동양 초파리 박트로세라 등쪽의 CRISPR/Cas9 돌연변이 유발에 대한 프로토콜

동양 초파리는 매우 침습적이고 적응력이 뛰어난 해충 종입니다. 기능적 유전자 연구를위한 효과적인 방법은 환경 친화적 인 해충 관리 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 고효율 및 저비용입니다.

우리의 프로토콜은 동양 초파리 연구자를위한 돌연변이 파리를 생성하는 데 유용한 가이드 역할을 할 것입니다. 시작하려면 관심 대상 유전자의 구조를 예측하고 Bactroceras dorsalis 게놈의 생물 정보학 분석을 통해 엑손과 인트론 사이의 경계를 결정합니다. 시판되는 gRNA 합성 키트를 사용하여 설계된 sgRNA를 생성하십시오.

gRNA 생성물을 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁시킵니다. UV 가시광선 분광 광도계를 사용하여 농도를 정량화하고 사용하기 전에 섭씨 80도에서 보관하십시오. B.dorsalis 번데기를 55% 상대 습도, 26.5°C, 14:10 빛/일 주기의 사육 조건으로 플라스틱 케이지에 넣습니다.

성인이 닫히면 설탕과 효모의 혼합물을 물과 함께 음식으로 제공하십시오. 대부분의 성인은 출현 후 10 일 후에 성적으로 성숙합니다. 암컷의 번식력을 향상시키기 위해 30-50 럭스의 빛을 가진 라이트 스탠드를 사용하여 배아 수집의 효율성을 향상시킵니다.

다음으로, 챔버 뚜껑에서 약 200-1mm 떨어진 산란실에 200 메쉬 거즈를 놓습니다. 미세 주입 설정이 준비되면 케이지에 새 산란실을 넣으십시오. 미세한 젖은 솔을 사용하여 10 분마다 배아를 수집하고 자체 제작 한 주사 판에 정렬하십시오.

추가 건조를 피하기 위해 주입하는 동안 배아를 할로 카본 오일에 담그십시오. Cas9 단백질과 상응하는 sgRNA를 각각 마이크로리터당 300나노그램의 농도로 혼합하여 작업 용액을 준비합니다. 그런 다음 1 마이크로 리터의 페놀 레드를 혼합물에 첨가하여 주입 된 배아를 표시하는 편리한 방법으로 사용하십시오.

sgRNA의 분해를 피하기 위해 준비된 혼합물을 얼음 위에 놓습니다. 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 주입 바늘을 준비하십시오. 기포를 도입하지 않고 3 마이크로 리터의 혼합물을 주사 바늘에 첨가하십시오.

그런 다음 마이크로 그라인더를 사용하여 바늘을 열고 사용 설명서에 따라 마이크로 매니퓰레이터에 연결합니다. 인젝터의 매개변수를 Pi로 500헥토파스칼로 설정합니다. Ti는 0.5 초, PC는 200 헥토 파스칼입니다.

객관적인 테이블에 정렬 된 배아가있는 판을 놓습니다. 그런 다음 미세 광학 현미경으로 마이크로피펫 위치를 조정하여 마이크로피펫과 배아를 동일한 평면에 설정합니다. 바늘 끝을 배아의 뒤쪽 또는 식물 기둥에 삽입하십시오.

그런 다음 인젝터에서 페달을 밟아 혼합물을 배아로 전달합니다. 약간 붉은 색의 출현은 혼합물에 페놀 레드가 첨가 되었기 때문입니다. 주입 된 배아가있는 주입 플레이트를 인공 기후 챔버에 넣습니다.

36 시간 후, 부화 한 유충을 미세한 브러시를 사용하여 애벌레 식단으로 옮깁니다. 더 이상 유충이 부화하지 않을 때까지 매일 3-4 번 유충을 수집하십시오. 다음으로, 성숙한 유충을 젖은 모래에 넣어 번데기를하십시오.

번식 단계는 10 일이 걸립니다. 번데기 후, eclosion이 시작되기 전에 번데기를 플라스틱 케이지로 옮깁니다. 신선한 번데기 또는 개별 성인의 단일 중간 다리에서 게놈 DNA를 분리하고 표적 영역을 증폭하기 위해 특정 프라이머를 설계한 후 텍스트 원고에 설명된 사이클링 조건에 따라 중합효소 연쇄 반응 또는 PCR을 수행합니다.

이어서, 정제된 PCR 산물을 서열분석한다. 표적 부위에 인접한 여러 개의 겹치는 피크를 검출하면 성공적인 돌연변이 유발을 시사합니다. 서브클로닝의 경우, 정제된 PCR 산물을 무딘 말단 벡터와 혼합하고 섭씨 25도에서 15분 동안 결찰합니다.

그런 다음 trans-T1 세포를 넣고 30 분 동안 얼음에 놓습니다. 그런 다음 500 마이크로 리터의 LB 배지를 추가하고 흔들면서 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양합니다. 원심분리하여 상청액을 버린다.

펠릿을 다시 현탁하고 LB 플레이트에 펼칩니다. 섭씨 37도에서 밤새 배양을 위해 플레이트를 놓습니다. 그런 다음 시퀀싱을 위해 개별 박테리아 콜로니를 선택하여 돌연변이체의 유전자형을 확인합니다.

본 연구에서, 선택된 유전자의 표적 부위의 예는 제3 엑손에 위치한다. 표적 부위는 고도로 보존되고, 시험관내 전사에서 수득된 합성 gRNA 및 gRNA를 위한 DNA 주형에 대한 겔 전기영동에 의해 단일 밴드를 검출하였다. B. 미세 주사 후 등쪽 생존 및 돌연변이 유발이 여기에 표시됩니다.

PCR 산물을 시퀀싱한 후 G0 개체의 80%가 모자이크 돌연변이입니다. 돌연변이체 스크리닝에서, 8-염기쌍 결실을 갖는 돌연변이체는 아미노산 번역의 조기 종료를 초래하였다. 배아의 뒤쪽 영역이나 식물 극에 바늘을 삽입하는 것은 난자의 생존에 직접적인 영향을 미치기 때문에 중심 단계입니다.

이 기술은 B.Dorsalis의 유전자 기능 영역을 연구하기위한 참고 자료를 제공합니다. 그들은이 방법을 통해 원하는 돌연변이를 빠르게 포착 할 수 있습니다.