클리어런스 동력학 실험적 생체 내에서 측정 할 수있다.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

유사분열은 모든 살아있는 유기체에 매우 중요하며 결함은 종종 암과 발달 장애로 이어집니다. 이 이미징 프로토콜과 제브라피시를 모델 시스템으로 사용하여 연구원들은 살아있는 척추 동물 유기체의 유사 분열과 유사 분열 과정에 결함이 있을 때 발생하는 수많은 결함을 시각화할 수 있습니다.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

여기에 설명된 프로토콜은 관심 세포 유형에서 선택적으로 발현되는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기반 유전자 인코딩 전압 지시기(GEVI)와 함께 생체 내 시스템에서 제브라피시 배아를 사용하여 가장 비침습적인 생리학적 조건에서 흥분성 세포의 전기적 특성을 연구할 수 있도록 합니다.

살아있는 Zebrafish 배아에서의 바이오 센스 모터 뉴런 멤브레인 잠재력

레이저 스캐닝 현미경 검사 법 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술의 조합 안내 (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) zebrafish 태아 신경 크레스트 마이그레이션의 고해상도, 3 차원, 실시간 영상 캡처 구현 되었습니다.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

Zebrafish 최근 연구 개발 하는 동안 DNA 복제 타이밍을 vivo에서 모델 시스템으로 사용 되었다. 여기 상세한 프로필 복제 타이밍에 zebrafish 태아를 사용 하기 위한 프로토콜. 이 프로토콜 돌연변이, 개별 세포 유형, 질병 모델, 그리고 다른 종에서 복제 타이밍을 공부 하기 쉽게 적응 될 수 있다.

DNA 복제 타이밍 Zebrafish Vivo에서 모델 시스템으로 사용 하 여 프로 파일링

우리는 빠른 스캐닝 컨포칼 현미경을 활용하여 개발 중인 제브라피시 시신경 구조에서 미세아교세포의 실시간 이미징을 수행하는 방법을 시연하여 생체 내에서 이러한 세포의 역학을 분석할 수 있습니다.

Zebrafish 배아에서 Microglia Dynamics의 실시간 이미징 및 특성 분석

광시트 현미경을 사용하여 온전한 융모막 내에서 초기 제브라피시 배아를 이미징하기 위한 샘플 준비 전략이 설명되어 있습니다. 70% epiboly 및 bud 단계에서 배아가 융모막 내에서 획득하는 다양한 방향을 분석하고 광시트 시스템을 사용하여 배아 전체에서 세포 규모의 해상도를 얻기 위한 이미징 전략을 자세히 설명합니다.

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

RASopathies는 RAS-MAPK 경로 과활성화에 의해 발생하는 다계통 유전 증후군입니다. 검증을 기다리는 잠재적인 병원성 변이가 지속적으로 나타나고 있으며, 전임상 근거가 부족하여 치료가 제한됩니다. 여기에서는 Teen-reporter 제브라피시의 라이브 FRET 이미징에 의한 배아 발생 중 RASopathy 관련 ERK 활성화 수준과 약리학적 조절을 테스트하고 교차 검증하기 위한 생체 내 프로토콜에 대해 설명합니다.

Live FRET 현미경 검사 및 면역형광을 통해 초기 제브라피시 누난 증후군 모델에서 ERK 활동 조절을 평가하기 위한 효율적인 프로토콜

이 연구는 개별 제브라피시 배아 심장에서 전 세계 DNA 메틸화를 정량화하기 위한 민감한 면역형광 기반 영상 방법을 확립합니다. 이 방법은 제한된 조직 물질의 문제를 극복하고 비아황산염 변환의 필요성을 우회합니다.

제브라피시 유충 심장에서 전 지구적 DNA 메틸화 검출

배우세요 온전한 Zebrafish 배아에서 시토신 메틸화의 시공간 모니터링 방법을. 화학 물질 노출이 5-Methylcytosine 수준에 미치는 영향을 신속하게 분석하여 후성유전학 및 발달생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

온전한 Zebrafish 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화에 대한 신속하고 효율적인 시공간 모니터링

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