Name: 선형 DNA 주형을 활용한 엑소뉴클레아제 결핍 세포 추출물의 무세포 단백질 합성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 배우세요 E. coli 엑소뉴클레아제 V 결핍 균주를 이용한 무세포 단백질 합성 방법입니다. 선형 DNA 주형을 직접 사용하여 클로닝 없이 빠른 단백질 발현과 생물학적 설계 프로토타이핑이 가능합니다.

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ACB와 JLF는 ANR SINAPUV 보조금(ANR-17-CE07-0046)의 자금 지원을 인정합니다. JLF와 JB는 ANR SynBioDiag 보조금(ANR-18-CE33-0015)의 자금 지원을 인정합니다. MSA와 JLF는 ANR iCFree 보조금(ANR-20-BiopNSE)의 자금 지원을 인정합니다. JB는 "COMPUCELL"(보조금 번호 657579)을 시작하는 ERC의 지원을 인정합니다. Centre de Biochimie Structurale은 프랑스 통합 구조 생물학 인프라 (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01)의 지원을 인정합니다. MK는 INRAe의 MICA 부서, Université Paris-Saclay, Ile-de-France (IdF) 지역의 DIM-RFSI 및 ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003)의 자금 지원을 인정합니다. 이 연구는 유럽 연구위원회 통합 상 (865973 CLB)을 통한 자금 지원으로 지원되었습니다.

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</ol>

여기에서 우리는 recB 또는 recBCD 오페론에 대한 게놈 녹아웃을 가진 대장균 BL21 Rosetta2에서 준비된 세포 용해물이 선형 DNA 주형에서 높은 단백질 발현을 지원한다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 선형 DNA 템플릿에 특이적인 단계별 용해물 보정 절차(그림 2)를 정교하게 설명하며, 이는 선형 DNA의 σ70 프로모터에서 높은 발현을 유도하여 등몰 DNA 농도에 대한 플라스미드 근처 수준에 도달하는 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 최종 응용 분야에서 사용되는 DNA 유형(선형 또는 플라스미드)에 따른 버퍼 교정의 중요성을 강조합니다.
이 프로토콜은 플라스미드 클로닝을 방지하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 시간과 비용면에서 상당한 이점을 제공합니다. 선형 DNA 단편은 상업적 제공자에 의해 합성되거나 실험실에서 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 플라스미드 ...

무세포 단백질 합성(CFPS) 시스템은 바이오센서 엔지니어링, 분산 제조 및 유전자 회로의 프로토타이핑을 위한 빠르고 간단하며 효율적인 방법으로 점점 더 많이사용되고 있습니다1. CFPS 시스템은 큰 잠재력으로 인해 합성 생물학 분야에서 정기적으로 사용됩니다. 그러나 지금까지 CFPS 시스템은 기술이 잠재력을 최대한 발휘하는 것을 제한할 수 있는 원형 플라스미드에 의존합니다. 플라스미드 DNA를 준비하는 것은 클로닝 및 다량의 DNA 분리 중 많은 시간이 소요되는 단계에 따라 달라집니다. 반면에, 플라스미드 또는 합성된 DNA 주형으로부터의 PCR 증폭은 몇 시간 내에 CFPS 주형을 간단히 제조하는데 사용될 수 있다(2,3). 따라서 선형 DNA의 적용은 CFPS에 대한 유망한 솔루션을 제공합니다. 그러나, 선형 DNA는 세포 추출물4에 자연적으로 존재하는 엑소뉴클레아제에 의해 빠르게 분해된다. λ- 파지 GamS 단백질5 또는 카이 사이트6을 포함하는 DNA를 보호제로 사용하거나 말단 2,7,8,9의 화학적 변형으로 선형 DNA를 직접 보호하는 것과 같이이 문제를 해결하는 솔루션이 있습니다. 이러한 모든 방법은 세포 추출물에 대한 보충이 필요하며 비용과 시간이 많이 소요됩니다. 엑소 뉴 클레아 제 V 복합체 (RecBCD)가 세포 용해물4에서 선형 DNA를 분해한다는 것은 오랫동안 알려져 왔습니다. 최근에 우리는 선형 DNA가 엑소뉴클레아제 유전자(recBCD)10에 대해 녹아웃된 세포의 용해물에서 훨씬 더 잘 보호될 수 있음을 보여주었습니다.
이 프로토콜에서는 초음파 용해에 의한 대장균 BL21 Rosetta2 ΔrecBCD 균주로부터 무세포 용해물을 제조하는 단계를 자세히 설명합니다. 초음파 처리 용해는 여러 실험실11,12에서 사용하는 일반적이고 저렴한 기술입니다. 이 균주에서 생산된 추출물은 선형 DNA 주형으로부터의 발현을 지원하기 위해 추가 성분 또는 DNA 주형 변형을 추가할 필요가 없습니다. 이 방법은 특히 천연 대장균 프로모터의 선형 DNA 발현을 위한 세포 추출물에 대한 완충액 최적화의 필수 단계에 의존합니다. 선형 DNA 발현을 위한 이러한 특이적 완충액 최적화는 천연 σ70 프로모터가 PCR 산물10의 정제를 피하더라도 GamS 단백질 또는 Chi DNA 보충 없이 높은 단백질 생산을 산출하는 열쇠인 것으로 나타났습니다. 선형 DNA 발현을 위한 Mg-glu의 최적 농도는 플라스미드 DNA에 대한 농도와 유사한 것으로 밝혀졌다. 그러나, K-glu의 최적 농도는 전사 관련 메커니즘10에 기인 한 선형 및 플라스미드 DNA 사이에 상당한 차이를 보였다. 이 방법을 사용하여 발현된 단백질의 기능은 토홀드 스위치의 신속한 스크리닝 및 효소 변이체10의 활성 평가와 같은 여러 응용 분야에서 입증되었습니다.
이 프로토콜은 돌연변이 ΔrecBCD 세포 추출물과 선형 DNA에 대한 특정 보정을 주형으로 사용하여 대장균 무세포 시스템에서 선형 DNA 주형을 사용하기 위한 간단하고 효율적이며 비용 효율적인 솔루션을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>2-YT Broth</td><td>Invitrogen</td><td>22712020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Safe-Lock 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1.5 mL 마이크로튜브</td></tr><tr><td>384웰 정사각형 바닥 마이크로플레이트</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>adhesive plate seal</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td></td><td></td>232701</tr><tr><td>Agar</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td></td></tr><tr><td>ATP (아데노신 5'-트리포스페이트 디소듐 염 수화물)</td><td>시그마-알드리치</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>BL21 로제타2 머</td><td>크 밀리포어</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>BL21 로제타2 &델타; recB</td><td>Addgene</td><td>176582</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 &Delta; recBCD</td><td>Addgene</td><td>176583</td><td></td></tr><tr><td>cAMP (아데노신 3' 5'-사이클릭 모노포스페이트)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>클로람페니콜&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>CoA(코엔자임 A 수화물)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>Corning 15mL PP 원심분리기 튜브, CentriStar 캡이 포함된 랙 포장, 멸균</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>15mL 튜브</td></tr><tr><td>Corning 50mL PP 원심분리기 튜브, CentriStar 캡이 있는 원뿔형 바닥, 멸균</td><td>코닝</td><td>430828</td><td>50mL 튜브</td></tr><tr><td>CTP(시티딘 5'-트리포스페이트, 이나트륨염) 수화물)</td><td>Alfa Aesar</td><td>&nbsp; J62238</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-디티오트레이톨)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>폴린산 (고체 폴린산 칼슘염)</td><td>시그마-알드리치</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>GTP (구아노신 5?-삼인산,&nbsp; 디소듐 솔트)</td><td>시그마-알드리치</td><td>371701</td><td></td></tr><tr><td>헤페스</td><td>시그마-알드리치</td><td>&nbsp; H3375</td><td></td></tr><tr><td>K 인산염 이염기성 (K2HPO4)</td><td>Carl Roth</td><td>231-834-5</td><td></td></tr><tr><td>K 인산 모노베이직 (H2KO4P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>K-글루타메이트</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17232</td><td></td></tr><tr><td>Mg-글루타메이트&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP 주사기 필터 유닛, 0.22 &마이크로; m, 폴리 에테르 설폰</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>막 필터 0.22 &micro; m</td></tr><tr><td>모나크 PCR & DNA 클린업 키트</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td>PCR 및 DNA 정리 키트</td></tr><tr><td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td><td>NEB</td><td>T1010S</td><td>Plasmid Miniprep Kit</td></tr><tr><td>NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate)&nbsp;</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>NIST-추적 가능한 FITC 표준</td><td>Invitrogen</td><td>F36915</td><td>NIST-FITC</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi 키트</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740414.1</td><td>Plasmid Maxiprep 키트</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>Biotek&nbsp;</td><td>Synergy HTX</td><td></td></tr><tr><td>정제 재조합 EGFP 단백질</td><td>Chromotek</td><td>egfp-250</td><td>재조합 eGFP</td></tr><tr><td>Q5 고충실도 2X 마스터 믹스</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>DNA 중합효소</td></tr><tr><td>Q5 고충실도 2X 마스터 믹스</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492L</td><td>DNA 중합효소</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 어세이 키트</td><td>Thermo</td><td>Q32850</td><td>DNA 결합 염료 형광 어세</td>이</tr><tr><td>RTS 아미노산 샘플러</td><td>biotechrabbit</td><td>BR1401801</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>멸균수</td><td></td><td></td><td>Millipore RiOs 8 시스템의 정제수, 고압멸균으로 멸균.</td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>생명 과학 제품 싸이티바</td><td>17-1321-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>초음파 프로세서 Vibra cell VC-505</td><td>SONICS</td><td>VC505</td><td>초음파 발생기</td></tr><tr><td>UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate)</td><td>Acros Organics&nbsp;</td><td></td><td></td>226310010</tr><tr><td>물, 뉴클레아제가 없는</td><td>Thermo</td><td>R0581</td><td>뉴클레아제가 없는 물</td></tr></tbody></table>

선형 dna 주형을 활용한 엑소뉴클레아제 결핍 세포 추출물의 무세포 단백질 합성

Cell-Free Protein Synthesis from Exonuclease-Deficient Cellular Extracts Utilizing Linear DNA Templates

무세포 단백질 합성(CFPS)은 최근 수많은 장점으로 인해 합성 생물학 분야에서 매우 인기를 얻고 있습니다. CFPS에 선형 DNA 템플릿을 사용하면 클로닝, 형질 전환 및 플라스미드 추출 단계를 제거하여 실험 시간을 단축하여 기술이 잠재력을 최대한 발휘할 수 있습니다. 선형 DNA는 PCR에 의해 빠르고 쉽게 증폭되어 고농도의 주형을 얻을 수 있으므로 잠재적인 생체 내 발현 독성을 피할 수 있습니다. 그러나, 선형 DNA 주형은 세포 추출물에 자연적으로 존재하는 엑소뉴클레아제에 의해 빠르게 분해된다. 이 문제를 해결하기 위해 뉴클레아제 억제제를 추가하거나 보호를 위한 선형 DNA 말단의 화학적 변형과 같은 몇 가지 전략이 제안되었습니다. 이러한 모든 전략은 추가 시간과 자원을 소비하며 아직 플라스미드에 가까운 수준의 단백질 발현을 얻지 못했습니다. CFPS에 선형 DNA 템플릿을 사용하기 위한 대체 전략에 대한 자세한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 엑소뉴클레아제 결핍 녹아웃 세포의 세포 추출물을 사용하면 선형 DNA 주형이 최종 변형 없이 그대로 유지됩니다. 우리는 선형 DNA에 대해 특히 Mg-글루타메이트 (Mg-glu) 및 K- 글루타메이트 (K-glu)에 대한 초음파 용해 및 완충액 보정에 의한 대장균 BL21 Rosetta2 ΔrecBCD 균주에서 세포 용해물의 준비 단계를 제시합니다. 이 방법은 대장균 CFPS의 플라스미드 DNA와 유사한 단백질 발현 수준을 달성할 수 있습니다.

대표적인 결과는 선형 및 플라스미드 DNA에 대해 별도로 최적의 Mg-글루타메이트 및 K-글루타메이트 수준에 대한 용해물을 보정한 후 여기에 표시됩니다(그림 1). Mg- 글루타메이트 최적 농도는 8mM에서 Δ recB 및 ΔrecBCD 추출물에서 유사합니다 (그림 1B). 그러나 플라스미드 DNA에 대한 최적의 K- 글루타메이트 농도는 140mM인 반면, 동일한 추출물에 대한 선형 DNA의 최적 K- 글루타메이트 농도는 20mM입니다 (그림 1C). WT 및 ΔrecBCD 세포로부터의 추출물에서의 GFP 발현의 비교 분석에서, 추출물의 완충액 조성은 엑소뉴클레아제 V 결실 추출물에 사용된 선형 및 플라스미드 DNA로부터 최적의 발현을 위해 특이적으로 보정되어야 한다는 것을 알 수 있었다.
<p class="jove...

여기에 제시된 것은 대장 균 BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD 및 ΔrecB)의 엑소 뉴 클레아 제 V 녹아웃 균주로부터 세포 추출물의 제조 및 완충액 교정을위한 프로토콜입니다. 이것은 선형 DNA 주형을 사용하는 무세포 단백질 합성 시스템에서 발현을 위한 빠르고 쉽고 직접적인 접근 방식입니다.

선형 DNA 주형을 활용한 엑소뉴클레아제 결핍 세포 추출물의 무세포 단백질 합성

Cell-free protein synthesis (CFPS) has recently become very popular in the field of synthetic biology due to its numerous advantages. Using linear DNA ...

이 프로토콜은 천연 E.coli 매개 변수에서도 무세포 단백질 합성 시스템에서 선형 DNA 템플릿을 빠르고 쉽고 직접 사용할 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 주요 장점은 복제, 선형 DNA 말단의 화학적 변형 및 감마 또는 카이 DNA와 같은 보호 보충제를 피함으로써 절약되는 시간입니다. 관심있는 다양한 유기체에 대한 자체보고 합성 추출물이 개발됨에 따라 당사의 방법은 선형 DNA를 사용하여 해당 추출물의 프로토 타이핑 속도를 높이는 방법을 제시합니다.시작하려면 BL21 Rosetta-2 델타 recBCD를 섭씨 영하 80도에서 클로람페니콜 밀리리터당 10마이크로그램을 포함하는 2x YTP 한천 플레이트에 연속 스트릭 스팅하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 한천 플레이트에서 단일 콜로니를 밀리리터당 10마이크로그램의 클로람페니콜이 보충된 40밀리리터 이상의 2x YTP에 접종하고 섭씨 37도에서 200RPM 진탕으로 밤새 배양합니다. 다음으로, 하룻밤 배양액을 100배 희석하여 클로람페니콜 밀리리터당 10마이크로그램을 포함하는 4리터의 신선한 2x YTP 배지로 계대배양을 만듭니다.4 리터의 미디어를 4 개의 개별 플라스크로 나눕니다. 섭씨 37도, 200RPM에서 약 3-4시간 동안 배양하여 1.5-2.0의 광학 밀도에 도달합니다. 배양 물을 얼음에 놓고 섭씨 4도에서 12 분 동안 5, 000 G에서 세포를 스핀 다운 한 다음 디캔팅하여 상청액을 버립니다.그런 다음 DTT로 냉각된 S30A 800ml에 셀 펠릿을 재현탁합니다. 다시, 세포를 이전에 입증된 바와 같이 섭씨 4도에서 12분 동안 5, 000 G에서 스핀다운하고 디캔팅하여 상청액을 버린다. DTT를 사용하여 냉각된 S30A 160ml에 세포 펠릿을 재현탁한 후 세포를 냉각되고 미리 계량된 50밀리리터 튜브로 옮깁니다.세포를 섭씨 4도에서 8분 동안 2000G에서 스핀다운한 다음 디캔팅하여 상청액을 버립니다. 다시, 세포를 섭씨 4도에서 4분 동안 2000G에서 스핀다운한 다음, 피펫을 사용하여 나머지 상청액을 조심스럽게 제거한다. 그런 다음 튜브의 무게를 다시 측정하여 셀 펠릿의 무게를 계산하고 셀 펠릿을 섭씨 영하 80도로 유지합니다.섭씨 영하 80도에서 세포 펠릿을 취한 후 얼음에서 1-2시간 동안 해동하고 세포 펠릿 무게 그램당 DTT 버퍼를 사용하여 0.9밀리리터의 S30A에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 피펫을 천천히 사용하여 세포를 재현탁하여 상단 거품을 최대한 피하십시오. 부유 세포의 1 밀리리터 분취량을 1.5 밀리리터 마이크로 튜브에 넣고 섭씨 4 도의 얼음이나 사전 냉각 된 콜드 블록에 보관하십시오.다음으로, 3주기 동안 20% 진폭의 설정으로 초음파 처리기의 각 튜브를 초음파 처리하고 섭씨 4도에서 10분 동안 12, 000G에서 용해물을 스핀다운합니다. 피펫으로 상청액을 수집 한 후 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 세포 용해물을 섭씨 37도에서 200RPM 교반으로 80분 동안 인큐베이션한다.용해물을 스핀다운하고 사전 냉각된 1.5-밀리리터 마이크로튜브에서 상청액을 수집한 후, 모든 튜브를 얼음 위에 유지하면서 사전 냉각된 PCR 8-스트립 튜브에 30 마이크로리터를 분취한다. 용해물 분취량을 드라이아이스에 급속 동결시키고 영하 80도에서 보관합니다. 원고에 설명된 대로 완충액 준비 탭에 따라 마스터 믹스를 준비합니다.10.5 마이크로 리터의 반응 부피의 경우 1.05 마이크로 리터의 다른 Mg- 글루타메이트 스톡 농도와 9.45 마이크로 리터의 마스터 믹스를 추가하고 부드럽게 혼합하십시오. 위의 반응물 10 마이크로리터를 384-웰 정사각형 바닥 마이크로플레이트에 피펫팅하고 접착 플레이트 씰을 사용하여 이를 덮는다. 분당 307 사이클의 연속 궤도 흔들림과 함께 섭씨 30도에서 8 시간 동안 배양 한 플레이트 리더로 일정한 간격으로 형광 데이터를 기록하여 유전자 발현을 형광 출력으로 측정합니다.종말점에서 가장 높은 형광 값을 초래하는 Mg-글루타메이트 농도를 확인한 후 K-글루타메이트 보정을 진행합니다. 실험을 실행하고 테스트된 K-글루타메이트 농도 중에서 가장 높은 형광 값을 식별하여 이 용해물에 대한 Mg-글루타메이트 및 K-글루타메이트에 대한 최적의 완충액 구성을 식별합니다. Mg- 글루타메이트 및 K- 글루타메이트 값이 설정되면 얻은 배치 부피에 따라 최적화 된 완충액 조성의 스톡 튜브를 준비하십시오.필요한 버퍼 튜브의 수를 계산 한 후 튜브 당 38 마이크로 리터를 분취하여 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 먼저, 최적의 마스터 믹스 준비를 위해 1.5밀리리터 마이크로튜브에 라벨을 붙입니다. 정확한 부피의 완충액과 용해물을 추가하고 부드럽게 혼합하십시오.그런 다음 먼저 DNA 샘플을 피펫팅한 다음 뉴클레아제가 없는 물을 피펫팅하고 마지막으로 최적의 마스터 믹스를 만듭니다. 플레이트 리더에 추가하기 직전에 무세포 반응을 피펫으로 부드럽게 혼합하고 기포를 피하십시오. 플레이트 리더에서 반응을 설정한 후, 키네틱 런은 분당 307주기의 연속 궤도 흔들림과 함께 섭씨 30도에서 8시간 동안 일정한 간격으로 형광 데이터를 기록했습니다.용해물의 보정 후, Mg-글루타메이트 최적 농도는 선형 및 플라스미드 DNA 모두에 대해 추출물에 걸쳐 8밀리몰에서 유사하였다. 그러나 플라스미드 DNA에 대한 최적의 K- 글루타메이트 농도는 140 밀리몰인 반면, 선형 DNA에 대한 최적의 K- 글루타메이트 농도는 20 밀리몰입니다. 보정 단계 후, 야생형, 델타 recB 및 델타 recBCD 추출물에서 선형 및 플라스미드 DNA 간에 GFP 발현 수준을 비교했습니다.선형 DNA의 GFP 발현은 델타 recB 및 델타 recBCD 균주의 추출물에서 플라스미드 DNA의 발현의 각각 102% 및 138%에 도달했습니다. 프로토콜에서 가장 중요한 것은 세포의 초음파 용해와 선형 및 플라스미드 DNA에 대한 버퍼 교정 단계, 특히 네이티브 매개 변수를 사용할 때입니다. 이 기술은 예를 들어 바이오센서, 효소 및 경로의 스크리닝 또는 합성 유전 회로의 프로토타이핑과 같은 무세포 시스템에서 생물학적 설계 테스트 속도를 높이는 데 도움이 됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

어렸을때 peptidyl - tRNAs를 포함하는 리보솜의 생화 학적 분석에 대한 주요 장애가 동일한 샘플의 다른 변이의 존재를했습니다, 분석되는 특정 mRNA 순서의 번역에 참여하지 리보솜. 우리는, 독점적으로, 관심의 초기 peptidyl - tRNA를 포함하는 변이를 정화하는 간단한 방법을 개발했습니다.

기능 및 구조 분석을위한 Peptidyl - tRNAs를 포함 번역 리보솜의 분리

출처: Wiegand, DJ, et al. 빠르게 성장하는 박테리아 Vibrio natriegens를 이용한 무세포 단백질 발현. J. Vis. Exp. (2019).이 비디오는 Vibrio natriegens 조 용해물을 기반으로 하는 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템을 사용하여 결합된 시험관 내 전사 및 번역을 수행하는 방법을 보여줍니다. 필수 성분이 포함된 마스터 믹스의 준비와 DNA 주형에서 기능성 단백질의 단계별 합성을 강조합니다.

박테리아 조세포 추출물을 사용한 무세포 단백질 발현

이 논문은 염색체 외 원형 DNA(eccDNA)를 정제하기 위한 Circle-Seq라는 민감한 방법을 제시합니다. 이 방법에는 컬럼 정제, 남아 있는 선형 염색체 DNA 제거, 롤링 서클 증폭 및 고처리량 염기서열분석이 포함됩니다. Circle-Seq는 진핵생물 eccDNA의 게놈 규모 스크리닝 및 게놈 불안정성 및 복제 수 변이 연구에 적용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 염색체 외 원형 DNA의 게놈 차원의 정화

우리는 봄에는에 셀 무료 유전자 식 실험을 수행 하기 위해 사용 될 수 있는 표면에 유전자 길이 DNA 분자의 동원 정지에 대 한 간단한 석판 절차를 설명 합니다.

다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지

셀-무료 식 시스템은 높은 처리량 합성과 중요 한 단백질의 심사에 대 한 강력 하 고 비용 효율적인 도구입니다. 여기, 우리는 플라스 미드 DNA, 선형 DNA, mRNA 서식 파일을 사용 하 여 급속 한 단백질 생산에 대 한 비 브리 오 natriegens 를 사용 하 여 셀 무료 단백질 식 시스템의 준비를 설명 합니다.

셀 무료 단백질 식을 사용 하 여 빠르게 성장 박테리아 비 브리 오 natriegens

우리는 원형 RNA를 생성하는 리포터 유전자를 복제하고 분석합니다. 이러한 리포터 유전자는 선형 접합을 분석하고 Alu 요소를 포함하는 구성물보다 큽합니다. 원형 RNA를 조사하기 위하여는, 구조물은 세포로 형질 감염되고 결과 RNA는 선형 RNA의 제거 후에 RT-PCR를 사용하여 분석됩니다.

원형 RNA를 분석하기 위해 미니유전자를 포함하는 Alu 요소 사용

연구 결과는 복제하거나 살아있는 세포를 사용하지 않고 합성 유전자 단편에서 단백질 검열 캠페인을 위한 DNA의 큰 (μg-mg) 양을 만들기 위한 프로토콜을 기술합니다. 최소 템플릿은 효소적으로 소화되고 원형화된 다음, 이더스말 롤링 서클 증폭을 사용하여 증폭됩니다. 세포 없는 발현 반응은 불정제 된 제품으로 수행 될 수있다.

세포 없는 시스템을 사용하여 단백질 프로토타이핑을 위한 최소선형 템플릿의 증폭을 위한 신속하고 효소적인 방법

이 프로토콜은 세포 없는 유전자 발현을 위한 세균성 용해를 생성하는 신속하고 간단한 방법을 설명하며, 대장균의 엔지니어링 된 균주를 사용하고 표준 실험실 장비만 필요합니다.

세균 세포 없는 Lysate의 신속하고 저렴하며 단순한 생산

잘 특성화 된 유전 부분은 새로운 유전 회로의 설계에 필요합니다. 여기에서는 유전 부분을 신속하게 특성화하기 위한 비용 효율적이고 처리량이 높은 방법을 설명합니다. 당사의 방법은 무세포 용해물, 복제를 방지하기 위한 선형 DNA, 처리량을 늘리고 반응량을 줄이기 위한 음향 액체 처리를 결합하여 비용과 시간을 줄입니다.

무세포 시스템을 사용한 유전 부분의 신속한 특성 분석

이 연구는 에스케리치아 콜라이 (E. coli )에서 세포 추출물을 제조한 후 24 시간 이내에 무세포 단백질 합성 (CFPS) 반응을 설명합니다. 무세포 자동 유도 (CFAI) 프로토콜에 대한 설명은 연구자의 감독을 줄이고 얻은 세포 추출물의 양을 늘리기 위해 개선 된 내용을 자세히 설명합니다.

무세포 자동 유도 워크플로우를 사용하여 24시간 이내에 세포에서 무세포 단백질 합성까지

이 프로토콜은 합성 세포를 구성하는 데 사용되는 CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템을 설명합니다. 다양한 마이크로 컴파트먼트에서 대표적인 결과를 제공하는 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 합성 세포 커뮤니티의 다양한 실험실에 대한 모범 사례를 수립하여 합성 세포 개발의 진전을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

합성 세포 구축을 위한 Cell-Free 단백질 합성 시스템

배우세요 E. coli 엑소뉴클레아제 V 결핍 균주를 이용한 무세포 단백질 합성 방법입니다. 선형 DNA 주형을 직접 사용하여 클로닝 없이 빠른 단백질 발현과 생물학적 설계 프로토타이핑이 가능합니다.

선형 DNA 주형을 활용한 엑소뉴클레아제 결핍 세포 추출물의 무세포 단백질 합성

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