Name: 조정 가능한 모터 구동 역학 및 역학을 사용한 Actin-Microtubule 복합재 재구성 및 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 학습하세요 키네신과 미오신 모터를 이용한 액틴-미세소관 복합재 재구성 및 역학 특성화 방법을. 이 기술은 세포 환경 모방 및 합성 생물학 연구에 활용됩니다.

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데이터 분석에 도움을 준 Maya Hendija와 Jonathan Michel 박사, 유용한 토론과 안내를 해주신 Janet Sheung 박사, Moumita Das 박사, Michael Rust 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 RMRA 및 JLR에 수여되는 William M. Keck Foundation Research Grant 및 NSF DMREF Award (DMR 2119663)와 RMR-A 및 RJM에 수여 된 National Institutes of Health R15 Grants (R15GM123420, 2R15GM123420-02)의 지원을 받았습니다.

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저자는 공개 할 것이 없습니다

위에서 설명한 재구성 시스템의 주요 발전은 모듈성과 조정 가능성이므로 사용자는 특정 세포 공정을 에뮬레이트하거나 특정 기능 또는 기계적 특성을 가진 재료를 엔지니어링하는 등 원하는 결과에 맞게 단백질, 모터, 가교제 등의 농도를 수정하는 것이 좋습니다. 액틴과 튜불린의 농도 범위에 대한 제한은 액틴(~0.2μM)57,58,59 및 튜불린(~3 - 4μM)60을 중합하는 데 필요한 임계 농도에 의해 하한으로 설정되고, 액틴 필라멘트(~90μM)61,62 또는 미세소관(~35μM)63의 네마틱 정렬로의 전환에 의해 상한으로 설정됩니다. . 액틴 단량체와 튜불린 이량체는 중합 후 함께 혼합되지 않고 함께 필라멘트로 중합되어 서로를 상승적으로 지지하는 균일하게 상호 침투하는 퍼콜레이션 네트워크를 형성해야 합니다. 합성물이 보여주는 새로운 역학은 이러한 상호 작용에 의존합니다. 표시된 결과를 성공적으로 재현하려면 프로토콜에 설명된 대로 모든 단계를 따르는 것이 일반적으로 중요하지만 일부 단계는 더 엄격하고 다른 단계는 특정 요구 사항과 사용 가능한 리소스에 맞게 수정 및 조정할 여지가 있습니다.
예를 들어, 재현 가능한 결과를 보장하는 한 가지 중요한 단계는 재료 표에 제공된 지침에 따라 시약을 적절하게 준비하고 보관하는 것입니다. 세포골격 단백질(액틴, 튜불린, 미오신, 키네신)은 불안정하므로 분취하고, 액체 질소로 급속 냉동하고, 일회용 분취량으로 -80°C에서 보관해야 합니다. -80 ° C에서 제거한 분취량은 얼음 위에 보관해야합니다. 세포골격 단백질은 추가적인 동결-해동 주기 후에 기능을 안정적으로 유지하지 못합니다.
미세소관은 액틴보다 해중합 및 변성에 더 민감합니다. -80 ° C에서 제거 된 후에는 중합 전에 튜 불린을 얼음에 보관하고 12 시간 이내에 사용해야합니다. 일단 중합되면 미세소관은 실온에서 보관해야 합니다. 해중합을 방지하기 위해 탁솔로 미세소관을 안정화하는 것도 중요합니다. 액틴 필라멘트의 팔로이딘 안정화는 미오신 및 키네신 활성과 경쟁하는 ATP 소비 액틴 트레드밀링을 억제하는 데에도 마찬가지로 중요합니다.
미오신 모터의 초 원심 분리는 비활성 미오신 죽은 머리를 제거하기 때문에 또 다른 중요한 단계입니다. 효소적으로 불활성인 단량체를 제거하지 않으면 액틴 네트워크의 수동 가교결합과 활성의 손실이 발생합니다. 모터의 ATPase 활성을 연장하기 위해, 크레아틴 포스페이트 및 크레아틴 포스포키나제64 와 같은 ATP 재생 시스템이 혼입될 수 있다.
마지막으로, 복합 활성을 유지하려면 샘플 챔버의 벽에 대한 필라멘트 및 모터의 흡착을 억제해야 하며, 이는 현미경 커버슬립 및 슬라이드의 패시베이션으로 달성할 수 있습니다. 모터 단백질은 특히 흡착되기 쉽기 때문에 복합체가 샘플 챔버의 표면으로 당겨져 시야를 벗어나 2D로 붕괴되고 더 이상 활동하지 않습니다. 커버슬립과 슬라이드를 실란화하는 것은 표면을 부동태화하고 흡착을 방지하는 효과적인 방법입니다(1단계 참조). 시험관내 세포골격 실험에서 효과적으로 사용되는 대안적인 패시베이션 방법은 표면을 세포막(18)과 유사한 지질 이중층으로 코팅하는 것이다. 이 방법은 단백질을 표면에 묶거나 다른 특정 단백질-표면 상호 작용을 도입하려는 경우 이중층이 기능화 될 수 있기 때문에 유리합니다. 광학 핀셋 실험의 경우, 마이크로스피어의 패시베이션도 중요하며, 카르보디이미드 가교결합제화학 48을 통해 카르복실화된 마이크로스피어를 BSA 또는 PEG로 코팅함으로써 달성될 수 있다.
제시된 프로토콜에는 연구자가 필요에 맞게 변경하는 것을 고려할 수있는 몇 가지 측면이 있습니다. 첫째, 연구자들은 비 천연 비오틴 -NA 가교 결합제를 액틴과 미세 소관을 각각 가교 결합하는 알파-액티닌 또는 MAP65와 같은 생물학적 가교제로 대체하도록 선택할 수 있습니다 28,65,66. 여기에 설명된 복합재에서 비네이티브 가교결합제를 사용하는 것은 천연 가교결합제에 비해 향상된 재현성, 안정성 및 조정 가능성에 의해 동기가 부여됩니다. 강한 비오틴-NA 결합으로 인해, 가교결합제는 광범위한 회전율로 일시적으로 결합하는 대부분의 천연 가교결합제보다는 영구적인 것으로 가정할 수 있다. 과도 가교의 역학은 가교제와 모터에서 역학에 대한 기여를 구문 분석하는 것을 복잡하게 만듭니다. 또한, 비오틴-NA 링커는 액틴과 미세소관 모두를 가교결합하고 액틴을 미세소관에 가교결합하는 데 다용도로 사용할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 가교 모티프들 사이의 명확한 비교가 이루어질 수 있고, 다른 모든 변수들(예를 들어, 가교결합자 크기, 결합 친화도, 화학량론 등)을 고정시킬 수 있다. 마지막으로, 비오틴-NA 링커를 혼입하는 데 필요한 시약은 널리 상업적으로 이용 가능하고 잘 특성화되어 있으며 많은 생물물리학 실험실에서 일반적으로 사용됩니다. 그러나 여기에 설명된 체외 플랫폼의 주요 강점 중 하나는 모듈성이므로 연구원은 원하는 경우 비오틴-NA 링커를 기본 링커로 원활하게 대체할 수 있어야 합니다.
둘째, 현재 프로토콜에서 액틴 단량체와 튜불린 이량체는 샘플 챔버에 추가하기 전에 원심분리 튜브에서 함께 필라멘트로 중합됩니다. 얽힌 필라멘트 단백질의 용액을 샘플 챔버로 흐르게 하면 특히 미세소관의 흐름 정렬이 발생하여 복합체의 원하는 등방성과 균질성이 깨질 수 있습니다. 실제로, 정상 상태 액틴-미세소관 복합체에 대한 이전 연구의 주요 발전은 액틴과 미세소관15,16,27의 등방성 상호 침투 네트워크의 형성을 보장하기 위해 액틴과 미세소관을 제자리에서(샘플 챔버에서) 공동 중합하는 능력이었습니다. 그러나 이러한 접근 방식을 활성 복합 재료로 확장하려면 액틴 및 튜불린 중합 전에 샘플에 모터를 추가하고 실험 전에 전체 샘플을 37°C에서 함께 배양해야 합니다. 프로토콜에 대한 이러한 변화에 대한 테스트는 경쟁하는 ATPase 활성 및 모터의 연장된 37°C 배양으로 인해 액틴 중합이 감소하고 식별 가능한 모터 활성이 없음을 초래했습니다. 다행히도 그림 2, 그림 3 및 그림 6에서 볼 수 있듯이 현재 프로토콜을 따를 때 복합 재료의 흐름 정렬을 식별할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고 연구자들은 활성 복합 재료의 현장 형성을 허용하는 프로토콜을 설계하는 것이 좋습니다.
또 다른 고려 사항은 형광 표지 체계로, 네트워크의 모든 액틴 필라멘트와 미세 소관에 희박하게 라벨링하는 것을 수반합니다. 이 라벨링 접근 방식은 추적 필라멘트 또는 마이크로스피어를 통해 구조와 역학을 추론하는 대신 네트워크의 구조를 직접 시각화하도록 최적화되었습니다. 그러나 단점은 개별 필라멘트가 밝게 레이블링되고 분해 될 수 없다는 것입니다. 연구자들이 단일 필라멘트를 해결하고 네트워크 구조를 시각화하기 위해 취할 수있는 한 가지 접근법은 다른 형광단으로 표지 된 미리 형성된 필라멘트에 도핑하여 주변 네트워크와 개별 필라멘트를 동시에 이미징 할 수 있도록하는 것입니다. 그러나 두 개 이상의 형광단과 여기/방출 채널을 사용하는 경우 채널 간 블리드스루를 제거하기 어려운 경우가 많으므로 형광단, 필터 및 레이저 강도를 선택할 때 주의해야 합니다.
관련 한계는 복합 재료에서 미오신 또는 키네신 모터를 시각화 할 수 없다는 것입니다. 사용된 형광 표지된 액틴 단량체와 튜불린 이량체는 상업적으로 이용 가능한 반면, 복합재에서 미오신 또는 키네신을 시각화하려면 자체 라벨링이 필요합니다. 연구원들은 이전에18,67에서 수행한 것처럼 모터에 레이블을 지정하는 다음 단계를 수행하여 모터 활동과 결합을 복합 재료가 나타내는 역학 및 구조에 명확하게 연결할 수 있도록 하는 것이 좋습니다.
마지막으로, 현재 프로토콜에서 키네신 활성의 시작 및 지속 기간은 제어되지 않는다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 미오신 활성은 상기 기재된 바와 같이 블레비스타틴의 광불활성화를 사용하여 제어되기 때문에, 키네신의 유사한 광활성화를 구축하기 위해, 광-활성화된 ATP를 혼입시킬 수 있다.
여기에 설명된 설계의 복잡성을 구축하고 세포 조건을 더 잘 모방하고 동적 구조-기능 매개변수 공간을 넓히기 위해 향후 작업은 비멘틴68,69와 같은 중간 필라멘트와 다인 13,70과 같은 다른 모터를 통합하는 데 중점을 둘 것입니다. 겔솔린은 또한 액틴 길이14를 조절하기 위해 다양한 농도로 통합될 뿐만 아니라 미세소관 경직을 조절하기 위한 타우 단백질도 포함될 것입니다.
요약하면, 제시된 프로토콜은 단일 시스템에서 서로 다른 기질에 작용하는 두 개의 개별 활성력 생성 구성 요소를 포함하는 세포 골격에서 영감을 받은 활성 물질 시스템의 역학, 구조 및 역학을 설계, 생성 및 특성화하는 방법을 설명합니다. 이 조정 가능한 모듈식 플랫폼은 재구성 노력을 세포 세포 골격을 모방하는 데 한 걸음 더 가까이 다가가게 하고 다양한 구성 요소를 독립적으로 통합, 제거 및 조정하여 넓은 위상 공간에 걸쳐 특성을 프로그래밍할 수 있는 고유한 기능을 제공합니다. 더욱이, 이 다용도 시스템의 모든 구성 요소는 상업적으로 입수가능하며(재료 표 참조), 앞서50에서 설명한 바와 같이 Ross Lab에서 정제되고 요청 시 제공되는 키네신 이량체를 제외하고. 마지막으로 모든 분석 코드는 GitHub49 를 통해 무료로 사용할 수 있으며 무료 프로그래밍 언어 및 소프트웨어(Python 및 피지)를 기반으로 합니다. 이러한 시스템을 설계하기위한 프로토콜의 투명한 보급은 다양한 전문 지식, 배경, 기관 제휴 및 연구 목표를 가진 다양한 사용자 그룹이이 플랫폼에 더 쉽게 액세스 할 수 있기를 바랍니다.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/64228">Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics</a>. The Authors section was updated.
Mehrzad Sasanpour1 
Daisy H. Achiriloaie1,2 
Gloria Lee1 
Gregor Leech1 
Christopher Currie1 
K. Alice Lindsay3 
Jennifer L. Ross3 
Ryan J. McGorty1 
Rae M. Robertson-Anderson1 
1Department of Physics and Biophysics, University of San Diego 
2W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College 
3Department of Physics, Syracuse University
to:
Mehrzad Sasanpour1 
Daisy H. Achiriloaie1,2 
Gloria Lee1 
Gregor Leech1 
Maya Hendija1 
K. Alice Lindsay3 
Jennifer L. Ross3 
Ryan J. McGorty1 
Rae M. Robertson-Anderson1 
1Department of Physics and Biophysics, University of San Diego 
2W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College 
3Department of Physics, Syracuse University

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Erratum: Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics

세포 골격은 세포에 구조적 및 기계적 지원을 제공하는 상호 작용하는 생체 고분자의 동적 복합 네트워크입니다. 관련 분자 모터와 결합 단백질은 세포 골격을 재구성하고 적응시켜 세포가 성장하고, 모양을 바꾸고, 뻣뻣해지고, 움직이고, 심지어 자가 치유될 수 있도록 하여 이동 및 분열에서기계 감지에 이르는 무수한 세포 과정을 가능하게 합니다1,2. 세포 생물 물리학에서의 중요성 외에도 세포 골격은 상처 치유 및 약물 전달에서 여과 및 소프트 로봇공학 1,3,4,5,6,7,8,9에 이르기까지 잠재적 인 재료 응용 분야에서 활성 물질의 전형적인 예입니다.
세포 골격에 고유 한 구조적 및 기계적 다양성과 다 기능성을 부여하는 두 가지 주요 특성은 다음과 같습니다 : 1) 반 유연한 액틴 필라멘트 및 경질 미세 소관과 같은 여러 상호 작용 단백질 필라멘트와 관련 결합 및 가교 결합 단백질을 포함하는 복합 특성 3,5,10; 2) 필라 멘트 단백질 1,7,11,12,13을 밀고 당기는 미오신 및 키네신과 같은 에너지 소비 모터를 통해 지속적으로 재구성, 이동, 거칠게 만들고 작업을 수행하는 능력. 이러한 우아한 복잡성은 세포 골격이 세포 운동성, 세포질 분열 및 상처 치유 3,6,7,11과 같은 다양한 과정을 매개할 수 있게 하지만, 재구성된 시험관 내 시스템에서 세포골격의 생체 내 특성을 재현하는 연구자의 능력을 방해합니다.
현재의 프론티어 재구성 노력은 얽히고 가교된 액틴 필라멘트 및 미세소관 3,10,14,15,16,17, 힘 생성 액토미오신 네트워크2,8,18,19,20,21 및 키네신-미세소관에 의해 구동되는 활성 네마틱스의 복합체에 중점을 둡니다. 상호 작용 22,23,24,25,26. 정상 상태 액틴-미세소관 복합체는 단일 성분 시스템(27)에 비해 향상된 필라멘트 이동성 및 증가된 강성과 같은 창발적 기계적 특성(15,16,27)을 나타내는 것으로 나타났다. 시험관내 액토미오신 시스템에 대한 연구는 액틴, 미오신 및 가교결합제 28,29,30,31의 농도에 의존하는 광범위한 구조적 및 역학적 특성을 보고하였다. 예를 들어, 충분한 가교가 있는 경우 액토미오신 네트워크는 대규모 수축 및 조잡함 2,28,30,32,33,34,35,36을 겪는 반면, 가교결합이 없으면 네트워크는 빠르고 불안정한 흐름과 파열을 나타냅니다.19,29 . 키네신 모터 클러스터를 사용하여 미세소관 다발을 가교결합하고 당기는 재구성된 미세소관 기반 활성 네마틱스는 오래 지속되는 난류, 확장, 좌굴, 파쇄 및 치유를 나타내는 것으로 보고되었습니다. 12,22,23,24,25,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47.
보다 최근에, 미오신 II 미니-필라멘트에 의해 구동되는 액틴-미세소관 복합체는 가교결합제가 없는 액토미오신 네트워크가 17,26,48을 나타내는 무질서한 흐름 및 네트워크 파열에 비해 더 질서 있는 수축 및 네트워크 무결성을 유도하는 것으로 나타났다. 또한, 복합 견고성과 힘 생성의 조합은 액틴과 미세소관이 유사한 농도로 존재할 때 최적화됩니다. 제형 공간의 이 영역에서 주요 출현 특징은 향상된 기계적 강도(26), 액틴 및 미세소관(26)의 배위 운동(26), 꾸준한 지속 수축 및 메조스케일 재구성(17)을 포함한다.
여기에서는 각각 액틴 필라멘트와 미세소관에 작용하는 미오신 II 미니 필라멘트와 키네신 클러스터에 의해 평형 밖으로 밀려나는 미세소관과 액틴 필라멘트의 얽히고 가교된 복합체를 엔지니어링하고 조정하는 프로토콜이 설명됩니다(그림 1). 이 종류의 복합 재료의 역학, 구조 및 역학은 필라멘트, 모터 및 가교 결합기의 상대적 농도에 의해 조정되어 대류 및 난류 흐름, 등방성 수축, 가속, 감속, 탈혼합, 경화, 이완 및 파열. 이 연구의 초점은이 종류의 활성 세포 골격 복합체를 준비하고 조정하는 것입니다. 그러나 연구자가 설명된 활성 복합재를 벤치마킹하고 특성화하는 데 도움이 되도록 다중 스펙트럼 컨포칼 현미경을 사용하는 효과적인 이미징 방법도 자세히 설명합니다. 마지막으로 복합 재료의 역학, 구조 및 역학을 측정하는 데 사용할 수 있는 주요 계산 분석 방법의 결과를 제시합니다. 연구원들은 복합재 17,26,49의 복잡한 역학 및 구조적 다양성을 특성화하도록 최적화되었으므로 차동 동적 현미경(DDM), 공간 이미지 자기 상관(SIA) 및 입자 이미지 속도계(PIV)를 포함하는 이러한 방법을 채택하는 것이 좋습니다.
아래에 설명된 단계는 복합재를 준비하고 컨포칼 현미경을 사용하여 이미징하는 데 중점을 둡니다. 획득 후 데이터 분석 및 광학 핀셋 측정을 설명하는 프로토콜은 이전 작업 17,26,48,50에서 찾을 수 있으며 요청시 제공됩니다. 모든 자료는 제공된 자료표에 나열되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>(-)-블레비스타틴 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: blebbistatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0560</td><td>재고 농도: 200 &mu; DMSO의 M Storage: 건조, DMSO에서 -20&ordm; C 주식 및 실험 조리법: 분말 1 mg을 200 &mu에 용해; M in DMSO Storage, Handling, Troubleshooting 참고: 제한된 유통 기한은 일반적으로 3-4개월 후에 안정적으로 작동하지 않습니다. 3개월마다 새로운 솔루션을 구매하고 준비합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>1:20 488-튜불린:튜불린 혼합물 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: 5-488-tubulin</td><td>NA</td><td>NA</td><<td>strong>재고 농도: PEM에서 5 mg/ml 저장: 일회용 분취량, -80&ordm; C, 동결-해동 주기를 피하십시오 stock 및 실험 레시피: 튜불린과 488-튜불린을 20:1 비율로 혼합, LN2 보관, 취급, 문제 해결로 급속 동결 참고: 각 부분 표본은 4&ordm에서 얼음에 최대 12시간 동안 저장할 수 있습니다. C, 빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>1:20 R-튜불린:튜불린 혼합물 &nbsp; 종이에서 이용되는 약어: 5-R-tubulin</td><td>NA</td><td>NA</td><<td>strong>주식 농도: PEM에서 5 mg/ml 저장: 일회용 분취량, -80&ordm; C, 동결-해동 주기를 피하십시오 재고 및 실험 레시피: 튜불린과 로다민 튜불린을 20:1 비율로 혼합, LN2 보관, 취급, 문제 해결로 급속 동결 참고: 각 부분 표본은 4&ordm에서 얼음에 최대 12시간 동안 사용할 수 있습니다. C, 가벼운</td></tr><tr><td>액틴 (비오틴)으로부터 보호 : 골격근 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: biotin-actin</td><td>Cytoskeleton</td><td>AB07</td><td>재고 농도: G-buffer에 1 mg/ml 저장: 일회용 부분 표본, -80&ordm; C, 동결-해동 주기를 피하십시오 재고 및 실험 레시피: G-buffer에서 1 mg/ml로 재구성, LN2 보관, 취급, 문제 해결로 급속 동결 참고: (1) 사용 직전에 PEM에서 0.5 mg/ml로 희석, (2) -80&ordm에서 한 번 제거; C, 상점&nbsp; 4&ordm에서 얼음 위의 분취량; C 최대 1 주일</td></tr><tr><td>액틴 (로다민) : 토끼 골격근 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: R-actin</td><td>Cytoskeleton</td><td>AR05</td><td>재고 농도: G-buffer Storage: 일회용 부분 표본, -80&ordm; C, 동결-해동 주기를 피하십시오 재고 및 실험 레시피: G-buffer에서 1.5 mg/ml로 재구성, LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: -80&ordm에서 제거되면 /strong; C, 상점&nbsp; 4&ordm에서 얼음 위의 분취량; C, 최대 1주일 동안 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>아데노신 삼인산 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: ATP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1048</td><td>재고 농도: 100 mM Storage: in solution (pH 7), -20&ordm; C 주식 및 실험 레시피: DI H20에서 재결합, NaOH로 pH를 7로 끌어<> 보관, 취급, 문제 해결 참고: 정기적으로 pH를 확인하고 필요에 따라 조정, 시간이 지남에 따라 가수분해, 매 ~6-12개월마다</td></tr><tr><td>교체 AlexaFluor488 Phalloidin &nbsp; 종이에 사용되는 약어: 488-phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>재고 농도: 100 &mu; M DMSO 저장: 빛으로부터 보호, 건조, -20°; C 재고 및 실험 레시피: 100으로 재구성 &mu; M with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting 참고: 사용 직전에 20 &mu로 희석하십시오. PEM에서 M (1 &mu; L in 4 &mu; L PEM)</td></tr><tr><td>AlexaFluor488&ndash; ACTIN 라벨 부착 &nbsp; 종이에 사용된 약어: 488-actin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12373</td><td>재고 농도: G-buffer에서 1.5 mg/ml 저장: 일회용 부분 표본, -80&ordm; C, 동결-해동 주기를 피하십시오 재고 및 실험 레시피: G-buffer에서 1.5 mg/ml로 재구성, LN2 보관, 취급, 문제 해결로 플래시 동결 참고: 이 제품은 중단되었습니다</td></tr>. <tr><td>기본 플라즈마 클리너 &nbsp; <강한>종이에 사용되는 약어: 플라즈마 클리너</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Bemis&nbsp; Parafilm M 실험실 포장 필름 &nbsp; <강>종이에 사용되는 약어:</강한> 투명 필름</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-374-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose &nbsp; 종이에 사용되는 약어:&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1682836</td><td>재고 농도: 100x Storage: 재고 농도(100x) 또는 10x 농도에서 건조, -20°ordm에서 보관; C 주식 및 실험 조리법: DI H20 Storage, Handling, Troubleshooting 참고: 용액의 최종 농도는 45 &mu; g/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>D-비오틴 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: biotin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td>재고 농도: PEM에서 1.02 mM 저장: 건조, 4&ordm; C</td></tr><tr><td>탈 이온화 된 나노 순수 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: DI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyldichlorosilane &nbsp; 종이에 사용되는 약어: 실란</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D/3820/PB05</td><td>주식 농도: Toulene</td></tr><tr><td>Dithiothreitol 에 용해된 2% &nbsp; 종이에서 이용되는 약어: DTT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td>주식 농도: DMSO에서 1 M 저장: 건조, -20&ordm; C 재고 및 실험 조리법: 각 실험 DMSO 무수 직전에 PEM에서 2mM로 희석</td></tr><tr><td> &nbsp; 종이에 사용되는 약어: DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>F-Buffer &nbsp; 종이에서 이용되는 약어: F-완충</td>기 <td>NA</td><td>NA</td><<td>strong>주식 농도: 10x 저장: 건조, -20°ordm; C 재고 및 실험 레시피: 10 mM 이미다졸 (pH 7.0), 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.2 mM ATP</td></tr><tr><td>G-버퍼 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: G-buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><<td>strong>재고 농도: 10x Storage: dessicated, -20&ordm; C 재고 및 실험 레시피: 2.0mM 트리스(pH 8), 0.2mM ATP, 0.5mM DTT, 0.1mM CaCl2. -20°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-310397</td><td></td></tr><tr><td>포도당 산화효소 + 카탈라아제 + &beta;-메르캅토에탄올 &nbsp; 종이에 사용된 약어: GOC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2133-250KU, C1345, 63689&nbsp;</td><td>stock 농도: 100x 저장: 재고 농도 (100x) 또는 10x 농도에 저장, 건조, -20&ordm에; C 주식 및 실험 레시피: 100x: 4.3 mg/ml 포도당 산화효소, 0.7 mg/ml 카탈라제, 0.5% V/V&nbsp; &beta;-mercaptoethanol in DI H20 보관, 취급, 문제 해결 참고: 용액의 최종 농도는 0.005% &beta;-mercaptoethanol, 43 &mu; g/mL 포도당 산화효소, 7 &mu; g/mL 카탈라아제</td></tr><tr><td>glu-GOC 산소 소기 시스템 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: glu-GOC</td><td>NA</td><td>NA</td><<td>strong>재고 농도: 100x Storage: 매번 신선하게 준비 재고 및 실험 레시피: Glu와 GOC를 동일한 비율로 혼합하고 이미징 직전에 1/100 최종 샘플 부피로 추가합니다 Storage, 취급, 문제 해결 참고 사항: Guanosine triphosphate를 이미징하기 직전에 Glu 및 GOC에서 준비</td></tr><tr><td> &nbsp; 종이에 사용되는 약어: GTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0461</td><td>재고 농도: 100 mM Storage: 100 &mu; L 부분 표본 -20&ordm; C</td></tr><tr><td>인스턴트 믹스 1분 에폭시 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: 에폭시</td><td>록타이</td>트 <td>1366072&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kinesin-1 401 BIO 6x HIS &nbsp; 종이에 사용되는 약어: kinesin</td><td>Syracuse University의 JL Ross Lab에서 준비</td><td>NA</td><<td>strong>주식 농도: 8.87 &mu; PEM의 M Storage: 일회용 부분 표본, -80&ordm; C, 동결-해동 주기를 피하십시오 보관, 취급, 문제 해결 참고: biotinylated dimers는 kinesin 클러스터를 형성하며, 각 부분 표본은 4&ordm에서 얼음에 최대 12시간 동안 저장할 수 있습니다. C</td></tr><tr><td>NeutrAvidin &nbsp; 종이에 사용되는 약어: NA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>재고 농도: PEM에서 5 mg/ml 저장: 건조, -20&ordm; C 재고 및 실험 조리법: PEM No에서 5 mg/ml로 분말을 재구성</td></tr>하십시오 <tr><td>1. 유리 커버슬립 (24 mm x 24 mm) &nbsp; 종이에 사용된 약어: 커버슬립</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-548-CP</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel&nbsp; &nbsp; 종이에 사용되는 약어: Taxol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3456</td><td>재고 농도: DMSO에서 2mM 저장: 빛으로부터 보호, 건조, -20°ordm; C 재고 및 실험 레시피: DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: 사용 직전에 200 &mu로 희석; DMSO에서 M (0.4 &mu; 3.6 &mu의 L; L DMSO)</td></tr><tr><td>PEM-100 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: PEM</td><td>NA</td><td>NA</td><<td>strong>재고 농도: 1x 보관: 실온(RT) 재고 및 실험 레시피: 100mM K-파이프(pH 6.8), 2mM EGTA, 2 mM MgCl2 Storage, Handling, Troubleshooting 참고: KOH를 사용하여 pH를 6.8로 조정하고, pH를 자주 재확인하고 그에 따라 조정하십시오</td></tr>. <tr><td>phalloidin 종이에 사용되는 약어: phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3457</td><td>stock 농도: 100 &mu; DMSO의 M Storage: 빛으로부터 보호, 건조, -20°C; C, 보관 / 취급 조건 < 밀접하게 준수 / > < 강한> 재고 및 실험 조리법 : < / 강한> 100 &mu로 재구성; M with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting 참고: 제조 및 변성 시 불순물에 취약, 샘플에서 액틴의 큰 비정질 응집체로 식별 가능</td></tr><tr><td>돼지 뇌 tubulin &nbsp; 종이에 사용되는 약어: tubulin</td><td>Cytoskeleton</td><td>T240</td><td>재고 농도: PEM에서 5 mg/ml 저장: 일회용 분취량, -80&ordm; C, 동결-해동 주기를 피하십시오 재고 및 실험 레시피: PEM에서 분말을 5 mg/ml로 재구성, LN2 저장, 취급, 문제 해결로 급속 동결 참고: 각 부분 표본은 4&ordm에서 얼음에 저장된 최대 12시간 동안 사용할 수 있습니다. C</td></tr><tr><td>염화칼륨 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: KCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9640G</td><td>재고 농도: 4 M Storage: RT</td></tr><tr><td>Rabbit skeletal actin &nbsp; 종이에 사용되는 약어: actin</td><td>Cytoskeleton</td><td>AKL99</td><td>재고 농도: G-buffer Storage: 일회용 부분 표본, -80&ordm; C, 동결-해동 주기를 피하십시오 재고 및 실험 레시피: G-buffer에서 2 mg/ml로 재구성, LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: -80&ordm에서 제거되면; C, 상점&nbsp; 4&ordm에서 얼음 위의 분취량; C, 최대 1주일까지 사용 가능</td></tr><tr><td>토끼 골격 미오신 II &nbsp; 종이에 사용되는 약어: myosin</td><td>Cytoskeleton</td><td>MY02</td><td>재고 농도: PEM에서 10 mg/ml 저장: 일회용 분취량, -80&ordm; C, 동결-해동 주기를 피하십시오 stock 및 실험 조리법: PEM에서 분말을 10 mg/ml로 재구성, LN2 저장, 취급, 문제 해결을 사용한 플래시 동결 참고: 단량체는 낮은 KCl에서 미니필라멘트를 형성하며, 각 부분 표본은 4&ordm에서 얼음에 최대 12시간 동안 저장할 수 있습니다. C</td></tr><tr><td>Tubulin (비오틴) : 돼지 뇌 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: biotin-tubulin</td><td>Cytoskeleton</td><td>T333P</td><td>재고 농도: PEM에서 5 mg/ml 저장: 일회용 부분 표본, -80&ordm; C, 동결-해동 주기를 피하십시오 재고 및 실험 레시피: PEM에서 분말을 5mg/ml로 재구성, LN2 보관, 취급, 문제 해결로 급속 동결 참고: 사용 직전에 PEM</td></tr><tr><td>Tubulin(형광 HiLyte 488)에서 0.5mg/ml로 희석합니다. 돼지 뇌 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: 488-tubulin</td><td>Cytoskeleton</td><td>TL488M</td><td>재고 농도: PEM에서 5 mg/ml 저장: 일회용 분취량, -80&ordm; C, 동결-해동 주기를 피하십시오 재고 및 실험 레시피: PEM에서 분말을 5 mg/ml로 재구성, LN2 저장, 취급, 문제 해결로 급속 동결 참고: 각 부분 표본은 4&ordm에서 얼음에 저장된 최대 12시간 동안 사용할 수 있습니다. C, 가벼운</td></tr><tr><td>튜불린 (로다민)으로부터 보호 : 돼지 뇌 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: R-tubulin</td><td>Cytoskeleton</td><td>TL590M</td><td>재고 농도: PEM에서 5 mg/ml 저장: 일회용 부분 표본, -80&ordm; C, 동결-해동 주기를 피하십시오 재고 및 실험 레시피: PEM에서 분말을 5 mg/ml로 재구성, LN2 저장, 취급, 문제 해결로 급속 동결 참고: 각 부분 표본은 4&ordm에서 얼음에 저장된 최대 12시간 동안 사용할 수 있습니다. C, 빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>트윈 20 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: Tween20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J20605. AP</td> <td> 재고 농도 : DI H 2 0 / < > 저장 : RT</td></tr><tr><td>초 원심 분리기 등급 마이크로 튜브 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: Beckman-Coulter Optima Max XP&nbsp;</td><td>Beckman Coultier</td><td></td> <td>343776Storage, Handling, Troubleshooting 참고: 8x34 mm PC</td></tr><tr><td>UV 광 경화 접착제 &nbsp; 종이에 사용되는 약어: UV 접착제</td><td>Pharda</td><td>SKG-2869</td><td></td></tr></tbody></table>

조정 가능한 모터 구동 역학 및 역학을 사용한 actin-microtubule 복합재 재구성 및 특성화

Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics

반유연한 액틴 필라멘트와 단단한 미세소관의 상호 작용 네트워크로 구성된 복합 세포 골격은 미오신 II 및 키네신과 같은 운동 단백질을 사용하여 이동, 세포질 분열, 접착 및 기계 감지와 같은 주요 프로세스를 구동하는 힘을 재구성하고 생성합니다. 액틴-미세소관 상호작용은 세포골격의 다양성과 적응성의 핵심이지만, 미오신 및 키네신 활성과의 상호작용에 대한 이해는 아직 초기 단계입니다. 이 작업은 미오신 II 및 키네신 모터에 의해 구동되고 액틴, 미세 소관, 운동 단백질 및 수동 가교제의 상대적 농도에 의해 조정되는 활성 구조 조정 및 탄도 운동을 겪는 공동 얽힌 액틴 필라멘트 및 미세 소관의 조정 가능한 3 차원 복합 네트워크를 엔지니어링하는 방법을 설명합니다. 다중 스펙트럼 컨포칼 이미징을 사용하여 복합 구조 조정 및 모션을 가장 효과적으로 시각화하기 위한 미세소관 및 액틴 필라멘트의 형광 라벨링 프로토콜도 자세히 설명되어 있습니다. 마지막으로, 비평형 구조, 역학 및 역학을 정량적으로 특성화하는 데 사용할 수있는 데이터 분석 방법의 결과가 제시됩니다. 이 조정 가능한 생체 모방 플랫폼을 재현하고 조사하면 결합 된 운동 활동, 복합 역학 및 필라멘트 역학이 유사 분열에서 분극, 기계 감각에 이르기까지 무수한 세포 과정으로 이어질 수있는 방법에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

이 논문은 공동 얽힌 액틴 필라멘트와 미세 소관의 조정 가능한 3차원 복합 네트워크를 엔지니어링하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 복합 재료는 미오신 II 및 키네신 모터에 의해 구동되는 능동적 구조 조정 및 탄도 운동을 거치며 액틴, 미세 소관, 운동 단백질 및 수동 가교제의 상대적 농도에 의해 조정됩니다.

조정 가능한 모터 구동 역학 및 역학을 사용한 Actin-Microtubule 복합재 재구성 및 특성화

The composite cytoskeleton, comprising interacting networks of semiflexible actin filaments and rigid microtubules, restructures and generates forces ...

우리의 연구는 키네신 및 미오신 모터에 의해 구동되는 액틴과 미세소관의 복합체를 엔지니어링하여 능동적으로 조정, 구조 조정 및 이동함으로써 세포 골격 재구성 노력을 세포 조건을 모방하는 데 중요한 한 걸음 더 다가가게 합니다. 복합 재료의 역학과 구조는 수축, 감염, 탈모, 조잡함 및 파열의 풍부한 위상 기반을 나타내기 위해 다양한 구성 요소를 독립적으로 추가, 제거 및 조정하여 정밀하게 프로그래밍할 수 있습니다. 우리의 접근 방식은 단일 시스템에서 서로 다른 기판에 작용하는 여러 힘 생성 구성 요소를 통합하는 활성 물질 플랫폼을 설계, 생성 및 특성화하는 데 광범위하게 적용됩니다.절차를 시연하는 것은 Daisy Achiriloaie와 Maya Hendija가 될 것입니다. 우리 연구실의 학부 연구원. 먼저 마이크로 피펫과 멸균 피펫 팁을 사용하여 시약을 멸균 검정색 1.5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 추가하여 미세소관 쌍 사이에 결합하고 힘을 가하는 Kinesin 모터 클러스터를 형성합니다.용액을 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 30 분 동안 용액을 배양하고 빛으로부터 보호하십시오. 액톤 필라멘트와 미세 소관의 얽힌 복합 네트워크를 준비하려면 열 블록을 섭씨 37도로 설정하십시오.시약을 멸균 0.6 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 첨가하십시오. 총 부피가 25 마이크로 리터인지 확인하십시오. 용액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합하고 빛으로부터 보호되는 섭씨 37도의 열 블록에 1시간 동안 놓습니다.그런 다음 열 블록에서 튜브를 제거하고 마이크로 피펫을 사용하여 0.84 마이크로 리터의 100 마이크로 몰 팔로이딘을 부드럽게 혼합합니다. 빛으로부터 보호되는 실온에서 5-10 분 동안 배양하십시오. conf 초점 이미징을 위한 활성 복합재를 준비하려면 용액에 시약을 추가하고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.용액을 3 개의 10 마이크로 리터 분취량으로 나누고 K, K 플러스 M 및 음성 대조군으로 표시합니다. K 플러스 M 분취량에 2.54 마이크로리터의 미오신을 첨가하고 K 및 음성 대조군 분취량에 2.54 마이크로리터의 PEM을 첨가한다. 그런 다음 2.5마이크로리터의 Kinesin 클러스터를 K 및 K에 더한 M 분취량과 피펫을 위아래로 추가하여 혼합합니다.다음으로, 동일한 기술을 사용하여 음성 대조군에 2.5 마이크로 리터의 PEM을 첨가하십시오. 마이크로피펫을 사용하여 모세관 작용을 통해 각 용액을 샘플 챔버의 해당 채널로 천천히 흐르게 합니다. 채널에 기포가 유입되지 않도록 피펫을 매우 천천히 부드럽게 누릅니다.각 채널의 두 열린 끝을 속건성 에폭시 또는 UV 경화 접착제로 밀봉하십시오. 접착제가 완전히 건조되면 현미경에 채널을 놓아 가능한 한 초기 비활성 상태에 가깝게 합성물을 이미지화합니다. 먼저 K 채널과 K 플러스 M 채널을 이미지화한 다음 제어 채널을 이미지화합니다.Kinesin 클러스터를 K 및 K에 더한 M 부분 표본에 추가한 후 데이터 수집을 시작할 때까지 경과된 시간을 확인합니다. 액틴을 액틴 또는 AA 가교제로 준비하려면 비오틴-액틴, 뉴트라비딘, 비오틴 및 PEM을 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 유사하게, 미세소관에서 미세소관 또는 MM 가교제로의 경우, 비오틴-튜불린, 뉴트라비딘, 비오틴 및 PEM을 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.튜브를 열가소성 천장 필름으로 감싸 방수 밀봉을 만들고 90분 동안 섭씨 4도로 설정된 온도 제어 음파 수조의 부양 뗏목에 넣습니다. 이미징을 위해 A-A 가교제 복합체를 샘플에 통합하려면 시약을 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 총 부피가 25 마이크로 리터인지 확인하십시오.유사하게, M-M 가교제 복합체의 경우, 화면에 표시된 시약을 마이크로 원심분리 튜브에 첨가합니다. 위아래로 피펫팅하여 용액을 혼합하고 빛으로부터 보호되는 섭씨 37도의 열 블록에 1시간 동안 놓습니다. 그런 다음 열 블록에서 튜브를 제거하고 마이크로 피펫을 사용하여 0.84 마이크로 리터의 100 마이크로 몰 팔로이딘을 혼합합니다.빛으로부터 보호되는 실온에서 5-10분 동안 배양하고 앞서 설명한 절차를 반복하여 컨포칼 이미징을 위한 활성 복합재를 준비합니다. 액틴 모노파이버와 튜불린 이량체는 공동 중합되어 액틴 필라멘트와 미세소관의 공동 얽힌 네트워크를 형성합니다. Myosin 두 개의 미니 필라멘트와 Kinesin 클러스터는 필라멘트를 밀고 당겨 복합 재료를 정상 상태에서 벗어나게 합니다.수동 가교는 NeutrAvidin을 사용하여 비오틴화된 액틴 필라멘트 또는 미세소관을 연결합니다. 미오신 두 개의 미니 필라멘트, 키네신 클러스터 또는 두 모터는 수동 가교, 액틴-액틴 가교결합 및 미세소관-미세소관 가교결합이 없는 복합재에 통합됩니다. 다양한 미오신 농도와 몰 액틴 분획을 가진 미오신 구동 세포 골격 복합체의 두 가지 컬러 컨포칼 이미징이 여기에 표시됩니다.입자 이미지 속도계는 액틴 미오신 활성이 공동 얽힌 복합체에서 액틴과 미세 소관의 조정 된 수축 역학을 유발한다는 것을 보여줍니다. 여기서 다른 화살표 색상은 벡터 필드의 오른쪽에있는 색상 스케일에 표시된 다른 속도에 해당합니다. 시간 분해 미분 동적 현미경은 시계열의 미세소관 및 액틴 채널에 대해 수행되어 액틴 및 미세소관 모두에 대한 붕괴 시간 대 파수의 특성을 결정합니다.수축 속도는 각 45분 시계열의 전체 기간 동안 모든 지연 시간에 대해 평균화된 감쇠 시간 곡선에 대한 피팅을 통해 결정됩니다. 시간 분해 미분 동적 현미경은 액틴 및 미세소관의 활성화 시간 45분 동안 연속 6분 간격으로 붕괴 시간을 평가하여 시간에 따른 역학이 어떻게 변하는지를 정량화합니다. 액틴 필라멘트 및 미세소관에 대한 시간 분해 수축 속도는 피팅에서 해당 붕괴 시간 곡선까지 결정됩니다.공간 이미지 자동 상관 분석은 실험 시작 시 서로 다른 네트워크에 대한 자동 상관 곡선을 종료와 비교하여 활성 세포골격 구성 요소의 모터 구동 구조 조정을 정량화합니다. 자동 상관 곡선의 지수 피팅을 통해 결정된 시간 분해 상관 길이는 실질적으로 재구성되는 복합재에 비해 재구성되지 않는 복합재를 보여줍니다. Kinesin 구동 액틴 미세소관 복합재의 2가지 컬러 컨포칼 이미지는 시간이 지남에 따라 가교제 복합재가 느슨하게 연결된 미세소관이 풍부한 클러스터로 재구성되지 않는 제형 의존적 구조 조정을 보여줍니다.액틴-액틴 가교는 액틴 미세소관 공동 국소화를 지원하는 반면, 미세소관-미세소관 가교결합은 D 혼합을 향상시킵니다. 미분 동적 현미경 및 공간 이미지 자동 상관 분석은 복합재의 시간에 따라 변하는 역학 및 구조에 대한 가교 및 경쟁 마이신 및 Kinesin 모터의 효과를 보여줍니다. 세포 조건을보다 밀접하게 모방하기 위해 연구자들은 중간 필라멘트, 다른 모터 및 필라멘트 길이와 강성을 제어하는 결합 단백질을 통합 할 수 있습니다.광학 핀셋 계측 측정을 수행하여 복합 역학을 특성화할 수도 있습니다. 우리의 접근 방식을 사용하여 연구원들은 전례 없는 위상 공간에서 세포 골격에서 영감을 받은 복합 활성 물질의 역학과 구조를 정밀하게 조정하여 다양한 세포 프로세스를 에뮬레이트하고 재구성 가능한 프로그래밍 가능한 재료를 엔지니어링할 수 있습니다.

reconstituting-characterizing-actin-microtubule-composites-with

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

선물이 분자 셔틀 만들려고 프로토콜 표면 준수 kinesin 모터 단백질 염색 이라는 microtubules을 추진. 표면으로 kinesins의 약한 상호 작용 그것에 그들의 뒤집을 수 있는 첨부 파일을 수 있습니다. 이 전시 하는 동적 어셈블리 및 그것의 기능을 유지 하면서 부품의 분해는 나노 시스템을 만듭니다.

Kinesins 연결 된 조립 분자 셔틀 역에 의해 구동

시험관 내에서 액토미오신 다발의 형성 및 광학 핀셋을 사용한 미오신 앙상블 힘 생성 측정이 제시되고 논의됩니다.

광학 핀셋을 사용하여 액틴 필라멘트 번들에서 미오신 앙상블 역학 조사

여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

우리는 형광 현미경과 함께 간단한 액틴 필라멘트 미세 유체 분석을위한 프로토콜을 제시하여 개별 액틴 필라멘트를 실시간으로 정확하게 모니터링하면서 순차적으로 다른 단백질 용액에 노출 할 수 있습니다.

미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구

이 기사는 MAP65, 식물 기반 미세 소관 가교제 및 PEG를 크라우밍 제로 사용하여 촉각제 모양의 미세 소관 어셈블리를 형성하기위한 프로토콜을 제시합니다.

미세 소관 선인장체의 자체 조립

이 프로토콜은 형광 현미경을 사용하여 재구성된 막 연결 세포골격 네트워크의 역학을 연구하기 위해 지지된 지질 이중층의 형성과 세포골격 필라멘트 및 운동 단백질의 추가를 설명합니다.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

이 프로토콜은 시험관내 총 내부 형광 (TIRF) 현미경 분석을 사용하여 동적 액틴 및 미세 소관을 시각화하기위한 가이드입니다.

액틴과 미세소관 커플링 다이내믹스 를 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경으로 시각화

이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 단백질 성분을 사용하여 구슬 표면에 액틴 혜성을 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 시스템은 세포에서 발견되는 돌출 구조를 모방하고 단순화 된 방식으로 힘 생산의 생리적 메커니즘을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.

상업적으로 이용 가능한 단백질을 사용한 액틴 기반 운동성의 재구성

여기에서는 정제된 단백질로부터 준2차원(2D) 얽힘, 가교 및 액정 액틴 어셈블리를 준비하는 방법을 제시합니다.

Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops (시험관 내 활성 활성 어셈블리의 수축성 및 변형 모드 조정: 2차원 활성 네트워크에서 액정 방울까지)

이 프로토콜은 미세소관 고분자 역학을 조사하는 데 적합한 미세유체 장치의 설계 및 제작에 대해 자세히 설명합니다. 미세 가공, 자동화된 흐름 제어 및 컴퓨터 모델링 기술의 합성은 세포 세포골격을 in vitro 프로빙하는 데 이상적으로 적합한 유연한 시스템을 가능하게 합니다.

미세소관 고분자 역학 조사를 위한 미세유체역학 기반 접근법 개발

학습하세요 키네신과 미오신 모터를 이용한 액틴-미세소관 복합재 재구성 및 역학 특성화 방법을. 이 기술은 세포 환경 모방 및 합성 생물학 연구에 활용됩니다.

조정 가능한 모터 구동 역학 및 역학을 사용한 Actin-Microtubule 복합재 재구성 및 특성화

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