Name: C. 엘레 간스 면역형광 및 DAPI 염색을 위한 생식선 해부 및 동결 균열 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: 학습하세요 C. elegans 생식선 해부 및 동결 균열을 통한 면역형광 및 DAPI 염색법. 이 방법은 유전학 및 세포생물학 연구에서 고해상도 이미징과 단백질 시각화를 가능하게 합니다.

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Lee 연구실에서의 작업은 국립 보건원의 수상 번호 1R15GM144861과 수상 번호 1R15HD104115의 국립 아동 및 인간 발달 연구소의 지원을 받았습니다. DA는 UML Kennedy College of Sciences Science Scholars 프로그램의 지원을 받았습니다. NW는 UML Honors College Fellowship 및 UMLSAMP Fellowship (보조금 번호 HRD-1712771에 따라 National Science Foundation에서 자금 지원)의 지원을 받았습니다. RAD-51 항체에 대해 A. Gartner에게 감사드립니다. 모든 C. elegans 균주는 Caenorhabditis 유전학 센터에서 제공했으며, 이 센터는 수상 번호P40 OD010440으로 국립 보건원의 연구 인프라 프로그램 사무소에서 자금을 지원합니다.

<ol><li>Newman, D. L., Wright, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%3A+A+play+in+three+acts%2C+starring+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22CourseSource%22%5BJournal%5D)">Meiosis: A play in three acts, starring DNA sequence.</a> CourseSource. 4, (2017).</li>
<li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%3A+An+overview+of+key+differences+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiosis: An overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (5), 015859(2015).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Keeney, S., Giroux, C. N., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis-specific+DNA+double-strand+breaks+are+catalyzed+by+Spo11%2C+a+member+of+a+widely+conserved+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiosis-specific DNA double-strand breaks are catalyzed by Spo11, a member of a widely conserved protein family.</a> Cell. 88 (3), 375-384 (1997).</li>
<li>Rabitsch, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+recruitment+of+two+nucleolar+proteins+is+required+for+homolog+segregation+in+meiosis+I%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinetochore recruitment of two nucleolar proteins is required for homolog segregation in meiosis I.</a> Developmental Cell. 4 (4), 535-548 (2003).</li>
<li>Brown, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+misconceptions+in+meiosis+shown+by+students+responding+to+an+advanced+level+practical+examination+question+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Education%22%5BJournal%5D)">Some misconceptions in meiosis shown by students responding to an advanced level practical examination question in biology.</a> Journal of Biological Education. 24 (3), 182-186 (1990).</li>
<li>Kalas, P., O'Neill, A., Pollock, C., Birol, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+meiosis+concept+inventory%5BTitle%5D)+AND+%22CBE-Life+Sciences+Education%22%5BJournal%5D)">Development of a meiosis concept inventory.</a> CBE-Life Sciences Education. 12 (4), 655-664 (2013).</li>
<li>McDonnel, L. M., Klenz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+genetic+linkage+and+recombination+through+mapping+with+molecular+markers%5BTitle%5D)+AND+%22CourseSource%22%5BJournal%5D)">Teaching genetic linkage and recombination through mapping with molecular markers.</a> CourseSource. 2, (2015).</li>
<li>Wright, L. K., Cortez, P., Franzen, M. A., Newman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+meiosis+with+the+DNA+triangle+framework%3A+A+classroom+activity+that+changes+how+students+think+about+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Teaching meiosis with the DNA triangle framework: A classroom activity that changes how students think about chromosomes.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 50 (1), 44-54 (2021).</li>
<li>Shortlidge, E. E., Bangera, G., Brownell, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Each+to+their+own+CURE%3A+Faculty+who+teach+course-based+undergraduate+research+experiences+report+why+you+too+should+teach+a+CURE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+%26+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Each to their own CURE: Faculty who teach course-based undergraduate research experiences report why you too should teach a CURE.</a> Journal of Microbiology & Biology Education. 18 (2), 18(2017).</li>
<li>Auchincloss, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+course-based+undergraduate+research+experiences%3A+A+meeting+report%5BTitle%5D)+AND+%22CBE-Life+Sciences+Education%22%5BJournal%5D)">Assessment of course-based undergraduate research experiences: A meeting report.</a> CBE-Life Sciences Education. 13 (1), 29-40 (2014).</li>
<li>Lee, T. W., Carpenter, B. S., Birol, O., Katz, D. J., Schmeichel, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pipeline+CURE%3A+An+iterative+approach+to+introduce+all+students+to+research+throughout+a+biology+curriculum%5BTitle%5D)+AND+%22CourseSource%22%5BJournal%5D)">The pipeline CURE: An iterative approach to introduce all students to research throughout a biology curriculum.</a> CourseSource. 6, (2019).</li>
<li>Lu, F. -M., Eliceiri, K. W., Stewart, J., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormClassroom.org%3A+an+inquiry-rich+educational+web+portal+for+research+resources+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sciences+Education%22%5BJournal%5D)">WormClassroom.org: an inquiry-rich educational web portal for research resources of Caenorhabditis elegans.</a> CBE Life Sciences Education. 6 (2), 98-108 (2007).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+window+into+biology%3A+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+I%3A+yeast%2C+Drosophila+and+C.+elegans.+An+Introduction+to+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Caenorhabditis elegans.</a> JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Science+Education+Database.+Biology+I%3A+yeast%2C+Drosophila+and+C.+elegans.+C.+elegans+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. C. elegans Maintenance.</a> JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Lee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web+resources+for+C.+elegans+studies%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Web resources for C. elegans studies.</a> WormBook. , (2005).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Science+Education+Database.+Biology+I%3A+yeast%2C+Drosophila+and+C.+elegans.+RNAi+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. RNAi in C. elegans.</a> JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+worms%3A+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), 35(2019).</li>
<li>Lemons, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inquiry-based+approach+to+study+the+synapse%3A+Student-driven+experiments+using+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Undergraduate+Neuroscience+Education%22%5BJournal%5D)">An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C. elegans.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 15 (1), 44-55 (2016).</li>
<li>Kowalski, J. R., Hoops, G. C., Johnson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+a+collaborative+series+of+classroom-based+undergraduate+research+experiences+spanning+chemical+biology%2C+biochemistry%2C+and+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22CBE-Life+Sciences+Education%22%5BJournal%5D)">Implementation of a collaborative series of classroom-based undergraduate research experiences spanning chemical biology, biochemistry, and neurobiology.</a> CBE-Life Sciences Education. 15 (4), 55(2016).</li>
<li>Mordacq, J., Drane, D., Swarat, S., Lo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+and+teaching%3A+Development+of+course-based+undergraduate+research+experiences+using+a+design-based+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+College+Science+Teaching%22%5BJournal%5D)">Research and teaching: Development of course-based undergraduate research experiences using a design-based approach.</a> Journal of College Science Teaching. 46 (4), (2017).</li>
<li>Palmisano, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+laboratory+module+that+explores+RNA+interference+and+codon+optimization+through+fluorescence+microscopy+using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A laboratory module that explores RNA interference and codon optimization through fluorescence microscopy using Caenorhabditis elegans.</a> bioRxiv. , 344069(2021).</li>
<li>Hillers, K. J., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+meiotic+recombination+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Meiosis%22%5BJournal%5D)">Analysis of meiotic recombination in Caenorhabditis elegans.</a> Meiosis. 557, 77-97 (2009).</li>
<li>Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+analysis+of+meiosis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Meiosis%22%5BJournal%5D)">Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans.</a> Meiosis. 558, 171-195 (2009).</li>
<li>Gervaise, A. L., Arur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+analysis+of+active+ERK+in+the+C.+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal analysis of active ERK in the C. elegans germline.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54901(2016).</li>
<li>Shakes, D. C., Miller, D. M., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 107, 35-66 (2012).</li>
<li>Hillers, K. J., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Wormbook%22%5BJournal%5D)">Meiosis.</a> Wormbook. , ed. The C. elegans Research Community (2017).</li>
<li>Hunter, A. -B., Seymour, E., Laursen, S., Thiry, H., Melton, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunter%2C+A-B+%22Undergraduate+Research+in+the+Sciences%3A+Engaging+Students+in+Real+Science%22">Undergraduate Research in the Sciences: Engaging Students in Real Science</a>. , John Wiley & Sons. (2010).</li>
<li>Wei, C. A., Woodin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Undergraduate+research+experiences+in+biology%3A+Alternatives+to+the+apprenticeship+model%5BTitle%5D)+AND+%22CBE-Life+Sciences+Education%22%5BJournal%5D)">Undergraduate research experiences in biology: Alternatives to the apprenticeship model.</a> CBE-Life Sciences Education. 10 (2), 123-131 (2011).</li>
<li>Elgin, S. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+a+convocation%3A+Integrating+discovery-based+research+into+the+undergraduate+curriculum%5BTitle%5D)+AND+%22CBE-Life+Sciences+Education%22%5BJournal%5D)">Insights from a convocation: Integrating discovery-based research into the undergraduate curriculum.</a> CBE-Life Sciences Education. 15 (2), (2016).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. Elegant. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , ed. The C. elegans Research Community (2006).</li>
<li>Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+timing+of+S+phases%2C+X+chromosome+replication%2C+and+meiotic+prophase+in+the+C.+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line.</a> Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).</li>
<li>Stamper, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DSB-1%2C+a+protein+required+for+initiation+of+meiotic+recombination+in+Caenorhabditis+elegans%2C+illuminates+a+crossover+assurance+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of DSB-1, a protein required for initiation of meiotic recombination in Caenorhabditis elegans, illuminates a crossover assurance checkpoint.</a> PLoS Genetics. 9 (8), 1003679(2013).</li>
<li>Libuda, D. E., Uzawa, S., Meyer, B. J., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+structures+constrain+and+respond+to+designation+of+crossover+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome structures constrain and respond to designation of crossover sites.</a> Nature. 502 (7473), 703-706 (2013).</li>
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저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다. 이 원고의 내용은 전적으로 저자의 책임입니다. 반드시 국립 보건원 (National Institutes of Health) 또는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

유성 생식은 감수 분열의 특수 세포 분열을 통해 생성되는 반수체 배우자의 생성을 필요로합니다. C. elegans는 광학 투명성, 편리한 생식선 해부학 및 강력한 유전학28로 인해 감수 분열의 세포학적 연구에 인기 있는 모델이 되었습니다. 생식력과 배아 치사율을 평가하는 간단한 유기체 실험을 분자 유전학과 결합하여 실험실이나 교실에서 많은 질문을 해결할 수 있습니다. 예를 들어, 교차는 적절한 염색체 분리에 필수적이기 때문에 형성이나 분해를 방해하는 과정은 이수성 배우자를 생성합니다. 차례로, 이수성 (aneuploidy)은 자손을 세거나 배아 치사율을 결정하는 약간 더 복잡한 방법을 통해 쉽게 평가할 수있는 생존 가능한 자손으로 이어진다. 세포학적으로, 크로스오버의 부족은 운동증 동안 관찰되는 DAPI 염색체의 수에 영향을 미칠 것이다. DAPI 염색의 견고성과 채점의 용이성은 세포학 기술을 가르치는 이상적인 실험입니다. 자웅 동체 생식 세포에서 핵의 시간적 공간 레이아웃은 한 순간에 감수 분열의 각 단계에 대한 스냅 샷을 제공합니다. 핵은 생식세포의 원위 유사분열 말단에서 근위 말단으로 진행하는 데 약 54시간이 걸립니다(예를 들어, Jaramillo-Lambert et al.33, Stamper et al.34 및 Libuda et al.35 참조). 감수 분열 진행의 잘 정립 된 타이밍은 펄스 추적 라벨링 또는 DNA 손상 실험을 허용합니다.
DAPI 염색은 거의 항상 작동하기 때문에 형광 현미경 검사에 유용한 기술 제어 역할을 합니다(훈련 중인 현미경 검사자에게 만족을 제공할 수 있음). 항체 염색은 더 가변적일 수 있으며 반복실험 간의 재현성을 측정하는 좋은 척도입니다. C.elegans 생식선은 염색체 구조를 보존하는 동시에 충분한 항체 확산을 허용하는 것 사이의 균형이 필요하기 때문에 일관되게 수정하기 어려울 수 있습니다. 포름알데히드로 고정하면 염색체 형태가 가장 잘 보존되고 파라포름알데히드 앰플에서 신선한 포름알데히드를 준비하면 가장 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다. 포르말린 (37 % 수성 포름 알데히드 및 메탄올)으로부터 제조 된 포름 알데히드를 사용할 수도 있습니다. 고정 강도 및 타이밍은 각각의 항체에 대해 경험적으로 결정될 필요가 있을 수 있다. 대안적인 방법은 단계 2.4에서 포름알데히드 고정을 건너뛰고, 동결-균열 후, -20°C에서 100% 에탄올에 침지하거나, 100% 메탄올에 10분 동안 침지한 후 -20°C에서 10분 동안 100% 아세톤에 침지하는 것을 포함한다. 이러한 수정 조건은 더 나은 항체 침투를 허용하지만 조직 형태에 부정적인 영향을 미칩니다(염색체가 날아가고 더 부풀어 오를 것입니다).
타이밍은 2단계에서 설명한 해부 및 수정 단계에서 매우 중요합니다. 해부 용액의 부피가 너무 작기 때문에 증발은 최종 수정 농도에 영향을 미쳐 다양한 항체 염색을 유발할 수 있습니다. 숙련 된 C. elegans 핸들러는 시작 (2.3 단계)에서 2 분 이내에 슬라이드를 준비하여 수정 (2.4 단계)할 수 있습니다. 주요 기술적 장애물은 동물을 해부 용액 방울로 골라 신속하게 해부하는 능력입니다. 더 큰 볼륨으로 해부하는 방법을 배우는 것이 더 쉬울 수 있습니다. 새로운 연수생은 먼저 유리 배아 염색 접시에 50-200 μL의 해부 용액에 동물을 따는 것으로 시작합니다 (그림 2D). 더 넓은 표면은 좋은 생식선 압출을 위한 이상적인 바늘 위치를 식별할 때 더 많은 기동 공간을 제공하는 반면, 더 많은 양의 액체는 증발을 덜 문제로 만듭니다. 해부 동작에 익숙해지면 교육생은 접시에서 50μL만 사용하여 해부를 시작한 다음 슬라이드에서 20μL로 해부로 전환합니다. 슬라이드에서 해부한 후에는 연수생이 증발을 무시할 수 있을 정도로 4μL에서 작업할 수 있을 만큼 충분히 빨라질 때까지 용액의 양을 빠르게 줄이기 시작할 수 있습니다. 
해부 시기가 여전히 문제가 되는 경우 연수생은 2.3단계에서 해부 용액의 8μL를 해부할 수 있습니다. 그런 다음 2.4단계에서 8μL의 고정 용액을 추가하고 부드럽게 피펫팅하여 완전히 혼합하고(시체가 파손되거나 피펫팅되지 않도록 면밀히 관찰) 혼합 용액에서 8μL를 제거할 수 있습니다. 이 대안적인 접근법은 8 μL의 동일한 최종 부피와 동일한 최종 수정 농도를 초래합니다. 이 부피는 2.5단계에서 동결 균열 동안 시체가 커버슬립과 슬라이드 표면 모두에 접촉하도록 하는 데 중요합니다. 더 큰 해부 부피에서도 각 슬라이드를 준비하는 타이밍이 문제로 남아 있는 경우, 생식계열 면역형광 프로토콜을 위한 현탁 방법이 Gervaise 및 Arur26에 의해 설명됩니다.
제자리 단백질을 시각화하기 위해 면역형광법을 사용하는 주요 한계는 관심 있는 특정 단백질을 표적으로 하는 1차 항체의 가용성입니다. 그러나 태그가 지정된 버전의 단백질이 설계된 경우 이 프로토콜을 조정하여 단백질 태그를 시각화할 수 있습니다. FLAG, HA 또는 GFP와 같은 일반적인 태그를 표적으로 하는 항체가 일반적으로 이용 가능합니다. GFP와 같은 형광 태그는 종종 고정 단계에 의해 소광될 수 있으므로 네이티브 형광 신호 자체에 의존하기보다는 GFP를 표적으로 하는 1차 항체를 사용하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜의 또 다른 한계는 단일 기간 내에 생식세포를 포착한다는 것입니다(난자 생성의 모든 단계는 생식계열 내에서 표시되지만). 따라서이 기술은 난 모세포가 난자 생성을 통해 진행됨에 따라 발생할 수있는 동적 변화를 놓칠 수 있습니다. 그러나 배우자 생성시기는 C. elegans에서 잘 연구되었습니다. 야생형 젊은 성인에서 난 모세포는 생식 세포의 말단 끝 (유사 분열 영역)에서 이완 된33으로 진행되는 데 약 60 시간이 걸립니다. 따라서 맥박 추적 또는 조사와 같은 특정 개입 후 시간 경과를 통해 감수 분열의 여러 단계에서 효과를 관찰 할 수 있습니다.
결론적으로, 이 프로토콜은 C. elegans 생식선 해부와 형광 현미경을 위한 DAPI 및 항체 염색을 설명합니다. 해부 및 고정 (2 단계)은 생성 된 슬라이드 수에 따라 60-90 분이 걸립니다. 항체 염색(3단계)은 대부분 손을 떼고 항체 배양 시간에 따라 최소 7시간에서 1.5일까지 걸릴 수 있습니다. 장착 (4.1-4.7 단계)은 약 15 분이 소요됩니다. 생식계열 염색체와 생식선을 시각화하는 이 일반적인 접근 방식은 항체 또는 형광 태그 시약이 존재하는 경우 모든 단백질의 세포학적 연구에 사용할 수 있습니다. 가장 간단한 형태로, 이완 핵의 DAPI 염색은 감수 분열 재조합에 영향을 미치는 인자를 스크리닝하는 데 사용될 수 있습니다. 자손 수, 수컷 발생률(He 표현형) 및 배아 치사율에 대한 유기체 분석과 함께 이 세포학적 접근 방식은 인구 기반 분석에 대한 단일 세포 대위법을 제공합니다.

감수 분열은 모든 성 생식 유기체 1,2에서 배우자 (난자 및 정자 / 꽃가루)를 만드는 데 사용되는 특수 세포 분열입니다. 교차 재조합은 상동 염색체 사이의 DNA의 상호 교환입니다. 감수 분열은 유전 적 다양성의 중요한 원천을 제공하고 세대를 거쳐 게놈 안정성을 촉진하는 데 필수적입니다. 감수 분열 동안 적어도 하나의 교차를 형성하지 못하는 염색체는 무작위로 분리되어 염색체가 분리되지 않아 잘못된 수의 염색체를 가진 배우자를 생성 할 수 있습니다 - 일반적으로 자손3에 치명적인 상태입니다. 감수 분열 동안, 교차는 프로그램 된 이중 가닥 DNA 파괴4에 의해 유도된다. 이러한 단절의 하위 집합은 세포 분열5를 준비하기 위해 상동 염색체의 방향을 지정하는 데 도움이 되는 교차점(chiasmata)이라고 하는 DNA의 물리적 연결을 제공하는 교차로 복구됩니다. 감수 분열 단계는 모든 진핵 생물에 걸쳐 고도로 보존되어 있으며 염색체 형태로 쉽게 식별 할 수 있습니다.
생물학의 기본 개념인 감수 분열은 학생들이 다양한 생물학 과정에서 여러 번 접하는 주제입니다. 그들은 종종 고등학교에서 감수 분열 염색체 분리의 역학에 소개되는 반면, 대학 수준의 과정은 분리의 세포 생물학과 교차 재조합의 유전 적 영향에 중점을 둡니다. 그러나 감수 분열은 많은 학생들에게 악명 높은 까다로운 개념입니다1. 유전자, DNA, 염색체 및 감수 분열 사이의 관계를 이해하지 못하면 유전 유전에 대한 완전한 이해를 방해하는 학생의 오해와 이해 격차가 발생할 수 있습니다 6,7. 추상적 인 주제에 대한 학생의 이해를 향상시키는 한 가지 방법은 구체적인 실습 활동을 제공하는 것입니다. 예를 들어, 감수 분열을 가르칠 때 강사는 분자 분석8을 모방하는 활동, 학생들이 분자를 조작할 수 있는 3D 모델9 또는 학생들이 직접 분자 안무1를 연기하는 역할극중에서 선택할 수 있습니다. 알려지지 않은 결과와 연구를 통합하는 것은 학생의 이해를 향상시키는 특히 효과적인 방법입니다. 이 관행은 코스 기반 학부 연구 경험(CURE)으로 알려져 있으며 특히 STEM10,11에서 과소 대표되는 그룹에 속한 학생들의 태도와 선택의지를 강화하는 추가 이점이 있습니다. 선충류 벌레 Caenorhabditis elegans는 행동, 생식력 및 유전 적 교배에 대한 교실 연구에 특히 적합하며 학생들에게 생물학적 연구를 소개하는 효과적인 모델입니다12.
C. elegans는 분자 유전학과 간단한 세포 학적 분석을 결합하여 세포 생물학을위한 강력한 모델 유기체를 만듭니다. 또한 생물학 교실 13,14,15에서 사용하기에 특히 적합합니다. 실험실에서 유지 관리가 쉽고 경제적이며 표준 실온 또는 가장 일반적인 배양 온도인 20°C에서 3일마다 수백 마리의 자손을 생산합니다. 중요한 것은 글리세롤 스톡으로 냉동하고 -80 ° C 냉동고에 보관할 수 있으므로 초보 연구원이 저지른 축산 실수를 쉽게 수정할 수 있습니다16. 또한 주석이 잘 달린 게놈은 정방향 및 역방향 유전 기술17,18을 허용하여 C. elegans를 사용하여 분자에서 진화에 이르는 생물학적 질문을 해결할 수 있습니다. 마지막으로, C. elegans 연구자들은 신진 과학자들에게 종종 도움과 조언을 기꺼이 제공하는 지원 커뮤니티를 만들었습니다19. 이러한 장점으로 인해 C. elegans는 다양한 유형의 기관 12,19,20,21,22,23에서 다수의 CURE에 통합되었습니다.
연구 및 교육에 대한 이점 외에도 C. elegans는 감수 분열 및 생식선 발달 연구에 널리 사용되는 모델이되었습니다24,25,26. 이 동물의 광학적 선명도는 세포학적 접근을 단순화하고27, 성인의 경우 생식선은 동물의 거의 절반을 차지하여 연구할 수백 개의 감수 분열 세포를 제공합니다. 생식선에서 감수 분열 생식선 핵은 조립 라인처럼 배열됩니다(그림 1). 유사분열 복제는 생식선의 말단부에서 발생하며, 핵은 수정란이 외음부에서 나오는 생식선의 근위부로 이동하면서 감수 분열 단계를 통해 진행됩니다. 고정 관념의 공간 조직은 또한 감수 분열을 통한 시간적 진행을 나타내기 때문에 염색체 조직과 생식선에서의 위치에 따라 다른 단계를 쉽게 식별 할 수 있습니다. 마지막으로, 감수 분열을 방해하고 이수성 (aneuploidy)을 유발하는 과정은 초보자에게도 특성화하기 쉬운 표현형을 만듭니다 : 불임, 배아 치사율 또는 남성의 높은 발병률 (He 표현형)28.
이것은 C. elegans에서 감수 분열 염색체를 시각화하기위한 간단한 프로토콜입니다. 장착, 해부, 고정 및 항체 염색이 모두 동일한 현미경 슬라이드에서 수행되므로 프로토콜이 간소화되고 거의 완벽한 샘플 회수가 가능합니다. 이 방법은 염색체를 시각화하는 간단한 DAPI 염색에 사용되며 생식선에서 단백질의 국소화를 시각화하기 위해 면역 형광법에 사용할 수 있습니다. 학생들은 기본 해부 현미경을 사용하여 생식선을 해부하고, DNA 또는 면역 형광의 시각화를 위한 전체 마운트 준비를 생성하고, 복합 형광 현미경으로 이미지화합니다. 이 프로토콜은 C. elegans 연구실에서 일하는 고등학생 및 학부생에게 가르쳐졌으며 인문 대학의 CURE에 통합되었습니다12. CURE는 상대적으로 작은 학급 규모를 가졌지 만,이 프로토콜은 웜 균주 및 시약의 상대적으로 저렴한 비용으로 인해 다양한 기관의 수업에 적합합니다. 강사는 사용할 수 있는 해부 현미경의 수에 의해서만 제한됩니다. 이전 구현에서는 학생들이 단일 현미경을 공유하기 위해 세 그룹으로 작업했으며 첫 번째는 해부 연습, 두 번째는 해부 및 DAPI 염색을 구현하고 세 번째는 광시야 형광 현미경으로 슬라이드를 이미지화하는 등 세 번의 90분 세션에 걸쳐 진행되었습니다. 학부 연구에 참여하면 학업 및 개인 학생11,29에게 많은 이점이 있습니다. CURE를 통해 코스에 연구를 포함하면 학생들이 정규 수업 시간 11,30,31 동안 연구에 참여할 수 있으므로 이러한 혜택에 대한 노출이 보다 접근가능하고 공평합니다.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티 토끼 IgG 2 차 항체</td><td>분자 프로브</td><td>711-545-152</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 가열 / 냉각 블록</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z743497</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Gibco</td><td>DF0118 17 0</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 일회용, 5.75 인치</td><td>Fisherbrand</td><td>13 678 20B</td><td>웜 픽 BSA를 만드는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>. 소 혈청 알부민</td><td>VWR</td><td>97061 420</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans 야생형 (조상)</td> <td>Caenorhabditis 유전학 센터</td><td>N2 (조상)</td><td></td></tr> <tr><td>C. elegans kle-2 (ok1151) 돌연변이</td> <td>Caenorhabditis 유전학 센터</td><td>VC768</td><td>이 균주의 전체 유전자형은 다음과 같습니다 : kle-2 (ok1151) III / hT2 [bli-4 (e937) let-?( q782) qIs48] (I;III). 그것은 pharangeal GFP로 표시된 밸런서 염색체와 함께 kle-2 균형을 가지고 있습니다. 동형접합 kle-2 돌연변이를 식별하기 위해 녹색이 아닌 동물을 선택합니다.</td></tr><tr><td>C. elegans spo-11 (me44) 돌연변이</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>TY4342</td><td>이 균주의 전체 유전자형은 다음과 같습니다 : spo-11 (me44)&nbsp; IV / nT1 [qIs51] (IV : V) . 그것은 pharangeal GFP로 표시된 밸런서 염색체와 균형을 이루는 spo-11을 가지고 있습니다. 동형접합 spo-11 돌연변이를 식별하기 위해 녹색이 아닌 동물을 선택하십시오.</td></tr><tr><td>염화칼슘 무수</td><td>VWR</td><td>97062 590</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>시그마 알드리치</td><td>501848300</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 이수화수소나트륨 소금</td><td>Apex Bioresearch 제품</td><td>20 147</td><td></td></tr><tr><td>배아 접시, 유리, 30mm 캐비티</td><td>전자 현미경 서비스</td><td>100492-980</td><td>해부를 연습하는 데 사용됩니다. 해부된 동물은 플라스틱에 달라붙을 수 있기 때문에 유리가 선호됩니다</td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>식품 저장 용기, 플라스틱</td><td>다양한</td><td>n/a</td><td>(1) 상대적으로 평평한 바닥이 있는 플라스틱 용기, 슬라이드가 수평을 유지할 수 있도록 합니다. (2) 밀폐되어 있지만 용기의 내용물을 방해하지 않고 쉽게 제거할 수 있는 뚜껑, 그리고 (3) 길이 약 9인치, 너비 약 6인치의 뚜껑이 선호됩니다</td></tr>. <tr><td>Glass Coplin Jar</td><td>DWK Life Sciences&nbsp; Wheaton</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>소수성 배리어 PAP 펜</td><td>ImmEdge</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech Science</td><td>06 666A</td><td></td></tr><tr><td>레바미솔 염산염</td><td>시그마 Aldrich</td><td>L0380000</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘 무수</td><td>Fisher Chemical</td><td>M65 500</td><td></td></tr><tr><td>바늘, 일회용, 25G</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>14 821 13D</td><td>파란색, 1인치</td></tr><tr><td>NGM 한천, 과립</td><td>Apex Bioresearch 제품</td><td>20 249NGM</td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>베미스</td><td>16 101</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(16% w/v) 수용액</td><td>전자 현미경 과학</td><td>50 980 487</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 인산염 완충 식염수(10x 용액)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 60mm</td><td>Tritech Research</td><td>NC9321999</td><td>비통풍식, 날카로운 모서리</td></tr><tr><td>백금 와이어(90% 백금, 10% 이리듐)</td> <td>Tritech Research</td><td>PT 9010</td><td>웜 픽을 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성</td><td>VWR BDH 화학 물질</td><td>BDH9266 500G</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td><td>성 VWR BDH 화학 물질</td><td>BDH9268 500G</td><td></td></tr><tr><td>프리미엄 커버 안경 18 mm x 18 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-548-AP</td><td>0.13&ndash; 0.17mm 두께</td></tr>의 <tr><td>면도날, 단일 에지</td><td>VWR</td><td>55411 055</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Gold Antifade Mountant</td><td>Molecular Probes</td><td>S36937</td><td>대안: VectaShield Antifade 마운팅 매체(Vector Laboratories, H-1000-10) 또는 ProLong Diamond Antifade(Thermo Fisher Scientific, P36970). ProLong Diamond를 사용하는 경우 밀봉을 위해 매니큐어를 칠할 필요가 없지만 슬라이드는 이미징 전 24시간 동안 경화되어야 합니다.</td></tr><tr><td>아지드 나트륨</td><td>피셔 생물 시약</td><td>BP922I 500</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>피셔 화학</td><td>S271 500</td><td></td></tr><tr><td>인산 나트륨 이염 기성 무수</td><td>시그마 알드리치</td><td>7558 79-4</td><td></td></tr><tr><td>인산 나트륨 이염기성 헵타 하이드레이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>스티로폼 상자</td><td>다양한</td><td>사항 없음</td><td>내부의 대략적인 치수: 길이 12인치, 너비 9인치, 깊이 8인치</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisherbrand</td><td>22 037 246</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151 500</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>20 251</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP337 500</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Apex 생물 연구 제품</td><td>20 254</td><td></td></tr></tbody></table>

c. 엘레 간스 면역형광 및 dapi 염색을 위한 생식선 해부 및 동결 균열

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

C. elegans 생식계열은 부분적으로 해부된 동물에 대한 세포학적 분석을 쉽게 수행할 수 있기 때문에 감수 분열을 연구하기 위한 훌륭한 모델을 만듭니다. 전체 마운트 준비는 감수 분열 핵의 구조를 보존하며, 중요한 것은 각 생식선 팔이 감수 분열의 모든 단계를 포함하고 있으며, 시간적-공간적 진행으로 구성되어 있어 여러 단계에서 핵을 쉽게 식별할 수 있다는 것입니다. 성체 자웅동체는 두 개의 생식선 팔을 가지고 있으며, 각각은 원위 폐쇄 끝에 증식하는 생식선 줄기 세포와 자궁 중앙에 합류하는 근위 열린 끝에 세포화된 난모세포가 있는 닫힌 관으로 구성됩니다. 해부는 체강에서 한쪽 또는 양쪽 생식선 팔을 방출하여 감수 분열 전체를 시각화 할 수 있습니다. 여기에서는 관심 단백질에 대한 면역 형광에 대한 일반적인 프로토콜이 제시되고 모든 염색체를 표시하기위한 DAPI 염색이 이어집니다. 젊은 성인은 levamisole에 고정되어 있으며 두 개의 주사기 바늘을 사용하여 신속하게 해부됩니다. 생식계열 압출 후 액체 질소에서 동결 균열을 겪기 전에 샘플을 고정하여 큐티클 및 기타 조직을 투과시키는 데 도움이 됩니다. 그런 다음 샘플을 에탄올에서 탈수하고 재수화하고 1 차 및 2 차 항체와 함께 배양 할 수 있습니다. DAPI는 장착 매체의 샘플에 추가되어 DNA를 안정적으로 시각화하고 형광 현미경으로 이미지화할 동물을 쉽게 찾을 수 있습니다. 이 기술은 해부 방법 자체를 연습하는 데 몇 시간을 보낸 후 C. elegans를 다루는 데 익숙한 사람들이 쉽게 채택할 수 있습니다. 이 프로토콜은 연구실에서 일하는 고등학생 및 학부생에게 가르쳐졌으며 인문 대학의 코스 기반 학부 연구 경험에 통합되었습니다.

DAPI는 DNA에 강하게 결합하며 다양한 조건에서도 염색이 강력합니다 (그림 3A, B). 그것은 모든 핵에 존재해야하므로 슬라이드에있는 웜 조직의 존재와 현미경에서 형광을 검출하는 능력에 대해 효과적인 양성 대조군이됩니다. 염색은 항체가 감수 분열 핵 내에 존재할 때 효과적입니다 (그림 3A, B). 예를 들어, 그림 3A, B 는 DAPI로 염색된 중간 파키틴 핵과 이중 가닥 절단의 마커인 RAD-51을 표적으로 하는 항체를 보여줍니다. KLE-2는 유사분열과 감수분열에 대비하여 염색체를 구성하는 고도로 보존된 단백질 복합체인 콘덴신의 성분입니다. kle-2/+ 돌연변이체는 약간 무질서한 DAPI 염색과 더 많은 수의 RAD-51 초점에 반영된 이중 가닥 절단 수의 증가에서 알 수 있듯이 염색체 구조에 경미한 결함이 있습니다(그림 3B). 면역형광법의 일반적인 실수는 샘플을 수정 용액에 너무 오래 두는 것입니다. 과도한 고정은 일반적으로 항체가 핵으로 확산되는 것을 방지하기 때문에 염색에 실패할 수 있습니다. 이 실수는 항체가 생식선의 세포질 영역에서 확산 될 때 확인 될 수 있지만 핵에서 제외되는 것으로 보입니다.
생식계열(그림 1)에서 핵은 원위 끝에서 유사분열적으로 증식하고, 전이 영역 동안 감수 분열에 들어가고, 디플로텐과 마지막으로 디아키네시스에 들어가기 전에 파키텐(종종 여러 핵 열에 의해 3개의 동일한 단계로 나뉩니다)을 통해 진행됩니다. 이완증의 난모세포는 정자와의 근접성에 따라 번호가 매겨지며, -1 난모세포는 정자에 가장 근접하고 -2 난모세포는 다음 원위부입니다. C. elegans는 6 개의 염색체를 가지고 있으며, 이는 이완 핵에서 조밀 한 타원형으로 나타납니다. 이들 각각은 2가 (도 3C)라고도하는 교차 (chiasma)에 의해 함께 고정 된 두 자매 염색체의 상동 쌍을 나타냅니다 (그림 3C). 교차 형성을 방해하는 spo-11과 같은 돌연변이는 교차 결합을 형성하지 못합니다. 따라서 디아키네시스 핵은 각 자매 염색분체에 대해 하나씩 12개의 개별 DAPI 몸체(단가라고도 함)를 갖게 됩니다(그림 3D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64204/64204fig01.jpg"> 그림 1: 생식계열 핵은 감수 분열을 통한 진행을 나타내는 공간-시간적 방식으로 배열되어 있습니다. (A) DAPI로 염색 된 전체 마운트 젊은 성인 자웅 동체. 생식선과 감수 분열 단계는 원위 끝 (별표)에서 정자 (삼각형)를 포함하는 근위 영역 (화살표로 표시된 -1 난 모세포)까지 윤곽이 그려져 있습니다. 스케일 바는 100 μm를 나타낸다. (B) DAPI로 염색된 해부된 자웅동체 생식선의 투영된 형광 이미지. 감수 분열 단계가 표시되며 대표적인 핵이 인셋으로 표시됩니다 (모든 인셋은 서로 스케일링되는 것으로 표시됨). 핵은 생식계열에서의 위치와 특징적인 염색체 형태에 따라 쉽게 병기될 수 있으며, 원위 끝(별표)의 유사분열 영역에서 파키텐, 디플로텐 및 디아키네시스를 통해 전이 영역으로 진행됩니다. 정자는 삼각형으로 표시됩니다. 이 수치는 Hillers et al. 라이센스 CC BY 3.028. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64204/64204fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64204/64204fig02.jpg"> 그림 2: 해부 설정 데모. (A) 해부 중 현미경 단계. 동물은 홀딩 슬라이드에 놓인 커버 슬립에 4 μL의 해부 용액으로 해부되며, 이는 커버 슬립을 시야로 옮기는 데 사용됩니다. 다이어그램은 이상적인 바늘 배치를 보여줍니다. 바늘은 경 사진 가장자리가 아래를 향하도록 잡고 인두 부위를 교차시킵니다. 분홍색 화살표는 바늘에 대한 가위와 같은 움직임을 보여줍니다. 분홍색 점선은 이상적인 절단 위치를 나타냅니다. (B) 전체 압출 및 불완전 압출의 예와 함께 해부된 동물의 이미지. 압출 된 생식선과 내장의 섹션에는 레이블이 붙어 있습니다. (C) 동결-균열 단계를 나타내는 이미지. 슬라이드는 커버슬립 쪽이 몸에서 반대쪽을 향하도록 한 손으로 단단히 잡아야 합니다. 반대쪽 가장자리는 벤치에 고정되어 있습니다. 면도기는 다른 손으로 잡아야합니다. 분홍색 화살표는 면도기가 슬라이드에서 커버슬립을 튕기는 이동 방향을 나타내며, 커버슬립이 몸에서 멀어지도록 약간 돌립니다. 커버슬립은 한쪽 모서리가 슬라이드의 긴 가장자리에 걸리도록 배치되었습니다. (D) 유리 배아 염색 접시에서 해부 실습을 위한 설정 이미지. 동물을 50-200 μL의 해부 용액에 넣어 증발 문제를 무효화하고 해부 시간을 연장시킵니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64204/64204fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64204/64204fig03.jpg"> 그림 3: 생식계열 핵의 대표적인 형광 결과. (A, B) 야생형 및 (B) kle-2/+ 이형접합체에서 RAD-51 항체(녹색) 및 DAPI(빨간색)로 염색된 후기 파키틴 핵의 Z-스택 투영. (씨,디) (C) 야생형(6개의 DAPI 염색체 포함) 및 (D) spo-11 돌연변이체(12개의 DAPI 염색체 포함)에서 DAPI로 염색된 단일 디아키네시스 핵의 Z-스택 투영. 스케일 바는 5μm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64204/64204fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이것은 항체 염색을 통해 면역형광을 위한 생식계열 샘플을 생성하거나 DNA를 시각화하기 위한 간단한 DAPI 염색을 위해 C. elegans 생식선 해부 후 동결 균열에 일반적으로 사용되는 방법입니다. 이 프로토콜은 연구실과 과정 기반 학부 연구 경험의 학부생에게 성공적이었습니다.

C. 엘레 간스 면역형광 및 DAPI 염색을 위한 생식선 해부 및 동결 균열

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. ...

해부 및 면역 형광을위한이 방법은 많은 C.elegans 실험실에서 사용됩니다. 항체 또는 태그된 융합 단백질을 사용할 수 있는 모든 단백질을 검출하는 데 채택할 수 있습니다. 이 해부를 올바르게 수행하려면 약간의 연습이 필요하지만 이 프로토콜은 유연하고 문제를 해결하기 쉽습니다.우리에게 DAPI 염색은 항상 효과가 있으며 일반적으로 각 항체에 대해 작동하는 조건을 찾을 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 과제는 해부 단계입니다. 좋은 생식계열 압출을 얻으려면 빠르고 자신 있게 작업해야 합니다.연습이 핵심입니다. 시작하려면 해부 현미경 스테이지에 홀딩 슬라이드를 놓고 홀딩 슬라이드 위에 커버 슬립을 놓습니다. 그런 다음 4마이크로리터의 해부 용액을 커버슬립의 중앙으로 피펫팅하고 홀딩 슬라이드를 스테이지의 한쪽으로 이동하여 시야를 확보합니다.NGM 플레이트에서 10-20 개의 자웅 동체를 해부 용액 방울로 선택하십시오. 슬라이드당 약 10개를 선택하는 것이 가장 좋지만 5분 이내에 해부할 수 없을 정도로 많지는 않습니다. 동물을 해부하려면 바늘 끝을 교차시켜 X 모양을 만들고 X의 바닥을 사용하여 성인을 커버 슬립 표면에 고정시킵니다.다음으로, X 모양을 인두 바로 뒤, 젊은 성인의 신체 길이의 약 1/5 또는 머리의 깨끗한 부분 바로 아래에 놓습니다. 그런 다음 한 번의 가위 동작으로 동물의 목을 베고 내장의 한쪽 또는 양쪽 절반과 함께 체강에서 완전히 방출합니다. 포름 알데히드로 샘플을 고정하려면 4 마이크로 리터의 고정 용액을 커버 슬립에 피펫 (discette)으로 피펫 (discette)하여 동물과 함께 방울에 매우 가깝게 피펫팅하고 해부 된 시체를 직접 피펫팅하지 마십시오.한 손가락을 사용하여 커버슬립을 고정 슬라이드에 고정합니다. 다른 손으로 커버 슬립을 부드럽게 몇 번 튕겨 방울을 섞습니다. 양전하를 띤 슬라이드를 앞면이 아래로 향하게 잡고 샘플 방울을 부드럽게 터치하여 슬라이드 중앙의 커버슬립을 들어 올리면 방울의 표면 장력이 커버슬립을 픽업합니다.슬라이드를 벤치에 놓고 실온에서 정확히 5 분 동안 고정하십시오. 이 시간 동안 연필로 슬라이드에 레이블을 지정합니다. 핀셋으로 슬라이드의 레이블이 지정된 가장자리를 잡고 액체 질소를 사용하여 샘플을 동결 균열하려면 액체 질소로 부드럽게 내립니다.슬라이드가 커버슬립 쪽이 위로 향하도록 비커 측면에 기대도록 슬라이드를 놓으면 슬라이드가 10초 이내에 고정됩니다. 드라이 아이스를 사용하여 얼리는 경우 면도기로 알루미늄 블록 표면에서 서리를 긁어 낸 후 슬라이드의 레이블이 지정된 가장자리를 단단히 잡고 깨끗한 표면에 놓고 블록과 완전히 접촉하도록 아래쪽으로 약간의 압력을 가하십시오. 동결은 커버 슬립 아래의 샘플이 얼음으로 변하면서 10 초 이내에 발생합니다.슬라이드의 레이블이 지정된 짧은 가장자리를 단단히 잡고 얼어붙은 슬라이드를 제거하고 긴 가장자리 하나를 벤치에 고정합니다. 다른 손으로 면도기를 단단히 잡고 면도기의 가장자리를 슬라이드 아래로 밀어 덮개 슬립을 샘플에서 튕겨냅니다. 즉시 슬라이드를 95 % 에탄올이 들어있는 코플린 병에 넣고 슬라이드를 에탄올에 5 분 이상 그대로 두십시오.이어서, 슬라이드를 실온에서 각각 5분 동안 PBST로 3회 세척하고, 각각의 세척에 대해 신선한 PBST를 사용한다. 생식계열 핵의 형광 이미징 결과는 DAPI가 DNA에 강하게 결합한다는 것을 보여주었습니다. 면역형광 염색은 이중 가닥 절단에 대한 마커인 RAD-51을 표적으로 하는 항체가 DAPI로 표시된 염색체에 공동 국한된 유사 핵 내에 개별 초점으로 존재할 때 효과적이었습니다.kle-2 이형 접합체 돌연변이체는 약간 무질서한 DAPI 염색 및 이중 가닥 절단 수의 증가로 나타난 바와 같이 염색체 구조에 경미한 결함이 있으며, 이는 더 높은 수의 RAD-51 초점에 반영됩니다. 해부 및 동결 균열 단계는 모두 까다로울 수 있으므로 빠르고 원활하게 작업하는 것이 중요합니다. 전체 프로토콜을 시도하기 전에 이러한 단계를 연습하는 것이 좋습니다.예를 들어, 200 마이크로 리터와 같은 더 많은 양의 액체에서 해부하고 커버 슬립에서 권장 부피 인 4 마이크로 리터까지 점진적으로 작업 할 수 있습니다. 이 기술은 컨포칼 또는 구조화된 조명 현미경에서 고해상도 이미징에 사용하거나 DNA 또는 RNA-FISH, 형광 현장 혼성화와 함께 사용하여 단백질이 특정 서열과 관련하여 어떻게 국소화되는지 시각화할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 동영상은 큐티클을 파괴하여 예쁜꼬마선충 조직이 항체 염색에 접근할 수 있도록 하는 방법인 동결 균열에 대해 설명합니다.

선충의 동결 균열: 염색을 위해 내부 벌레 조직을 노출시키는 방법

이 비디오는 성체 예쁜꼬마선충의 생식선을 해부하여 면역 염색 및 형광 이미징에 적합한 조직을 만드는 방법을 설명합니다.

C. 예쁜꼬마선충 생식선 압출: 빠른 해부 기술

여기에서는 고정되고 손상되지 않은 선충에서 게놈 DNA를 시각화하는 데 사용되는 기술에 대해 설명합니다. 이 비디오에는 수정되지 않은 예쁜꼬마선충 난모세포에서 염색질을 계수하는 프로토콜의 예가 포함되어 있습니다.

에탄올 고정 및 DAPI 염색: 예쁜꼬마선충에서 DNA를 시각화하는 방법

"동결 균열"선충 C.의 내부 조직을 노출시키는 방법 단백질의 지역화를위한 항체의 elegans는 보여줍니다.

항체 염색법에<em&gt; C. 엘레</em&gt; &quot;동결 크래킹 사용&quot;

분리 및 위상 콘트라스트와 형광 현미경으로 이미징 초파리 고환 샘플 (생활하고 고정)을 제조하는 방법이 설명된다.

정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비<em&gt; 초파리</em&gt; 고환

이 프로토콜은 이미지에 예쁜 꼬마 선충 배아의 조직 내에서 세포를 분할하는 방법에 대해 설명합니다. 여러 프로토콜은 초기 배아의 이미지 세포 분열에,이 프로토콜은 어떻게 중순 후반 배아 동안 개발 조직 내에서 세포 분열 이미지에 설명하는 방법을 설명하는 동안.

동안 Neuroblast 세포질 분열을 시각화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 배아

면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

우리는 해부 C.에서 활동 ERK의 공간과 시간 현지화에 대한 면역 형광 이미징 기반의 방법을 제시한다 간스의 생식선. 여기에 설명 된 프로토콜 C. 어떤 시그널링 시각화 또는 구조 단백질을 적용 할 수있다 엘레 생식선은 적절한 항체 시약을 사용할 제공했다.

활성 ERK의 공간 및 시간 분석<em&gt; C. 엘레</em&gt; 생식선

투명 한 선 충 C. 소장"vivo에서 조직 챔버를" 다세포 tubulogenesis 동안 단일 세포 및 subcellular 수준 apicobasal 막과 루멘 속 공부에 대 한 될 수 있습니다. 이 프로토콜 표준 라벨을 결합 하는 방법을, RNAi/손실의 기능 유전자 및 분자 수준에서이 프로세스를 해 부 현미경 접근에 설명 합니다.

C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

여기서, 우리는 후기 배아 초파리 남성 생식선을 생생하게 이미지화하는 데 필요한 해부 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 정상적인 조건 하에서 또는 트랜스제닉 또는 약리학적 조작 후에 동적 세포 과정의 관찰을 허용할 것이다.

후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

초고해상도 현미경은 감수 분열의 시냅톤 복합체 내 구성 요소 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에서는 Caenorhabditis elegans synaptonemal 복합체의 개별 단백질을 해결하기위한 프로토콜을 보여줍니다.

Caenorhabditis elegans 생식계열 내 시냅톤 복합체의 초고해상도 현미경

학습하세요 C. elegans 생식선 해부 및 동결 균열을 통한 면역형광 및 DAPI 염색법. 이 방법은 유전학 및 세포생물학 연구에서 고해상도 이미징과 단백질 시각화를 가능하게 합니다.

C. 엘레 간스 면역형광 및 DAPI 염색을 위한 생식선 해부 및 동결 균열

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