등온 적정 열량계를 사용하여 DNA 압타머와 테트라사이클린의 열역학적 및 동역학적 연관성 결정

이 프로토콜을 통해 연구자들은 용액에서 자유로운 표적에 대한 압타머의 결합 친화도를 결정하는 동시에 결합 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. ITC는 결합으로 인한 열 변화를 측정하기 때문에 SPR과 같은 기술의 경우처럼 압타머나 리간드를 표지하거나 기능화할 필요가 없습니다. 새 사용자는 모든 바인딩 구성 요소에서 일치하는 버퍼에 세심한 주의를 기울여야 합니다.

또한 이 기술에는 단백질과 같은 더 큰 리간드에 대해 충족하기 어려울 수 있는 높은 샘플 요구 사항이 있습니다. 시작하려면 투석 컬럼의 막을 활성화하고 PBS 버퍼로 채우고 실온에서 10 분 동안 평형을 이루고 5, 000 배 G에서 15 분 동안 원심 분리합니다. 완충액을 제거하고 500마이크로리터의 앱타머 샘플을 컬럼에 로드합니다.

5, 000배 G에서 원심분리하고 4회 반복하여 원래의 완충액을 PBS로 교환한다. 피펫을 사용하여 투석된 DNA 앱타머를 수집하고 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 테트라 사이클린을 용해시키기 위해 마지막 유동 완충액을 수집하십시오.

주사기의 실험용 버퍼가 기준 셀의 버퍼와 일치하는지 확인합니다. UV 가시광선 분광기를 사용하여 압타머 농도를 다시 결정합니다. 마지막 교환 완충액을 사용하여 농도를 40 마이크로 몰 테트라 사이클린 및 2 마이크로 몰 압타머로 조정합니다.

DNA 압타머를 접어서 섭씨 90도에서 10분간 가열하고 섭씨 4도에서 10분간 냉각한 다음 다시 실온으로 20분간 가열한다. 폴딩된 압타머를 탈기하고 투석된 테트라사이클린을 탈기소 스테이션 또는 진공 펌프를 사용하여 25분 동안 용해된 가스를 제거하였다. 기계를 청소하고 청결도를 확인한 후 기본 프로그램을 사용하고 제조업체의 지침에 따라 EDTA 및 염화칼슘이 포함 된 표준 키트로 기계의 정확도를 테스트하십시오.

실행 중인 매개 변수를 설정합니다. 실행중인 프로그램 계산기를 사용하여 필요한 볼륨을 확인하십시오. 이 실행 파라미터를 사용하여 ITC 주사기에 230 마이크로 리터의 40 마이크로 몰 테트라 사이클린과 ITC를 사용하여 ITC 샘플 셀에서 485 마이크로 리터의 2 마이크로 몰 압타머로 ITC 측정을 수행합니다.

투석된 테트라사이클린 주사기 플레이트와 접힌 압타머를 피펫을 사용하여 기포를 피하면서 샘플 셀에 넣습니다. 소프트웨어에서 시작 버튼을 클릭하여 ITC 기기 실행을 시작합니다. 두 번 클릭하여 데이터 분석 소프트웨어를 열어 데이터 분석을 시작합니다.

저장된 원시 데이터의 경로를 열어 바인딩 경향을 파악합니다. 모델링 탭을 열고 다양한 바인딩 모델을 사용하여 데이터 곡선에 가장 적합한 모델을 찾습니다. 그런 다음 소프트웨어는 ITC 서모그램과 엔탈피, 엔트로피, 자유 에너지, 평형 결합 상수 및 화학량론을 포함한 다양한 열역학 파라미터를 자동으로 계산합니다.

데이터 및 피팅 모델 정보에서 결정된 열역학적 파라미터를 수집합니다. ITC 서모그램 사진과 다양한 열역학적 파라미터가 포함된 보고서를 작성합니다. Kim 등이 선택한 압타머는 결합 친화도가 13 마이크로 몰이고 분리 상수 2가 53 나노 몰과 같은 테트라 사이클린에 결합합니다.

ITC의 피팅 모델과 화학량론은 압타머가 순차 결합 모델과 2:1 결합비를 통해 테트라사이클린에 결합한다는 것을 반영합니다. 사이트 2에 대한 ITC 측정에 의해 결정된 열역학적 매개 변수는 상대적으로 중요한 엔트로피 손실을 극복하는 엔탈피가 강한 결합을 유도한다는 것을 나타냅니다. 엔트로피 손실과의 엔탈피 구동 결합은 RNA와 소분자 사이의 결합 거동으로보고되는 핵산 구조적 변화와 관련이 있습니다.

압타머와 리간드는 동일한 완충액에 있어야 합니다. 압타머는 리폴딩으로 개발된 경우 리폴딩해야 하며 샘플은 탈기되어야 합니다. 이러한 고려 사항을 해결하면 압타머-리간드 상호 작용만 측정된 신호에 기여할 수 있습니다.

압타머 표적의 크기 때문에, 적절한 후속 방법은 용액에서 측정된 결합 친화도가 없음을 확인하기 위한 마이크로스케일 열영동일 수 있다.