Name: 황화수소 생성 박테리아 검출을 위한 민감한 시각적 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 55 s
Description: 배우세요 수정된 비스무트 황화침전법을 사용하여 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 Fusobacterium nucleatum과 Proteus vulgaris의 황화수소 생성을 검출하는 민감한 시각적 방법을. 이 기술은 특수 장비 없이도 박테리아 대사 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 장쑤 고등 교육 기관의 우선 학업 프로그램 개발(PAPD)과 중국 약학 대학의 교육 개혁 연구 프로젝트(2019XJYB18)의 지원을 받았습니다.

1. 박테리아 균주
참고: 이 실험을 위해 살모넬라 파라티피 A, 살모넬라 파라티피 B, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 엔테로코커스 패칼리스, 황색포도상구균, 녹농균 PAO1, 에어로모나스 하이드로필라 YJ-1, 프로테우스 부이가리스 및 폐렴간균을 포함한 9개의 표준 균주가 사용되었습니다(표 1). 살모넬라 파라티피 A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa, 및 Proteus vuigaris는 이전 문헌1에 요약된 바와 같이H2S를 생성할 수 있습니다.
<ol><li>세균 배양의 준비<ol><li>살모넬라 파라티피 A, 살모넬라 파라티피 B, 엔테로코커스 패칼리스, 황색포도상구균, 녹농균 PAO1, 에어로모나스 하이드로필라 YJ-1 및 폐렴간균의 박테리아 콜로니 1개를 Luria-Bertani(LB) 한천 플레이트에서 LB 배지 100mL로 옮기고 박테리아 농도가 약 1 x 109 cells/mL가 될 때까지 37°C에서 12-16시간 동안 배양합니다(OD600 = 1로 표시됨).</li>
		<li>트립티카제 대두 배양액(TSB) 한천 플레이트에서 Fusobacterium nucleatum 및 Proteus vuigaris 의 박테리아 콜로니 1개를 TSB 배지 100mL로 옮기고 박테리아 농도가 약 1 x 109 cells/mL가 될 때까지 37°C에서 24시간 동안 혐기성 배양합니다(OD600 = 1로 표시됨).</li>
	</ol></li>
</ol>2.H2S검출 분석
<ol><li>황화수소 생산 시험<ol><li>박테리아 배양액 100μL와 새로 제조된 비스무트 용액 100μL(pH 8.0; 10mM 염화비스무트(III), 0.4M 트리에탄올아민-HCl, 20mM 피리독살 5-인산 일수화물, 20mM EDTA 및 40mM L-시스테인)를 96웰 마이크로타이터 플레이트에 혼합하고 37°C에서 20분 동안 배양합니다. 각 박테리아 균주에 대해 분석을 세 번 수행하십시오.</li>
		<li>20분 후 색상 변화를 확인합니다. 용액의 색이 연한 노란색에서 검은 색으로 변하면 박테리아가 H2S를 생성 할 수 있음을 나타냅니다.이 측정을 3 번 반복하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>방법의 민감도<ol><li>상이한 농도의 수황화나트륨(NaHS)을 사용하여 방법의 민감도를 결정한다: 2 mM, 1 mM, 0.8 mM, 0.6 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, 0.1 mM 및 0 mM, BS 용액 14와 혼합.</li>
		<li>검은색 BS 침전물의 형성을 관찰하여 HS-/S2- 의 존재를 결정합니다. 색상 생성 없음(-)에서 가장 어두운 검은색 색상 생성(++++++)까지 시각적 척도를 사용하여 웰의 색상을 채점합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Ono, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+hydropersulfide+inactivates+%CE%B2-lactam+antibiotics+with+formation+of+ring-opened+carbothioic+s-acids+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cysteine hydropersulfide inactivates β-lactam antibiotics with formation of ring-opened carbothioic s-acids in bacteria.</a> ACS Chemical Biology. 16 (4), 731-739 (2021).</li>
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<li>Shatalin, K., Shatalina, E., Mironov, A., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2S%3A+A+universal+defense+against+antibiotics+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">H2S: A universal defense against antibiotics in bacteria.</a> Science. 334 (6058), 986-990 (2011).</li>
<li>Schnabel, B., Caplin, J. L., Cooper, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+H2S+test+to+screen+for+the+detection+of+sulphur-+and+sulphate-reducing+bacteria+of+faecal+origin+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Supply%22%5BJournal%5D)">Modification of the H2S test to screen for the detection of sulphur- and sulphate-reducing bacteria of faecal origin in water.</a> Water Supply. 21 (1), 59-79 (2021).</li>
<li>Netzer, R., Ribičić, D., Aas, M., Cavé, L., Dhawan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+priority+bacteria+in+aquaculture+using+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR.</a> Journal of Microbiological Methods. 183, 106171(2021).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

황화수소 생산 시험은 박테리아 균주의 식별 및 분화를위한 기존의 표현형 시험 중 하나입니다. 많은 박테리아 종은 수생수와 같은 자연 환경에서 황화수소를 생성할 수 있습니다. 이러한 박테리아 종에는 살모넬라 종, 시트로박터 종, 프로테우스 종, 슈도모나스 종, 클렙시엘라 종, 대장균의 일부 균주 및 혐기성 클로스트리디아15,16의 일부 종이 포함됩니다. 그러나 전통적인 H2S 테스트 방법의 감도는 낮고 시간이 많이 걸립니다17,18. 전통적인 H2S 시험 배지는 박테리아의 성장에 독성 영향을 미치는 PbAc를 함유하고 있으며, 배양액은 반고체 한천에 펑크 접종됩니다. 배지 하부의 산소 함량...

황화수소 생성 박테리아는 황 함유 아미노산과 단백질을 활용하여 황화수소(H2S)를 생성할 수 있습니다. H2S의 생산은 일반적으로 그람 음성 장내 세균과 박테리아 및 시트로박터 종, 프로테우스 종, 에드워시엘라 종 및 셰와넬라 종 1의 구성원에서 발생합니다. 이 박테리아는 에너지를 얻기 위해 황산염을 황화수소(H2S)로 환원시키는 능력이 있습니다. 황화수소는 박테리아 약물 내성의 발달과 관련이 있습니다. H 2 S는 활성 산소 종 (ROS)의 독성으로부터 박테리아를 보호하여 항생제 2,3의 항균 효과를 길항합니다. H2S는 또한 항상성 유지에 중요한 생리학적 효과를 갖는다. 초생리학적 수준에서 H2S는 신체에 심각한 독성을 나타내는 것으로 나타났습니다. 인체에서 H2S는 다양한 생리 학적 및 병리학 적 과정에 관여하는 가스 신호 분자로서의 또 다른 역할을합니다. H2S는 심장의 수축기 기능을 조절할 수 있으며 혈관을 이완시키고 혈관 리모델링을 억제하며 심근을 보호하는 데 중요한 생리학적 역할을 합니다 4,5. H2S는 또한 신경계와 소화관을 조절하는데 중요한 역할을 한다 6,7. 살균성 항생제에 노출되면 박테리아는 치명적인 활성 산소 종 (ROS)을 생성하여 세포 사멸을 유도한다는 것이 밝혀졌습니다 8,9,10,11.
미생물 실험실 과정에서 일반적인 생화학 적 검사로서 황화수소 검사는 박테리아, 특히 장내 세균과 (Enterobacteriaceae)의 박테리아를 식별하는 중요한 실험입니다. 현재, 황화수소 시험은 일반적으로 시험 할 박테리아를 접종 한 많은 수의 황 함유 아미노산 및 납 아세테이트 배지에 대해 수행됩니다. 배양 기간(2-3일) 후, 결과는 아세트산납 생산으로 인해 배양 배지 또는 아세트산납 종이 스트립이 검게 변하는지 여부를 관찰하여 판단한다11. 그러나 이러한 전통적인 방법은 지루하고 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라 황 함유 배지에서 중금속 염의 독성 효과로 인해 박테리아 성장을 억제하는 경향이 있어 종종 부정적인 결과를 초래합니다. H2S12,13의 검출을 위한 비스무트기반 방법이 확립되었다. H2S는 비스무트와 반응하여 흑색 비스무트 황화물 침전을 형성 할 수 있습니다. 이 생화학적 검사에 대한 개혁을 수행하기 위해서는 박테리아 성장에 부작용이 없는 간단하고 빠른 방법을 확립해야 합니다. 여기에서는 황화비스무트를 기질로 사용하여 시험관 내 환경에서 자란 황화수소 생성 박테리아를 96웰 마이크로타이터 플레이트 형식으로 검출하기 위한 간단한 방법을 설정했습니다.

<table><tbody><tr><td>비스무트 (III) 염화물</td><td>Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd</td><td>7787-60-2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Enterococcus faecalis&nbsp; </td><td>ATCC&nbsp;</td><td>19433</td><td></td></tr><tr><td>푸소박테리움&nbsp; 핵세포&nbsp; </td><td>ATCC&nbsp;</td><td>25586</td><td></td></tr><tr><td>Klebsiella 폐렴&nbsp; </td><td>ATCC&nbsp;</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>L-시스테인</td><td>Amresco</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>프로테우스&nbsp; 부이가리스&nbsp; </td><td>CMCC&nbsp;</td><td>49027</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella paratyphi A</td><td>CMCC</td><td>50001</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella paratyphi B</td><td>CMCC</td><td>50094</td><td></td></tr><tr><td>포도상구균&nbsp; 아우레우스&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>25923</td><td></td></tr><tr><td>트리에탄올아민-HCl</td><td>상하이 알라딘 생화학 기술 Co., Ltd.</td><td>637-39-8</td><td></td></tr></tbody></table>호

황화수소 생성 박테리아 검출을 위한 민감한 시각적 방법

A Sensitive Visual Method for the Detection of Hydrogen Sulfide Producing Bacteria

황화수소(H2S)는 인체 건강에 중요한 역할을 하는 황 함유 아미노산과 단백질의 단백질 분해에서 박테리아에 의해 생성되는 독성 가스입니다. H2S 생산 시험은 중요한 박테리아 생화학 적 동정 시험 중 하나입니다. 전통적인 방법은 지루하고 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라 황 함유 매질에서 중금속 염의 독성 효과로 인해 박테리아 성장이 억제되기 쉬워 종종 부정적인 결과를 초래합니다. 여기에서 우리는 박테리아에서 H2S를 검출하는 간단하고 민감한 방법을 확립했습니다. 이 방법은 96웰 투명 마이크로타이터 플레이트를 사용하는 황화비스무트(BS) 침전의 수정된 버전입니다. 세균 배양을 L-시스테인을 함유한 비스무트 용액과 합하여 20분 동안 배양한 후 흑색 침전물이 관찰되었습니다. H2S에 대한 시각적 검출 한계는 0.2mM이었다. 시각적 색상 변화를 기반으로 H2S 생성 박테리아의 간단하고 처리량이 높으며 신속한 검출이 가능합니다. 요약하면, 이 방법은 박테리아에서H2S생산을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

황화수소 생성 박테리아 검출 H2S시험의 성능은 표 1에 열거된 바와 같이, 선택된 박테리아 균주의 순수 배양물을 사용하여 조사하였다. 결과는 살모넬라 파라티피 B, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 엔테로코커스 패칼리스, 녹농균 및 프로테우스 부이가리스가 검은색 BS 침전물로 H2S를 생성할 수 있는 반면, 살모넬라 파라티피 A, 황색포도상구균, 에어로모나스 하이드로필라 및 폐렴간균은 흑색 침전물을 나타내지 못했다. 가장 빠른 H2S생산은 Fusobacterium nucleatum에서 나타났으며, 최대 색상 생성에 도달했습니다(그림 1).
<strong...

여기에서 우리는 황화비스무트(BS) 침전에 사용되는 수정된 프로토콜로 황화수소 생성 박테리아를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법의 주요 장점은 평가하기 쉽고 특수 장비가 필요하지 않다는 것입니다.

Hydrogen sulfide (H2S) is a toxic gas produced by bacteria in the proteolysis of sulfur-containing amino acids and proteins that plays an important role ...

황화수소 생성 박테리아는 황 함유 아미노산과 단백질을 활용하여 황화수소를 생성할 수 있습니다. 여기에서 우리는 박테리아에서 황화수소를 검출하는 민감하고 간단한 방법을 확립했습니다. 이 방법은 96웰 투명 마이크로타이터 플레이트를 사용한 황화비스무트 침전의 변형된 버전입니다.박테리아 배양액을 L-시스테인을 함유하는 비스무트 용액과 합하여 20분 동안 배양한 결과, 마지막에 검은색 침전물이 관찰되었습니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 연구 조교 인 Wei Zhu가 될 것입니다. 먼저 박테리아 콜로니를 Luria-Bertani 또는 LB 한천 플레이트에서 100밀리리터의 LB 배지로 옮기고 박테리아 농도가 밀리리터당 약 10억 세포가 될 때까지 섭씨 37도에서 12-16시간 동안 배양합니다.Fusobacterium nucleatum 및 Proteus vulgaris의 박테리아 콜로니 1개를 Trypticase 콩 배지 또는 TSB 한천 플레이트에서 TSB 배지 100ml로 옮기고 박테리아 농도가 밀리리터당 약 10억 세포가 될 때까지 섭씨 37도에서 24시간 동안 혐기성 배양합니다. 100 마이크로 리터의 박테리아 배양액과 100 마이크로 리터의 새로 준비된 비스무트 용액을 96 웰 마이크로 타이터 플레이트에 혼합하고 섭씨 37도에서 20 분 동안 배양합니다. 각 박테리아 균주에 대해 분석을 세 번 수행하십시오.20분 후 색상 변화를 확인합니다. 용액의 색이 연한 노란색에서 검은색으로 변하면 박테리아가 황화수소 또는 H2S를 생성할 수 있음을 나타냅니다. 이 측정을 세 번 반복하십시오.황화 비스무트 용액과 혼합 된 다양한 농도의 나트륨 하이드로 설파이드를 사용하여 방법의 민감도를 결정하십시오. 마지막으로, 흑색 황화비스무트 침전물의 형성을 관찰하여 중황화물 및 황화물 이온의 존재를 확인합니다. 색상 생성이 없는 것부터 가장 어두운 검은색 색상까지 시각적 척도를 사용하여 웰의 색상을 채점합니다.황화수소 시험의 성능은 선택된 박테리아 균주의 순수 배양을 사용하여 조사되었습니다. 결과는 살모넬라 파라티피 B, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 엔테로코커스 패칼리스, 녹농균 및 프로테우스 불가리스가 흑색 황화비스무트 침전물로 황화수소를 생성할 수 있음을 나타냅니다. 살모넬라 파라티피 A, 황색포도상구균, 에어로모나스 하이드로필라, 클렙시엘라 뉴모니아는 검은색 침전물을 나타내지 못했습니다.이 방법의 주요 장점은 복제가 쉽고 특수 장비가 필요하지 않다는 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 문서 해안 해양 물 샘플을 수집 및 바이오 매스 농도, 핵산 정화, 세포 풍부, 영양 및 추적 가스 분석 등 다양한 어플 리케이션을위한 스트림을 처리하는 방법을.

해수 샘플링 및 수집

우리는 빠른 세균 검출 및 식별을 위해 전기 센서 분석 방법을 설명합니다. 분석은 리보솜 RNA (rRNA의) 종의 특정 시퀀스 DNA 올리고 뉴클레오타이드 캡처 프로브 작용 센서 어레이를 포함한다. 캡처 프로브와 고추 냉이 과산화 효소 연결된 DNA 올리고 뉴클레오타이드 검출기 프로브 대상 rRNA의의 샌드위치 하이브리드는 측정 전류 측정 전류를 생성합니다.

전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별

출처: Zhu, W., &amp;; Chu, W. 황화수소 생성 박테리아 검출을 위한 민감한 시각적 방법. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 황화수소 생성 박테리아를 신속하게 검출하기 위한 민감한 시각적 방법을 보여줍니다. 노란색에서 검은색으로 색상이 변하는 것은 황화비스무트 형성을 통한 박테리아 활동을 나타냅니다.

출처: Yeung, M., et al. Vibrio parahaemolyticus 및 기타 Vibrio 종의 검출을 위한 보다 민감하고 특이적인 발색 한천 배지 개발. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 비브리오 종을 식별하기 위한 배양 기반 방법을 보여주며, 일반적으로 사용되는 티오황산염-구연산염-담즙염-자당 또는 TCBS 한천에 대한 보다 정확한 대안으로 발색성 한천을 강조합니다. 발색 한천은 종 특이적 효소 활성을 검출하여 비브리오 균주의 우수한 분화를 제공합니다.

비브리오 종의 신속한 검출을 위한 새로운 발색 배지

출처: Anwar, Z., et al. 소매 식품 샘플에서 Clostridium perfringens 독소형의 농축 및 검출. J. Vis. 경험. (2019).이 비디오에서는 아황산염 환원균을 아황산염 함유 한천 배지에서 배양하여 혐기성 성장하여 아황산염을 황화수소로 환원하여 철 이온과 함께 검은색 침전물을 형성합니다. 검은 콜로니는 무균 기술을 사용하여 한천 깊이에서 분리되고 지속적인 혐기성 배양을 위해 신선한 배지로 옮겨집니다.

한천 배양에서 아황산염 환원 혐기성 박테리아를 계대 배양

출처: Stenzler, BR et. al., 수은 및 카드뮴 검출을 위한 혐기성 바이오센서 분석. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 혐기성 조건에서 수은 이온의 생체 이용 분율을 정확하게 측정하기 위해 유전자 조작 박테리아 바이오센서를 사용하는 방법을 보여줍니다. 황산마그네슘의 농도를 변화시킴으로써 이 분석은 형광 강도의 변화로 표시되는 대로 바이오센서가 유리 수은 이온에 선택적으로 반응하도록 보장합니다.

혐기성 조건에서 생체 이용 가능한 수은을 검출하기 위한 박테리아 바이오센서 분석

배지에 박테리아 바이오센서 배양물을 부유시키는 것으로 시작하세요.이 조작된 박테리아는 특정 대변 대사물에 결합하면 형광 리포터 유전자와 관련된 프로모터를 활성화하는 전사 인자를 생성합니다.여기에 숙주-미생물군 상호작용에 관여하는 락테이트와 같은 대사산물을 포함한 여과된 인간 대변 샘플을 추가합니다.이 혼합물을 신선한 배지로 희석하여 최적의 반응량을 유지하세요.흔들리지 않고 인체 장내 환경을 모방하세요.대변 대사산물은 박테리아 세포로 확산되어 전사 인자에 결합합니다.이 복합체는 프로모터에 결합하여 리포터 유전자 발현과 단백질 생산을 촉진합니다.용액을 균일하게 섞어 버퍼에 희석한 후 유세포 분석법을 사용한다.박테리아 세포가 레이저를 통과할 때, 리포터 단백질에서 방출되는 형광은 특정 대변 대사산물의 존재를 확인합니다.

박테리아 바이오센서를 이용한 인간 대변 대사물 검출

출처: Zhang, M. 외, 단일 박테리아 내 중수소 통합 자극 라만 산란 영상을 통한 신속 항균 감수성 검사. J. Vis. Exp. (2022)이 영상은 자극 라만 산란 현미경을 활용해 중수소 표지된 대사 활동을 추적하여 항생제에 대한 감수성을 평가하는 방법을 시연합니다. 탄소-중수소 신호를 모니터링함으로써 내성 및 감수성 박테리아 집단을 신속히 검출할 수 있게 합니다.

자극 라만 산란 현미경을 이용한 박테리아 항생제 감수성 검출

많은 양의 농업용수에서 식품 매개 병원체의 통합 농도, 농축 및 종말점 비색 검출과 관련된 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.  물은 선택적 또는 비선택성 매체로 농축된 MMS(Modified Moore Swabs)를 통해 여과되며, 검출은 박테리아 표시 비색 기판이 내장된 종이 기반 분석 장치(μPAD)를 사용하여 수행됩니다.

색도계 탐지의 종이 기반의<em&gt; 대장균</em&gt;<em&gt; 살모넬라</em&gt; SPP., 그리고<em&gt; 리스테리아</em&gt; 농업 다량의 물에서

액체 원유 샘플의 용존 황화수소 분석을 위한 다차원 가스 크로마토그래피 방법이 제시됩니다. Deans 스위치는 2차 컬럼에서 분리하고 황 화학발광 검출기에서 검출하기 위해 가벼운 유황 가스를 하트 컷하는 데 사용됩니다.

H의 측정<sub&gt; 2</sub&gt; 원유 및 다차원 가스 크로마토 그래피를 이용하여 원유 헤드 스페이스에서 S는 학장은 전환과 황 선택적 검출

과산화수소 (H 2 O2)는 산화 손상의 원인이자 신호 분자입니다. 이 프로토콜은 살아있는 효모에서 유전적으로 인코딩된 비율계량 바이오센서인 미토콘드리아 표적 HyPer7(mtHyPer7)을 사용하여 미토콘드리아H2O2를 측정하는 방법을 설명합니다. 무료로 제공되는 소프트웨어를 사용하여 이미징 조건을 최적화하고 정량적 세포 및 세포 내 분석을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다.

살아있는 효모 세포에서 미토콘드리아 과산화물을 위한 비율계량 바이오센서인 mtHyPer7의 이미징

배우세요 수정된 비스무트 황화침전법을 사용하여 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 Fusobacterium nucleatum과 Proteus vulgaris의 황화수소 생성을 검출하는 민감한 시각적 방법을. 이 기술은 특수 장비 없이도 박테리아 대사 연구에 활용할 수 있습니다.

황화수소 생성 박테리아 검출을 위한 민감한 시각적 방법

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