Name: 단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 배우세요 smTIRF 현미경을 이용한 밀집된 지질 이중막에서 단일 분자 결합, 확산 및 조립 분석 방법을. 이 프로토콜은 막 생물물리학 연구에 필수적인 고밀도 환경에서 생체분자 거동을 정밀하게 관찰할 수 있게 합니다.

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저자는 ClyA 단백질에 대한 발현 플라스미드를 공유한 Benjamin Schuler 교수를 인정합니다. 이 작업은 휴먼 프론티어 과학 프로그램(RGP0047-2020)의 지원을 받았습니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에서는 막에 내장된 생체 분자에 대해 혼잡한 환경을 나타내는 지지된 지질 이중층(SLB)에 대한 단일 분자 실험을 시연합니다. 혼잡 한 환경은 배제 된 부피 효과를 생성하여 생체 분자 반응 1,2,39,40의 향상으로 이어집니다. 폴리머가 주로 이중층 외부의 부피를 차지하는 PEG- 지질 시스템의 경우,이 효과는 특히 큰 엑토 도메인을 갖는 분자 종에서 두드러진다. 따라서, 친 유성 염료에 비해, 수용체, 당 단백질 및 당지질과 같은 막에 내장 된 큰 친수성 분자의 확산이 현저히 감소 될 수있다. 토코페롤을 통해 막에 고정된 형광 추적자 DNA를 사용하여(그림 5), 우리는 이러한 군집 효과를 식별할 수 있습니다.
<p class="jov...

세포막은 매우 밀집되어 있고 복잡한 시스템입니다1. 분자 군집은 단백질 및 지질 2,3,4와 같은 막 결합 개체의 확산에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 유사하게, 수용체 이량체화 또는 막 복합체의 올리고머화와 같은 지질막에 대한 이분자 반응은 군집 5,6,7의 영향을 받습니다. 크라우더의 특성, 구성 및 농도는여러 가지 방법으로 막 결합, 확산성 및 단백질-단백질 상호작용을 제어할 수 있습니다8,9. 세포막의 막 밀집을 제어하고 임베디드 생체 분자에 미치는 영향을 해석하는 것이 어렵 기 때문에 연구자들은 대체 시험관 내 시스템10을 구축하려고 시도했습니다.
인공 군집 막에 대한 대중적인 접근법은 이중층 막을 중합체 (폴리에틸렌 글리콜, PEG와 같은)-접목 된 지질11,12로 도핑하는 것이다. 지지된 지질 이중층(SLB)에서 단백질 및 지질 역학을 시각화하는 동안 이러한 폴리머는 이중층을 기본 지지체에서 효과적으로 들어 올려 기본 음전하를 띤 기판(예: 유리)에서 막 내장 구성 요소를 추가로 보호합니다. 중합체의 크기 및 농도를 변화시킴으로써, 분자 군집의 정도뿐만 아니라 하부 고체 지지체로부터의 분리를 제어 할 수있다(13,14). 이는 막횡단 생체분자가 활성을 잃을 수 있는 폴리머 쿠션(15,16)이 없는 고체 기판 상에 지지된 지질 이중층(17,18,19)에 비해 명백히 이점이다. 더 중요한 것은 시험관 내에서 세포막의 혼잡한 환경을 요약할 수 있다는 것인데, 이는 많은 막 공정에 중요합니다.
멤브레인 상의 표면 그래프팅된 중합체는 또한 이들의 그라프팅 밀도에 따라 이들의 구성에 변화를 겪는다12. 낮은 농도에서는 막 표면 위에 버섯으로 알려진 엔트로피 코일 모양으로 남아 있습니다. 농도가 증가함에 따라, 이들은 상호작용하기 시작하고 풀리고 확장되는 경향이 있으며, 최종적으로 멤브레인(21) 상에 조밀한 브러시-형상 형성을 산출한다. 버섯에서 브러시 정권으로의 전이는 매우 이질적이며 고분자의 특성화 된 조건에서 나타나기 때문에 고분자 접목 막에 밀집하기 위해 잘 특성화 된 조건을 사용하는 것이 중요합니다. 최근 연구20과 비교하여, 우리는 막 횡단 생체 분자의 확산 수송 및 활성을 유지하는 혼잡 한 막 조성을 확인하고보고합니다.
이 프로토콜에서는 PEG화 지질 막을 생성하는 방법에 대해 논의하고 폴리머 구성의 두 가지 다른 정권(즉, 버섯과 브러시)에서 군집을 모방하는 PEG 밀도에 대한 권장 사항을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 이러한 밀집된 막에 내장된 분자에 대한 단일 분자 결합, 입자 추적, 광퇴색 데이터 수집 및 분석을 설명합니다. 먼저 철저한 세척 단계, 이미징 챔버 조립 및 PEG-SLB 생성에 대해 설명합니다. 둘째, 단일 분자 결합, 입자 추적 및 광퇴색 실험에 대한 세부 정보를 제공합니다. 셋째, i) 상대적 결합 친화도 추출, ii) 분자 확산 특성화, iii) 막상의 단일 분자 영화에서 단백질 어셈블리의 서브 유닛 계수에 대해 논의합니다.
이 시스템을 단일 분자 이미징으로 특성화했지만, 이 프로토콜은 지질막에 대한 생체 분자 반응에 대한 군집의 영향을 이해하는 데 관심이 있는 모든 막 생물물리학자에게 유용합니다. 전반적으로, 우리는 혼잡하고 지지된 지질 이중층을 만들기 위한 강력한 파이프라인과 함께 이에 대해 수행된 다양한 단일 분자 분석 및 해당 분석 루틴을 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>2.5ml 주사기</td><td>HMD Healthcare</td><td>Dispo Van, 2.5ml 투베르큘린</td><td>플라스틱 주사기</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Finar Chemicals</td><td>10020LL025</td><td></td></tr><tr><td>아크릴 시트</td><td></td><td></td><td>2mm 두께</td></tr><tr><td>의 아크릴 시트</td><td>BigiMall</td><td></td><td>2mm, 투명</td></tr><tr><td>목욕 초음파 발생기</td><td>Branson</td><td>CPX-1800</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마</td><td>528730</td><td>&nbsp; HPLC 등급</td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Avanti</td><td>700100</td><td></td></tr><tr><td>코플린 항아리</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>S6016</td><td>유리 커버 커버 슬립이있는 8 슬라이드 항아리</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>631-1574</td><td>24 mm X 50 mm</td></tr><tr><td>Cy3-DNA 스트랜드 IDT</td><td></td><td></td><td>GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3</td></tr><tr><td>시아닌 염료 (Cy3)</td> <td>Cytiva 생명 과학</td><td>PA23001</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Invitrogen</td><td>D3911</td><td>Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate) ('DiI'; DiIC18(3)))DNA</td></tr> <tr><td>커넥터 가닥 1</td><td>시그마 Aldrich</td><td></td><td>GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T</td></tr><tr><td>DNA 커넥터 가닥 2</td><td>시그마 Aldrich</td><td></td><td>CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT</td></tr><tr><td>DNA 토코페롤 가닥</td><td>생체체</td><td></td><td>Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA</td></tr><tr><td>DOPE-PEG2000</td><td>Avanti</td><td>880130</td><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)</td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td>3M</td><td>LF93010LE</td><td></td></tr><tr><td>드릴 비트(다이아몬드 코팅)</td><td></td><td></td><td>0.5 - 1mm</td></tr><tr><td>드릴링 머신</td><td>Dremel</td><td>220</td><td>워크스테이션</td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>형광 비드</td><td>Invitrogen</td><td>F10720</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>블루 스타</td><td></td><td>마이크로 슬라이드, PIC-1</td></tr><tr><td>유리 바이알</td><td>시그마</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>Lobachemie</td><td>00182</td><td>30% 용액, AR 등급</td></tr><tr><td>Labolene</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td></td><td>&nbsp; 세제</td></tr><tr><td>레이저 532nm</td><td>코히어런트</td><td>사파이어</td><td></td></tr><tr><td>레이저 커터</td><td>범용 레이저 시스템</td><td>ILS12.75</td><td></td></tr><tr><td>리사민 로다민 도프</td><td>Avanti</td><td>810150</td><td>1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(리사민 로다민 B 설포닐) (암모늄 염)</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Finar Chemicals</td><td>30932LL025</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수(PBS)</td><td></td><td></td><td>1X</td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick Plasma Inc</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti</td><td>850457</td><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine</td></tr><tr><td>프로그래밍 가능한 주사기 펌프</td><td>New Era 펌프 시스템</td><td>NE1010</td><td>고압 주사기 펌프</td></tr><tr><td>PTFE Caps</td><td>Sigma</td><td>27141</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 튜빙</td><td>Cole-Parmer</td><td>WW-06417-21</td><td>Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD</td></tr><tr><td>황산</td><td>SD 정밀 화학 98</td><td></td><td>%, AR 등급</td></tr><tr><td>TIRF 대물렌즈</td><td>올림푸스</td><td>UPLAPO100XOHR</td><td></td></tr><tr><td>진공 데시케이터</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

세포막은 생체 분자 반응 및 신호 전달을 위해 매우 밀집된 환경입니다. 그러나 지질과 단백질 상호 작용을 조사하는 대부분의 시험관 내 실험은 네이키드 이중층 막을 사용합니다. 이러한 시스템은 막-포매된 단백질 및 글리칸에 의한 군집의 복잡성이 부족하고 세포막 표면에서 발생하는 관련 부피 효과를 배제합니다. 또한, 지질 이중층이 형성되는 음전하를 띤 유리 표면은 막 횡단 생체 분자의 자유 확산을 방지합니다. 여기에서, 우리는 붐비는 지질 막에 대한 모방으로서 잘 특성화 된 중합체 - 지질 막을 제시한다. 이 프로토콜은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 공액 지질을 크라우더를 지지된 지질 이중층(SLB)에 통합하기 위한 일반화된 접근 방식으로 활용합니다. 먼저, 단일 분자 실험을 수행하기 위한 현미경 슬라이드 및 커버슬립의 세척 절차가 제시된다. 다음으로, PEG-SLB를 특성화하고 단일 분자 추적 및 광퇴색을 사용하여 생체 분자의 결합, 확산 및 조립의 단일 분자 실험을 수행하는 방법에 대해 논의합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 단일 분자 광퇴색 분석을 통해 붐비는 지질막에서 박테리아 기공 형성 독소 Cytolysin A(ClyA)의 나노기공 어셈블리를 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 예제 데이터셋이 포함된 MATLAB 코드도 포함되어 입자 추적, 확산 거동 추출, 소단위 계수와 같은 일반적인 분석을 수행할 수 있습니다.

PEG화된 막에서 ClyA 단백질의 결합 모니터링 단계 4.5 후, 결합 동역학은 시간 경과에 따라 막 표면에 결합하는 입자의 수를 플로팅하여 추정됩니다 (비디오 1). ClyA 단백질이 5mol% PEG2000 지질로 막에 결합하면 입자 밀도가 증가하고 포화 상태에 도달합니다(그림 5). 결합 된 입자 (청록색 원)에 맞는 지수 붕괴는 막 결합에 대한 시간 상수 (τb)를 제공합니다 (특히이 경우 초기 시점 [빨간색 원]은 적합하지 않음).
붐비는 막에서 DNA 추적자의 이동성 우리는 일반적으로 DNA 추적자(토코페롤로 막에 고정된 DNA), 친유성 추적자 염료(예: DiI) 또는 막 단백질(예: ClyA)을 사용하여 PEG 매개 군집 하에서 막을 특성화합니다. 표지된 추적 분자(25–100 pM)의 측면...

여기에서는 단일 분자 전반사 형광(smTIRF) 현미경을 사용하여 인공 군집 지질 막에서 단일 분자의 결합, 이동성 및 조립을 수행하고 분석하는 프로토콜이 제시됩니다.

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

세포막은 내장 된 단백질과 당의 존재로 인해 매우 혼잡합니다. 우리는 합성 밀집된 지지 지질 이중층에 대한 단일 분자 이미징을 시연합니다. 이 플랫폼은 분자 수준에서 막 생체 분자 반응에 대한 군집의 영향을 조사하는 데 유용합니다.이 프로토콜은 막 생체 분자의 결합, 확산 및 조립 분석을 설명합니다. 실험의 성공 여부는 기판의 엄격한 세척, 이중층 손상 방지, 단일 분자 이미징에서 높은 신호 대 잡음비 유지에 달려 있습니다. 저와 함께 절차를 시연하는 것은 Aditya Upasani와 Vishwesh Haricharan Rai, 실험실의 대학원생입니다.플라즈마 처리된 아크릴 슬라이드를 깨끗한 티슈 페이퍼에 올려 놓는 것으로 시작합니다. 양면 레이저 절단 테이프를 벗겨 슬라이드에 붙입니다. 피펫 팁을 사용하여 테이프를 평평하게 하여 한 채널에서 다른 채널로 누출되지 않도록 합니다.플라즈마 처리된 커버 슬립을 테이프로 붙인 슬라이드에 놓아 챔버를 닫습니다. 피펫 팁을 사용하여 테이프 영역의 커버 슬립을 부드럽게 눌러 채널을 방수 처리합니다. 유리 슬라이드를 사용하는 경우 에폭시 수지를 사용하여 가장자리를 밀봉하십시오.준비된 미세유체 이미징 챔버를 건조된 조건에서 1-2주 동안 보관하십시오. 피라냐 용액을 사용하여 미리 세척 한 유리 바이알을 가져 와서 버퍼를 첨가 한 후 PEG 2000 지질의 원하는 몰 분율에서 POPC 및 DOPE-PEG (2000)의 클로로포름 용액을 첨가하여 최종 지질 농도 3 밀리몰을 얻습니다. 유사하게 지질의 다른 막 조성물이 제조될 수 있다.다음으로, 원하는 지질이 바이알 표면에 균일하게 코팅되도록 작은 소용돌이가있는 부드러운 질소 스트림을 사용하여 바이알에서 클로로포름을 건조시킵니다. 바이알을 진공 데시케이터에 1시간 동안 보관하여 잔류 클로로포름을 제거합니다. 그런 다음 1 밀리리터의 PBS를 바이알에 넣고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.밤새 배양 한 후 용액이 탁하고 유백색이 될 때까지 1-2 분 동안 바이알을 부드럽게 휘젓습니다. 이제 100 마이크로 리터의이 용액을 작은 500 마이크로 리터 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 50 내지 100 나노미터 직경의 작은 단층 소포를 생성하려면 배스 초음파 처리기에서 약 1시간 동안 용액을 초음파 처리한다.초음파 처리가 끝나면 용액이 명확 해지고 용액이 여전히 혼탁 한 경우 추가 30 분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 지질 용액에서

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 지질 이중층으로 코팅된 미세구에서 셉틴 단백질 어셈블리를 연구하는 기술을 설명합니다. 이 기술은 곡면에 있는 단백질의 곡률 의존적 어셈블리를 이해하는 데 도움이 됩니다.

Spherical Supported Lipid Bilayer Assay: 마이크로스피어에서 Septin 어셈블리를 관찰하는 기술

우리는 보유, 수송 지질 이중층 형성 시스템을 보여준다. 냉동 막 전구체는 상온 상태로 전환하면 지질 이중층 막을 80 % 성공률 1 시간 내에 형성 될 수있다. 이 시스템은 이온 채널과 관련된 힘드는 과정과 전문​​ 지식을 줄일 수 있습니다.

폴리 디메틸 실록산 박막을 사용하여 자동화 지질 이중층 제막

합성 및 단일 분자 수준에서 순환 고분자의 확산 움직임의 특성에 대한 프로토콜이 제공됩니다.

단일 분자 수준에서 순환 고분자의 합성 및 용융 상태에서 그들의 확산 운동의 특성

우리는 유체 지질 이중층에 둘러싸여 나노 단백질 패치 유리를 기능화하는 프로토콜을 제시한다. 이 기판은 첨단 광학 현미경과 호환 및 세포 부착 및 이동 연구를위한 플랫폼 역할을 할 것으로 예상된다.

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

미토콘드리아 융합은 미토콘드리아 역학의 근본적인 중요한 정동성 반응입니다. 여기에 설명된 시험관 내 재통합 시스템은 막 테더링, 도킹, 혈전 및 모공 개방을 해결할 수 있는 미토콘드리아 내막 융합을 연구한다. 세포막 시스템을 탐구하는 이 접근의 다양성은 토론됩니다.

미토콘드리아 멤브레인 역학 을 재구성하기위한 모델 멤브레인 플랫폼

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

이 프로토콜은 형광 현미경을 사용하여 재구성된 막 연결 세포골격 네트워크의 역학을 연구하기 위해 지지된 지질 이중층의 형성과 세포골격 필라멘트 및 운동 단백질의 추가를 설명합니다.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

무세포 재구성은 세포 골격 어셈블리를 이해하는 핵심 도구였으며, 지난 십 년 동안의 연구는 최소한의 시스템에서 셉틴 역학을 연구하는 접근법을 확립했습니다. 여기에 제시된 것은 서로 다른 막 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 보완적인 방법입니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대.

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TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

본 프로토콜은 생체적합성 리포솜을 생성하기 위한 미세유체 기술인 옥탄올 보조 리포솜 어셈블리(OLA)를 설명합니다. OLA는 효율적인 캡슐화를 통해 단분산 미크론 크기의 리포솜을 생산하여 즉각적인 온칩 실험이 가능합니다. 이 프로토콜은 합성 생물학 및 합성 세포 연구에 특히 적합할 것으로 예상됩니다.

생명공학을 위한 온칩 옥탄올 보조 리포솜 어셈블리

배우세요 smTIRF 현미경을 이용한 밀집된 지질 이중막에서 단일 분자 결합, 확산 및 조립 분석 방법을. 이 프로토콜은 막 생물물리학 연구에 필수적인 고밀도 환경에서 생체분자 거동을 정밀하게 관찰할 수 있게 합니다.

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

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