Name: SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인을 표시하는 외막 소포를 기반으로 하는 플러그 앤 디스플레이 나노입자 백신 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 학습하세요 외막 소포를 활용한 "플러그 앤 디스플레이" 나노입자 백신 플랫폼 개발 방법을. SARS-CoV-2 RBD 항원 표시 및 생물학적 결합 기술을 통해 면역 반응을 강화하는 이 백신 전략의 생산·정제·특성화 과정을 상세히 알아보세요.

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이 연구는 충칭 자연 과학 재단의 핵심 프로그램 (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) 및 중국 국립 자연 과학 재단 프로젝트 (No. 31670936, 82041045).

1. 플라스미드 구성
<ol><li>SpyCatcher 서열을 코딩하는 DNA (보충 파일 1)를 BamH I 및 Sal I 부위 사이의 암피실린 내성 pThioHisA-ClyA 플라스미드 (재료 표 참조)에 삽입하여 이전에 발표 된 보고서20에 따라 플라스미드 pThioHisA ClyA-SC를 구축합니다.</li>
	<li>합성된 SpyTag-RBD-Histag 융합 유전자(보충 파일 1)를 BamH I 및 EcoR I 부위 사이의 pcDNA3.1 플라스미드( 재료 표 참조)로 라이게이트하여 이전에 공개된 보고서19에 따라 플라스미드 pcDNA3.1 RBD-ST를 구축합니다.</li>
</ol>2. OMV-SC 준비
<ol><li>아래 단계에 따라 ClyA-SC 변환을 수행합니다.<ol><li>50μL의 BL21 적격 균주에 5μL의 pThioHisA ClyA-SC 플라스미드 용액(50ng/μL)을 추가하고 부드럽게 불어넣고 얼음에서 30분 동안 식힙니다.</li>
		<li>용액을 42°C의 수조에 90초 동안 넣은 다음, 즉시 혼합 용액을 얼음 위에 3분 동안 둔다.</li>
		<li>500 μL의 LB 배지를 박테리아 현탁액에 첨가하고, 혼합 후, 37°C에서 220 rpm에서 1시간 동안 배양한다.</li>
		<li>모든 형질전환된 암피실린(100 μg/mL, 재료 표 참조)을 함유하는 LB 한천 플레이트에 플레이트하고 37°C에서 밤새 배양한다. 참고: 후속 실험에서, 암피실린은 배지에서 동일한 농도로 유지되었다. 그렇지 않으면 박테리아에서 플라스미드가 손실 될 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>OMV-SC 프로덕션의 경우 아래 단계를 수행하십시오.<ol><li>플레이트로부터 단일 콜로니를 분리하고(단계 2.1.4.) 20mL의 LB(암피실린 내성) 배지로 37°C에서 220rpm으로 밤새 배양합니다.</li>
		<li>박테리아 용액(단계 2.2.1에서)을 2L 배지에 접종하고 대수 성장 단계(OD600nm 는 0.6 내지 0.8 사이)가 될 때까지 5시간 동안 220rpm, 37°C에서 배양한다.</li>
		<li>박테리아 용액의 600nm에서의 OD가 0.6-0.8에 도달하면 이소프로필 베타-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG, 재료 표 참조)를 추가하여 박테리아 용액의 최종 농도를 0.5mM로 만든 다음 25°C에서 220rpm으로 밤새 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>OMV-SC 정제를 수행합니다.<ol><li>박테리아 용액을 4°C에서 7,000 x g 에서 30분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>0.22μm 멤브레인 필터로 상청액을 여과한 다음 100kD 한외여과막 또는 중공 섬유 컬럼을 사용하여 농축합니다( 재료 표 참조).</li>
		<li>농축액을 0.22μm 멤브레인 필터를 통해 여과한 다음 초원심분리기(재료 표 참조)를 사용하여 4°C에서 2시간 동안 150,000 x g로 원심분리하고 피펫으로 상청액을 버립니다.</li>
		<li>PBS로 침전물을 재현탁하고 -80 ° C에서 보관하십시오. 이 솔루션은 -80 °C에서 장기 안정성을 유지할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. RBD-ST 준비
<ol><li>아래 단계에 따라 RBD-ST 형질감염을 수행합니다.<ol><li>적절한 진핵생물 발현 시스템 (예를 들어, HEK293F)을 선택하고, 회수 후 세포를 37°C에서 130 rpm으로 밤새 배양한다.</li>
		<li>20μL의 HEK293F 세포 용액을 자동 세포 카운터( 재료 표 참조)에 추가하고 세포 수를 기록하고 농도를 1 x 106 cells/mL로 조정한 다음 37°C에서 130rpm으로 4시간 동안 세포를 배양합니다.</li>
		<li>0.22 μm 멤브레인 필터를 통해 RBD-ST 플라스미드를 여과하고, 최종 부피가 10 mL가 될 때까지 300 μg의 플라스미드를 세포 배양 배지 ( 재료 표 참조)에 첨가하고; 10 초 동안 흔들어주십시오.</li>
		<li>PEI(1mg/mL, 재료 표 참조)를 수조에서 65°C로 가열하고 PEI 0.7mL와 세포 배양 배지 9.3mL를 혼합한 다음 간헐적으로 10초 동안 흔듭니다. 알림: 용액을 세게 흔들지 마십시오. 그렇지 않으면, 생성된 기포가 형질감염 효율에 영향을 미칠 수 있다.</li>
		<li>PEI 용액에 플라스미드 용액을 넣고 혼합물을 10초 동안 간헐적으로 흔든 다음 37°C에서 15분 동안 배양합니다.</li>
		<li>혼합물을 세포 배양 배지 280 mL에 첨가하고 37°C에서 130 rpm으로 5일 동안 배양하였다.</li>
	</ol></li>
	<li>RBD-ST 정제를 수행하십시오.<ol><li>세포를 25°C에서 6,000 x g 에서 20분 동안 원심분리하고 피펫을 사용하여 상청액을 수집한다.</li>
		<li>컬럼에 2mL의 Ni-NTA 아가로스( 재료 표 참조)를 채우고 3x PBS로 3x 세척합니다.</li>
		<li>이미다졸( 재료 표 참조)을 세포 상청액에 첨가하여 최종 농도가 20mM이 되도록 하고 세포 상청액을 2x 로드합니다.</li>
		<li>세척을 위해 20 mM의 이미다졸을 함유하는 PBS의 3 컬럼 부피 (CV)를 첨가하고, 세척 분획을 수집한다.</li>
		<li>저농도 내지 고농도(예를 들어, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M)의 이미다졸을 함유하는 3 CV의 PBS로 구배 용리; 각 농도에 대해 2x 용리합니다.</li>
		<li>SDS-PAGE21 을 사용하여 다양한 농도 구배에서 RBD-ST를 식별합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. OMV-RBD 생체접합 및 정제
<ol><li>BCA 방법으로 단백질 농도를 결정하십시오 ( 재료 표 참조).<ol><li>표준 BSA 단백질 용액을 2 mg/mL에서 0.0625 mg/mL로 연속 희석하고, 정제된 OMV-SC 및 RBD-ST 10x를 희석한 다음, BCA 작업 용액 A와 B(분석 키트에 제공됨)를 50:1(v/v)의 비율로 혼합합니다.</li>
		<li>희석 된 단백질 용액 (25 μL / 웰)을 첨가하고 BCA 작업 용액 (200 μL / 웰)과 혼합한다. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>각 웰의 562 nm에서 흡광도(OD)를 측정하고 표준곡선22로부터 단백질 농도를 계산한다.</li>
	</ol></li>
	<li>아래 단계에 따라 OMV-SC 및 RBD-ST의 생체접합을 수행합니다.<ol><li>PBS에서 OMV-SC와 RBD-ST를 40:1(w/w) 비율로 혼합합니다.</li>
		<li>혼합물을 수직으로 회전시켜 4°C에서 15rpm으로 밤새 블렌딩한다. 알림: 다른 항원은 다른 비율로 반응 할 수 있습니다. 항원의 특성에 따라 다른 반응 비율을 시도할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>반응 효율을 확인합니다.<ol><li>10 μL의 OMV-SC, RBD-ST 및 반응 생성물을 준비한다(단계 4.2). 2.5μL의 5x 로딩 버퍼( 재료 표 참조)를 추가하고 샘플을 100°C에서 5분 동안 가열합니다. 샘플을 겔에 넣습니다(10μL/웰). 60V에서 20 분 동안 전기 영동을 수행하고 1 시간 동안 조건을 120V로 변경하십시오.</li>
		<li>단백질을 겔에서 PVDF 웨스턴 블로팅 멤브레인( 재료 표 참조)으로 100V에서 70분 동안 옮깁니다.</li>
		<li>멤브레인을 5% 무지방 분유/TBST에 넣고 1시간 동안 흔듭니다. 그런 다음 흔들면서 세척 당 5 분 동안 TBST로 3 회 세척하십시오.</li>
		<li>멤브레인을 0.1% His-Tag 항체/TBST( 재료 표 참조)에 넣고 1시간 동안 흔든 다음 흔들면서 세척당 5분 동안 TBST로 3회 세척합니다.</li>
		<li>멤브레인을 0.02% 항-마우스 IgG1 항체(HRP)/TBST( 재료 표 참조)에 넣고 40분 동안 흔든 다음 흔들면서 세척당 5분 동안 TBST로 3회 세척합니다.</li>
		<li>강화 된 화학 발광 용액 ( 재료 표 참조)을 추가하고 멤브레인을 노출시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>OMV-RBD의 정제를 수행합니다.<ol><li>반응된 OMV-RBD 용액 1 mL를 10 mL로 희석하고, 희석물을 4°C에서 150,000 x g 에서 2시간 동안 원심분리한다.</li>
		<li>피펫을 사용하여 상청액을 버리고 10mL의 PBS로 잔류물을 현탁합니다. 현탁액을 4°C에서 150,000 x g 에서 2시간 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>상청액을 버리고 잔류물을 1mL의 PBS로 현탁시킨다. 참고: 항원의 용해도가 훨씬 낮으면, 크기-배제 크로마토그래피(19)에 의해 동일한 분리 효과가 달성될 수 있다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 특성화
<ol><li>동적 광산란(DLS)을 수행합니다.<ol><li>샘플을 100μg/mL 농도로 희석하고 샘플 셀에 샘플 1mL를 추가합니다.</li>
		<li>"측정 유형"에 대해 "크기", "샘플 재료"에 "단백질", "분산제"에 "물", "온도"에 "25 ° C"를 선택한 다음 샘플을로드하고 자동으로23을 측정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 이미지를 캡처합니다.<ol><li>샘플을 100μg/mL로 희석합니다. 200 메쉬 구리 그리드를 가져 와서 20 μL의 샘플을 추가하고 10 분 동안 흡수되도록합니다.</li>
		<li>여과지를 사용하여 용액을 닦아내고 20μL의 3% 우라닐 아세테이트를 지지 필름에 넣고 30초 동안 염색합니다.</li>
		<li>우라닐 아세테이트를 제거하고 실온에서 1시간 동안 필름을 자연 건조시킵니다.</li>
		<li>샘플을 TEM 시스템( 재료 표 참조)에 로드하고 80kV에서 이미지를 캡처합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+a+platform+for+biomedical+applications%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update.</a> Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).</li>
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<li>Needham, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+the+innate+immune+response+by+combinatorial+engineering+of+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).</li>
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<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776(2016).</li>
<li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090(2021).</li>
<li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923(2021).</li>
</ol>

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"플러그 앤 디스플레이" 나노입자 백신 플랫폼을 만들기 위해 SC 융합 ClyA는 단백질 발현24의 장점으로 인해 재조합 단백질 생산에 가장 널리 사용되는 모델 중 하나인 BL21(DE3) 균주에서 발현되어 박테리아 증식 과정에서 OMV 표면에 충분한 SC 단편이 표시됩니다. 동시에, 항원과 OMV 사이의 화학적 결합을 위해 ST-융합 표적 항원을 제조하였다. 이 실험 계획의 장점과 향후 적용 전망은 주로 세 가지 측면에 반영됩니다. 첫째, 서로 다른 항원과 생물학적 나노 입자의 "플러그 앤 디스플레이"시스템이 실현됩니다. 반응 및 정제 과정은 빠르고 간단할 수 있으며, 이는 신흥 전염병 및 기타 시나리오에 대한 백신 개발에 상당한 이점이 있습니다. 둘째, 고밀도 항원 표시의 목표를 달성하고 면역원성이 낮은 일부 항원에 대한 백신 설계 방법을 제공합니다. 셋째, OMV 및 RBD(항원 단백질)의 개별 발현은 기존의 원핵생물 발현 시스템이 특정 보조 인자, 분자 샤페론 및 번역 후 변형과...

잠재적인 백신 플랫폼으로서 외막 소포(OMV)는최근 몇 년 동안 점점 더 많은 관심을 끌고 있습니다1,2. 주로 그람 음성 박테리아3에 의해 자연적으로 분비되는 OMV는 일반적으로 20-300 nm4 크기의 지질 이중층으로 구성된 구형 나노 스케일 입자입니다. OMV에는 박테리아 항원 및 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)을 포함한 다양한 모 박테리아 구성 요소가 포함되어 있으며, 이는 고체 면역 강화제역할을 합니다5. OMV는 고유한 구성 요소, 천연 소포 구조 및 우수한 유전 공학 변형 부위의 이점을 활용하여 박테리아 백신6, 보조제7, 암 면역 요법 약물8, 약물 전달 벡터9 및 항균 접착제10을 포함한 많은 생물 의학 분야에서 사용하기 위해 개발되었습니다.
2020년부터 전 세계적으로 확산된 SARS-CoV-2 팬데믹은 글로벌 사회에 큰 타격을 입혔습니다. 스파이크 단백질 (S 단백질)의 수용체 결합 도메인 (RBD)은 인간 안지오텐신 전환 효소 2 (ACE2)와 결합 할 수 있으며, 이는 세포11,12,13으로의 바이러스 진입을 매개합니다. 따라서 RBD는 백신 발견14,15,16의 주요 표적인 것으로 보입니다. 그러나, 단량체 RBD는 면역원성이 좋지 않고, 분자량이 작기 때문에 면역계가 인식하기 어렵기 때문에 보조제가 종종 필요하다17.
RBD의 면역원성을 증가시키기 위해, 다가 RBD를 나타내는 OMV가 구축되었다. RBD를 표시하기 위해 OMV를 사용하는 기존 연구는 일반적으로 RBD를 OMV와 융합하여 박테리아18에서 발현됩니다. 그러나 RBD는 바이러스 유래 단백질이며 원핵 생물 발현이 그 활성에 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 스트렙토코커스 화농성으로부터 유래된 SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC) 시스템을 사용하여 종래의 완충 시스템19에서 OMV 및 RBD와 공유 이소펩타이드를 형성하였다. SC 도메인은 생체 공학 대장균에 의한 융합 단백질로서 Cytolysin A (ClyA)로 발현되었고, ST는 HEK293F 세포 발현 시스템을 통해 RBD로 발현되었다. OMV-SC 및 RBD-ST를 혼합하고 밤새 배양하였다. 초원심분리 또는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 정제 후, OMV-RBD를 수득하였다.

<table><tbody><tr><td>암피실린 나트륨</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610028</td><td></td></tr><tr><td>자동 세포 계수기</td><td>Countstar</td><td>BioTech</td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 정량 키트</td><td>cwbio</td><td>cw0014s</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Touching 이미징 시스템</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danamic 광 산란</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano S90</td><td></td></tr><tr><td>전기영동 장치</td><td>Cavoy</td><td>Power BV</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Buffers H 10X TBST Buffer</td><td>Sangon Biotech</td><td>C520009</td><td></td></tr><tr><td>Goat pAb to mouse IgG1</td><td>Abcam</td><td>ab97240</td><td></td></tr><tr><td>High speed freezing centrifuge</td><td>Bioridge</td><td>H2500R</td><td></td></tr><tr><td>His-Tag mouse mAb</td><td>Cell signaling technology</td><td>2366s</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td>A600277</tr><tr><td>이소 프로필 베타 -D- 티오 갈라 락토피라 노시드</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600118</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA His-Bind Superflow</td><td>Qiagen</td><td>70691</td><td></td></tr><tr><td>무 지방 분유</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600669</td><td></td></tr><tr><td>OPM-293 세포 배양 매체</td><td>Opm biosciences</td><td>81075-001</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1 RBD-ST 플라스미드</td><td>우한 genecreat 생물 공학,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액, 식염수</td>, <td>ZSGB-bio</td>, <td>ZLI-9061</td><td></td></tr>, <tr><td>폴리 에틸 레니민, 선형</td><td>Polysciences,</td><td>23966-1</td><td></td></tr>, <tr><td>Prestained protein ladder</td>, <td>Thermo</td>, <td>26616</td><td></td></tr><tr><td>pThioHisA, ClyA-SC 플라스미드</td>, <td>무한 genecreat, 생물 공학,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF, Western Blotting Membranes</td>, <td>Roche</td><td></td><td></td>03010040001</tr><tr><td>Quixstand 탁상용 시스템(100kD 중공사 컬럼)</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 로딩 버퍼(5개)</td><td>Beyotime</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Supersignal west pico PLUS(향상된 화학발광 솔루션)</td><td>Thermo</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>서스펜션 기기</td><td>라이프 테크놀로지</td><td>훌라 믹서</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>히타치</td><td>HT7800</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>옥소이드</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>벡크만 쿨터</td><td>XPN-100</td><td></td></tr><tr><td>자외선 분광 광도계</td><td>히타치</td><td>U-3900</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610961</td><td></td></tr></tbody></table>

sars-cov-2 수용체 결합 도메인을 표시하는 외막 소포를 기반으로 하는 "플러그 앤 디스플레이" 나노입자 백신 플랫폼

A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

박테리아 또는 바이러스로부터 얻은 생체 모방 나노 입자는 백신 연구 및 개발에 상당한 관심을 끌었습니다. 외막 소포(OMV)는 평균 성장 동안 주로 그람 음성 박테리아에 의해 분비되며, 나노 크기의 직경과 자가 보조 활성을 가지고 있어 백신 전달에 이상적일 수 있습니다. OMV는 단백질, 핵산 및 소분자에 대한 다면적 전달 시스템으로 기능했습니다. OMV의 생물학적 특성을 최대한 활용하기 위해 생체 공학 대장균 유래 OMV를 운반체로, SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인(RBD)을 항원으로 활용하여 "플러그 앤 디스플레이" 백신 플랫폼을 구축했습니다. 스트렙토코커스 화농성 내의 SpyCatcher (SC) 및 SpyTag (ST) 도메인을 접합체 OMV 및 RBD에 적용하였다. Cytolysin A (ClyA) 유전자는 플라스미드 형질 감염 후 융합 단백질로서 SC 유전자와 함께 번역되어 OMV 표면에 반응 부위를 남겼습니다. 종래의 완충 시스템에서 RBD-ST를 밤새 혼합한 후, OMV와 RBD 사이에 공유 결합이 형성되었다. 따라서, 다가 표시 OMV 백신이 달성되었다. OMV 백신 플랫폼은 다양한 항원으로 대체함으로써 다양한 이종 항원을 효율적으로 표시하여 잠재적으로 전염병 전염병을 신속하게 예방할 수 있습니다. 이 프로토콜은 생산, 정제, 생체 접합 및 특성화를 포함하여 OMV 백신 플랫폼을 구성하는 정확한 방법을 설명합니다.

이 프로토콜의 순서도는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜은 OMV를 백신 플랫폼으로 활용하는 일반적인 접근 방식일 수 있습니다. 항원의 유형에 따라 적절한 발현 시스템을 선택하기 만하면됩니다.
도 2는 실현 가능한 플라스미드 설계 스킴을 제공한다. SC 유전자는 유연한 링커를 통해 ClyA 유전자와 연결되고, ST는 정제 및 검증을 위해 His-tag 유전자로 RBD 유전자의 5' 말단에 연결됩니다. 웨스턴 블롯은 OMV-SC가 증가함에 따라 반응이 점진적으로 완료되는 것을 보여주었다(도 3A). 초원심분리 후, 거의 모든 미반응 RBD-ST가 상청액에 남아있었다. 두 번째 초원심분리는 첫 번째 시간에 비해 더 유의한 이점을 제공하지 않았습니다(그림 3B).</p...

본 프로토콜은 외막 소포의 생명공학을 생산, 정제, 생체접합 및 특성화를 포함하는 "플러그 앤 디스플레이" 백신 플랫폼으로 설명합니다.

SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인을 표시하는 외막 소포를 기반으로 하는 "플러그 앤 디스플레이" 나노입자 백신 플랫폼

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

나노 과학은 표면에 항원을 표시 한 후 항원 특이 적 면역 반응을 효과적으로 향상시킬 수 있습니다.이 백신 플랫폼의 주요 장점은 플라크 및 디스플레이를 제거 할 수 있습니다. 즉, 플랫폼에서 다양한 항원을 표시할 수 있게 되어 이 방법은 나노크기의 담체에 다른 생체 나노입자를 디스플레이엔진으로 적용할 수도 있다. cytolysin A 스파이 카테터 변형을 수행하려면 50 마이크로 리터의 BL 21 적격 균주에 5 마이크로 리터의 혈장 용액을 첨가하는 것으로 시작하십시오.부드럽게 불어서 얼음에서 30 분 동안 식히십시오. 섭씨 42 도의 수조에 90 초 동안 용액을 넣은 다음 즉시 혼합 용액을 얼음에 3 분 동안 두십시오. 500 마이크로리터의 루리아 베르타니 배지를 박테리아 현탁액에 첨가하고, 혼합 배양 후 섭씨 37도에서 분당 220회전으로 1시간 동안 배양한다.다음으로, 암피실린을 함유하는 모든 형질전환루리아 베르타니 한천 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양하였다. OMV 스파이캐처 생산의 경우, 플레이트에서 단일 콜로니를 20밀리리터의 루리아 베르타니 배지로 분리하고 섭씨 37도에서 분당 220회전으로 밤새 배양하는 것으로 시작합니다. 박테리아 용액을 2리터 배지에 넣고 대수 성장 단계에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 분당 220회전으로 5시간 동안 배양합니다.이소프로필 베타 D-IPTG를 첨가하여 박테리아 용액의 최종 농도를 0.5밀리몰로 만든 다음 섭씨 25도에서 분당 220회전으로 밤새 배양합니다. 다음으로 OMV 스파이 캐처 정제를 수행하십시오. 박테리아 용액을 융합하는 센트리로 시작하십시오.0.22 마이크로 미터 멤브레인 필터로 상청액을 여과 한 다음 중공 섬유 컬럼을 사용하여 농축하십시오. 농축액을 0.22 마이크로 미터 멤브레인 필터를 통해 여과 한 다음 초 센트리 퓨즈를 사용하여 섭씨 4도에서 2 시간 동안 섭씨 150, 000 배 G에서 센트리 융합하고 피펫으로 상층액을 버립니다. PBS로 강수량을 다시 현탁하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.RBD 스파이태그 형질감염을 수행하려면 적절한 진핵생물 발현 시스템을 선택하는 것으로 시작하여 회복 후 섭씨 37도에서 분당 130회전으로 밤새 세포를 배양합니다. 20마이크로리터 HEK 293F의 세포 용액을 자동 세포 카운터에 추가합니다. 세포의 수를 기록하고, 밀리리터당 6개의 세포에 10배로 농도를 조절한다.그런 다음 세포를 섭씨 37도에서 분당 130회전으로 4시간 동안 배양합니다. 0.22 마이크로미터 멤브레인 필터를 통해 RBD 스파이 태그 플라스미드를 여과하고 최종 부피가 10밀리리터가 될 때까지 300마이크로그램의 플라스미드를 세포 배양 배지에 추가합니다. 10 초 동안 흔들어주십시오.수조에서 PEI를 섭씨 65도까지 가열합니다. 0.7 밀리리터의 PEI와 9.3 밀리리터의 세포 배양 배지를 혼합하고 10 초 동안 간헐적으로 흔든다. PEI 용액에 플라스미드 용액을 첨가한다.혼합물을 10초 동안 간헐적으로 흔들고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 혼합물을 280 밀리리터의 세포 배양 배지에 첨가하고, 5일 동안 섭씨 37도에서 분당 130회전으로 배양한다. 다음으로 RBD 스파이 태그 정제를 수행하십시오.섭씨 25도에서 20 분 동안 6, 000 배 G에서 세포를 융합하는 중심에서 시작하고 피펫을 사용하여 상층액을 수집합니다. 컬럼에 2 밀리리터의 니켈 NTA 아가 로스를 채우고 PBS로 3 회 세척하십시오. 이미다졸을 세포 상청액에 첨가하여 최종 농도가 20밀리몰이 되도록 하고 세포 상청액을 적재합니다.세척을 위해 20 밀리몰의 이미다졸을 함유하는 PBS의 3개의 컬럼 부피를 첨가하고, 세척 분획을 수집한다. 저농도에서 고농도의 이미다졸을 함유하는 PBS의 3열 부피로 그래디언트 용리를 각 농도에 대해 2회 용리한다. BCA 방법으로 단백질 농도를 측정하려면 표준 BSA 단백질 용액을 밀리리터당 2에서 0.0625 밀리그램으로 연속 희석하고 정제된 OMV 스파이캐처 및 RBD 스파이 태그를 10배 희석합니다.그런 다음 BCA 작업 용액 A와 B를 50 대 1의 비율로 혼합하십시오. 희석 된 단백질 용액을 첨가하고 BCA 작업 용액과 혼합하십시오. 37도에서 30 분 동안 배양하십시오.각 웰의 562 나노미터에서 흡광도를 측정하고, 표준곡선으로부터 단백질 농도를 계산한다. OMV 스파이캐처와 RBD 스파이 태그의 생체 접합을 수행하려면 OMV 스파이캐처와 RBD 스파이태그 및 PBS를 40:1 비율로 혼합합니다. 수직으로 회전하여 섭씨 4도에서 분당 15회전으로 혼합물을 밤새 혼합합니다.OMV 스파이캐처 정제와 유사한 절차를 사용하여 PBS 용액을 사용하여 OMV RBD의 정제를 수행합니다. 혈장 설계 방식은 스파이캐처 유전자가 유연한 링커를 통해 cly A 유전자와 연결되는 반면 스파이태그는 정제 및 검증을 위해 hys 태그 유전자로 RBD 유전자의 5개 프라임 말단에 연결됨을 보여줍니다. 초원심분리 후, 거의 모든 반응하지 않은 RBD 스파이태그가 상청액에 남아있었다.두 번째 초원심분리는 첫 번째에 비해 더 유의한 이점을 제공하지 않았습니다. OMV 스파이캐처의 z 평균 유체역학적 직경은 133나노미터인 반면 OMV-RBD의 경우 152.6나노미터였습니다. 이러한 차이는 RBD가 집중 표시 후 OMV 입자 크기를 증가시키기 때문일 수 있습니다.TEM의 결과는 DLS 결과로부터 수득된 입자 크기 분포와 일치한다. 혼합물을 혼합하기위한 회전은 매우 중요합니다. 반응 효율은 회전없이 훨씬 낮을 수 있습니다.

a-plug-display-nanoparticle-vaccine-platform-based-on-outer-membrane

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜은 사스에 대한 재조합 수용체 결합 도메인 (RBD) 기반 subunit 백신을 연구를위한 일반적인 절차를 설명합니다. 그것은 293T 세포에 RBD 단백질, RBD와 설립 사스 pseudovirus의 중화 분석을 사용하여 마우스 세라의 중화 활동의 검출과 생쥐의 예방 접종의 transfection과 표현을위한 방법을 포함하고 있습니다.

재조합 RBD 기반 SARS 백신에 대한 프로토콜 : 단백질 준비, 동물 예방 접종 및 중화 감지

이 동영상은 다가 표시 외막소포체(OMV) 백신을 생성하는 방법을 보여줍니다. 포유류 세포는 SpyTag 및 폴리히스티딘 태그에 융합된 바이러스 항원을 발현하고 분비하기 위해 transfection됩니다. 그런 다음 이러한 항원은 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 친화성 컬럼을 사용하여 정제됩니다. 정제된 항원은 표면 결합 SpyCatcher(SC) 단백질을 발현하는 외막 소포와 혼합됩니다. 여러 항원이 SpyTag(ST)를 통해 SpyCatcher에 공유 결합되어 항원을 표시하는 OMV를 생성하여 다가 백신 역할을 합니다.

다가 표시 외막 소포 백신 생성

우리 theranostic 나노 (HEVNP)으로 간염 E 바이러스 capsid 단백질을 설계 했습니다. HEVNP 자동으로 안정 된 icosahedral 점 막 배달에 조립. 여기, 시스테인, 특히 종양 세포를 묶는 합성 ligands 켤레를 표면 노출 잔류물을 변경 하 여 대상으로 하는 종양에 대 한 HEVNPs의 수정을 설명 합니다.

간염 E 바이러스 나노 화학 활용 방법을 사용 하 여의 표면 기능화

여기, 우리가 현재 높게 병원 성 바이러스 중동 호흡기 증후군, 중증 급성 호흡기 증후군 coronaviruses의 스파이크 단백질을 통합 하는 BSL-2 설정에 pseudotyped 입자를 생성 하는 프로토콜. 이러한 pseudotyped 입자 포함 대상 호스트 세포에 바이러스 항목의 정량화를 허용 luciferase 취재 원 유전자.

Biosafety 수준 2 설정에 높게 병원 성 Coronaviruses 공부 Pseudotyped 입자의 생산

백신 개발에 사용하기 위한 자가 조립 단백질 나노입자(SAPN)의 정제, 재접이식 및 특성화를 설명하는 상세한 방법이 여기에 제공된다.

삼중 에피토프 프리젠 테이션을 필요로하는 백신을위한 대장균- 발현 자가 조립 단백질 나노 입자의 생산

여기서는 항원 표시 바이러스 유사 입자(VLP)에서 중화 에피토프를 검출하는 프로토콜을 제시한다. 인간 면역결핍 바이러스(HIV)-유래 VLP의 면역 침전은 단백질 G-컨쥬게이트 자기 비드에 결합된 봉투 당단백질 특이적 단일 클론 항체를 사용하여 수행된다. 포획된 VLP는 이후 바이러스 성 코어 단백질 개그 특이적 항체를 사용하는 SDS-PAGE 및 서양 블롯 분석을 받게 된다.

포획 분석기를 사용하여 바이러스와 같은 입자(VLP) 기반 백신에 표시되는 항원에서 중화에 민감한 에피토프 검출

이 프로토콜에서, 재조합 SARS-CoV-2 스파이크에 접합된 양자점은 세포-기반 분석을 가능하게 하여 원형질막에서 hACE2에 대한 스파이크 결합 및 세포질 내로의 결합된 단백질의 후속 엔도사이토시스를 모니터링한다.

HEK293T 세포에서 결합 및 엔도사이토시스를 추적하기 위한 양자점 접합 SARS-CoV-2 스파이크 삼량체의 고처리량 공초점 이미징

본 프로토콜은 HA, S 당단백질, 관련 하이브리드형 글리칸 및 고만노스 올리고당에 대한 CV-N 결합을 검사하기 위한 SPR 결합 분석을 위한 새로운 도구를 설명합니다. SPR은 이량체 또는 단량체 CV-N을 이들 글리칸에 결합시키기 위한KD 를 결정하기 위해 사용된다.

표면 플라즈몬 공명을 통한 항바이러스제 엔지니어링

여기에서는 이중 리포터 유세포 분석 시스템을 사용하여 안지오텐신 변환 효소-2 결합 자기 마이크로스피어에 의해 포착된 온전한 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 바이러스 입자에서 두 개의 고유한 스파이크 단백질 에피토프를 동시에 검출하는 새로 개발된 다중 형광 면역분석법에 대해 설명합니다.

Multiplex Dual-Reporter Strategy를 통한 바이러스 입자의 표면 단백질 에피토프 프로파일링

우리는 실제 바이러스를 밀접하게 모방한 SARS-CoV-2 바이러스 유사 입자를 생성하기 위해 최적화된 체외 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식을 사용하면 생물 안전성 레벨 3 실험실이 필요한 제약 없이 바이러스 감염, 조립 및 배출 메커니즘을 조사할 수 있습니다.

In Vitro 바이러스 수명 주기를 조사하기 위한 입자 시스템과 같은 SARS-CoV-2 바이러스 생산

이 글에서는 루시퍼레이스 리포터 시스템을 이용한 SARS-CoV-2 의사형 입자를 생성하는 방법론과 이를 이용해 진입 억제제를 식별하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 재조합 인간 ACE2-Fc 융합 단백질과 소분자 화합물 아르비돌이라는 두 가지 다른 진입 억제제를 사용하여 입증되었습니다.

MLV 기반 가성바이러스를 이용한 SARS-CoV-2 진입 억제제를 잠재적 항바이러스제로 식별하는 절차

학습하세요 외막 소포를 활용한 "플러그 앤 디스플레이" 나노입자 백신 플랫폼 개발 방법을. SARS-CoV-2 RBD 항원 표시 및 생물학적 결합 기술을 통해 면역 반응을 강화하는 이 백신 전략의 생산·정제·특성화 과정을 상세히 알아보세요.

SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인을 표시하는 외막 소포를 기반으로 하는 "플러그 앤 디스플레이" 나노입자 백신 플랫폼

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