Name: 등온 적정 열량계를 사용하여 DNA 압타머와 테트라사이클린의 열역학적 및 동역학적 연관성 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: 배우세요 등온 적정 열량계(ITC)를 사용하여 DNA 압타머와 테트라사이클린의 열역학적 및 동역학적 결합 특성을 분석하는 방법을. 이 기법은 표지 없이 결합 친화도를 정량화하여 약물 개발 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 Aptagen LLC의 연구 개발 자금으로 지원되었습니다.

참고: 그림 2 는 DNA 앱타머와 테트라사이클린의 열역학적 및 동역학적 연관성을 결정하기 위한 ITC 실험의 주요 단계를 보여줍니다.
1. 시료 준비
참고: ITC용 샘플은 샘플 셀과 주사기의 다른 버퍼를 혼합하여 발생하는 열 방출을 방지하기 위해 압타머와 리간드 모두에 대해 동일한 버퍼에서 준비해야 합니다. 이는 일반적으로 모든 물질을 동일한 완충액으로 투석하여 달성됩니다. 버퍼는 아래와 같이 일부 수정 된 3kDa 분자량 컷오프 (MWC) 농축기의 프로토콜에서 채택 된 프로토콜을 사용하여 교환됩니다.
<ol><li>다음 단계를 사용하여 제조업체에서 구입한 1x PBS, pH 7.4로 투석 컬럼(3kDa MWC)의 멤브레인을 활성화합니다: 1x 버퍼(PBS)로 채우고, RT에서 10분 동안 평형화하고, 5,000 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>완충액을 제거하고 500μL의 압타머 샘플을 컬럼에 넣고 5,000 x g에서 원심분리한 다음 4x 반복하여 원래 완충액을 1x PBS로 교환합니다. 완충액이 막을 통과하면 질량이 3kDa 미만인 모든 분자가 막을 통과하고 압타머는 막의 윗면에 남습니다.</li>
	<li>피펫을 사용하여 투석된 DNA 압타머를 수집하고 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>테트라 사이클린을 용해시키기 위해 마지막 플로우 스루 버퍼를 수집하십시오. 테트라 사이클린 분말은 순수하고 작기 때문에 투석이 필요하지 않습니다. 그러나 주사기에서 실험용 버퍼가 기준 셀의 버퍼와 일치하는지 확인하기 위해 대상에 대한 DNA에 대해 이전에 투석된 버퍼를 사용합니다.</li>
	<li>UV 가시광선 분광기를 사용하여 압타머 농도를 다시 결정합니다. 마지막 교환 완충액을 사용하여 농도를 40μM 테트라사이클린 및 2μM 압타머로 조정합니다.</li>
	<li>DNA 압타머를 90°C에서 10분 동안 가열하고, 4°C에서 10분 동안 냉각한 다음, 20분 동안 RT로 복귀하여 접습니다.</li>
	<li>탈기된 압타머를 탈기하고 투석된 테트라사이클린을 25°C에서 25분 동안 600 mmHg로 설정된 탈기소 스테이션 또는 진공 펌프를 사용하여 용해된 가스를 제거하였다.</li>
</ol>2. 기기 세척 및 테스트 키트 실행
<ol><li>용매 포트를 청소하여 전체 샘플 경로가 깨끗한지 확인합니다. 폐액을 버리고 순수한 메탄올, 물 및 완충액을 채워 청소하십시오. 각 포트에는 세척을 위한 충분한 용액을 보장하기 위해 250mL 이상이 들어 있습니다. 알림: 청소 프로세스는 사용자가 프로그래밍 할 수있는 ITC 제어 소프트웨어에 의해 자동으로 완료됩니다.</li>
	<li>버퍼를 버퍼로 사용하여 ITC를 실행하여 기계의 청결도를 테스트합니다(즉, 1x PBS를 1x PBS로). 참고: 버퍼 주입 피크에 대한 작은 버퍼 사이에서 정상적인 노이즈 기준선이 표시됩니다. 적정 주사기와 캐뉼러가 적절하게 세척되고 완전히 건조되면 기준선이 안정적입니다. 기준선의 증가 또는 감소는 기기 내부의 더러운 기기 또는 기포를 반영하므로 실제 샘플을 실행하기 전에 수정해야 합니다.</li>
	<li>EDTA 및 CaCl2 (그림 3)가 포함된 표준 키트로 기본 프로그램을 사용하고 제조업체의 지침에 따라 기계의 정확도를 테스트합니다.</li>
</ol>3. 압타머와 테트라사이클린 사이의 결합을 결정하기 위해 샘플 실행
<ol><li>실행 매개 변수 설정 : 200 rpm의 교반 속도, 25 ° C, 2 μM 압타머 및 40 μM 테트라 사이클린에서 실행, 각각 2.0 μL로 30 회 주입, 180 초의 지연 시간.</li>
	<li>실행중인 프로그램 계산기를 사용하여 필요한 볼륨을 확인하십시오. 이 실행 파라미터를 사용하여 ITC 주사기에서 230μL의 40μM 테트라사이클린과 ITC를 사용하여 ITC 샘플 셀에서 485μL의 2μM 압타머로 ITC 측정을 수행합니다.</li>
	<li>투석된 테트라사이클린 주사기 플레이트와 접힌 압타머를 피펫을 사용하여 기포를 피하면서 샘플 셀에 넣습니다.</li>
	<li>소프트웨어의 시작 버튼을 클릭하여 ITC 기기 실행을 시작합니다. 참고: ITC 기기 실행 프로세스는 기준 셀과 적정제 샘플 플레이트를 수동으로 채운 후 완전히 자동화됩니다.</li>
</ol>4. 소프트웨어를 사용한 데이터 분석
<ol><li>두 번 클릭하여 데이터 분석 소프트웨어를 열어 데이터 분석을 시작합니다.</li>
	<li>저장된 원시 데이터의 경로를 열어 바인딩 경향을 파악합니다.</li>
	<li>모델링 탭을 열고 다른 바인딩 모델을 사용하여 데이터 곡선에 가장 적합한 모델을 찾습니다. 그런 다음 소프트웨어는 ITC 서모그램과 엔탈피(ΔH), 엔트로피(ΔS), 자유 에너지(ΔG), 평형 결합 상수(Ka) 및 화학량론을 포함한 다양한 열역학 파라미터를 자동으로 계산합니다.</li>
	<li>데이터 및 피팅 모델 정보에서 결정된 열역학적 파라미터를 수집합니다.</li>
	<li>그림 4 및 표 1과 같이 ITC 서모그램 및 다양한 열역학 파라미터 사진을 포함한 보고서를 작성합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li>
<li>Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptasensors+for+environmental+monitoring+of+contaminants+in+water+and+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Environmental+Science+%26+Health%22%5BJournal%5D)">Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil.</a> Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).</li>
<li>Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+aptamer+discovery+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of aptamer discovery and technology.</a> Nature Reviews Chemistry. 1, 0076(2017).</li>
<li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SELEX--A+%28r%29evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Engineering%22%5BJournal%5D)">SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).</li>
<li>Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+kinetics+by+isothermal+titration+calorimetry%3A+Allostery%2C+inhibition%2C+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826(2020).</li>
<li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).</li>
<li>Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+aptamers+specific+for+antibiotics+tetracyclines%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).</li>
<li>Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+aptasensor+for+tetracycline+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+and+Biosystems+Engineering%22%5BJournal%5D)">Electrochemical aptasensor for tetracycline detection.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+indirect+competitive+assay-based+aptasensor+for+highly+sensitive+detection+of+tetracycline+residue+in+honey%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey.</a> Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+colorimetric+aptasensor+using+gold+nanoparticle+for+a+highly+sensitive+and+specific+detection+of+oxytetracycline%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline.</a> Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).</li>
<li>Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+photosensitisation+processes+by+an+RNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer.</a> Scientific Reports. 7, 43272(2017).</li>
<li>Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+and+thermodynamics+of+2%27%2C5%27+RNA+intercalation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).</li>
<li>Sigurskjold, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exact+analysis+of+competition+ligand+binding+by+displacement+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).</li>
<li>Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt-mediated+two-site+ligand+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).</li>
<li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+value+of+c%3A+Can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).</li>
<li>Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+reactions+for+the+amplification+of+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

여기에 제시된 방법은 TA Instruments의 지시에 따라 수정되었으며 당사 센터에서 선택된 많은 압타머 및 표적의 결합 친화도 및 열역학을 결정하기에 충분합니다. 이 절차의 중요한 단계에는 리간드와 일치하는 표적을 갖도록 버퍼를 교환하고, 적절한 매개 변수로 샘플을 실행하고, 데이터를 분석하기 위한 적절한 결합 피팅 모델을 찾는 것이 포함됩니다. 열 방출을 지속적으로 기록하려면 버퍼의 불일치, 셀과 주사기의 더러움, 샘플 내부의 기포와 같은 모든 노이즈 열을 제거해야 합니다. 완충액 교환 단계에서는 소분자를 직접 교환하는 것이 비싸기 때문에 리간드를 용해시키기 위해 투석막 또는 스핀 컬럼에 마지막 투석 완충액 또는 유동 완충액을 사용하는 것이 좋습니다.
대부분의 다른 결합 친화도 결정 방법은 압타머와 리간드 사이의 1:1 결합 비율을 가정합니다. 그러나 결합 거동과 소분자와 압타머 사이의 크기가 크게 다르기 때문에 1:1 결합 모델이 항상 정확한<sup class="xref...

압타머는 원하는 표적 1,2에 대한 높은 결합 친화도 및 특이성을 갖는 진화 과정을 통해 선택된 ssDNA 또는 RNA 단편으로, 고급 인식 요소 또는 화학 항체 3,4,5로 작용할 수 있습니다. 따라서, 표적에 대한 압타머의 결합 친화도 및 특이성은 압타머의 선택 및 적용에 결정적인 역할을 하며, 등온 적정 열량측정법(ITC)이 이러한 특성화 목적으로 널리 사용되어 왔다. 압타머의 친화도를 측정하기 위해 ITC, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 비색 적정, 마이크로 스케일 열영동(MST) 및 바이오층 간섭계(BLI)를 포함한 많은 접근법이 사용되었습니다. 그 중 ITC는 용액 단계에서 두 분자의 열역학적 및 운동 적 결합을 결정하는 최신 기술 중 하나입니다. 이 접근법은 표지가없는 분자를 사용하여 연속 적정을 수행하고 각 적정 6,7에 의해 생성 된 결합 이벤트에 따라 시간이 지남에 따라 방출 된 열을 기록합니다. 다른 방법과 달리 ITC는 결합 친화도, 여러 결합 부위, 열역학적 및 동역학적 연관성을 제공할 수 있습니다(그림 1A). 이러한 초기 매개 변수에서 Gibbs 자유 에너지 변화와 엔트로피 변화는 다음 관계를 사용하여 결정됩니다.
ΔG = ΔH-TΔS
이는 ITC가 결합 메커니즘을 설명하기 위해 분자 상호 작용의 완전한 열역학적 프로파일을 제공한다는 것을 의미합니다(그림 1B). 압타머를 사용한 소분자의 결합 친화도를 결정하는 것은 압타머와 표적 사이의 크기가 크게 다르기 때문에 어렵습니다. 한편, ITC는 분자를 표지하고 고정화하지 않고도 민감한 측정을 제공할 수 있으며, 이는 측정 중에 압타머와 표적의 자연 구조를 유지하는 수단을 제공합니다. 언급된 특성을 통해 ITC는 압타머와 소형 표적 간의 결합 특성화를 위한 표준 방법으로 사용할 수 있습니다.
Gu 그룹에 의한 선택 후, 이 압타머는 전기화학적 압타머 기반 바이오센서, 경쟁력 있는 효소 결합 압타머 분석법 및 테트라사이클린 8,9,10의 고처리량 검출을 달성할 수 있는 마이크로타이터 플레이트를 포함한 다양한 플랫폼과 통합되었습니다. 그러나, 그 결합 특성은 적절한 플랫폼8을 선택하기에 충분히 잘 밝혀지지 않았다. ITC를 사용하여 압타머와 테트라 사이클린의 결합을 특성화 할 가치가 있습니다.

<table><tbody><tr><td>5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'Integrated</td> <td>DNA Technologies, Inc</td><td></td><td>염기서열은 ITC를 사용하여 Kd를 식별하지 못한 Gu의 연구에서 채택되었습니다(참고 문헌 8 및 9 참조)</td></tr><tr><td>Affinity ITC Auto Low Volume (190 &micro; L) 시스템 완성&ndash; Gold Cells</td><td>TA Instruments</td><td>61000.901</td><td>등온 적정 열량계</td></tr><tr><td>시스템 CaCl2</td><td>Avantor (VWR)</td><td>E506-100ML</td><td>염화칼슘 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Eppendorf 5417R은 안전성, 신뢰성, 사용 편의성 면에서 타의 추종을 불허합니다. 최대 16,400RPM까지 회전하고 최대 RCF는 최대 25,000 x g까지 회전하는 브러시리스 모터로 유지 관리가 매우 쉽습니다.</td></tr><tr><td>완전한 탈기 스테이션(110/230V)</td><td>TA Instruments</td><td>6326</td><td>이 탈기 장치는 적절한 시료 준비를 위한 독립형 교반 플랫폼, 진공 챔버, 진공 포트, 온도 제어 및 전자 타이머를 제공합니다.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>TekNova</td><td>E0375</td><td>EDTA 500 mM, pH 7.5</td></tr><tr><td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis 분광 광도계</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>UV-Vis 분광 광도계</td></tr><tr><td>Nanosep, Nanosep MF 및 NAB 원심</td> 광도계 <td>Pall Laboratory</td><td>OD030C34</td><td>3 kDa 분자량 차단 농축기</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70165</td><td>Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate 및 Potassium chloride를 포함하는 완충액 0.2 &micro를 사용하여 여과된 초순수 등급 멸균; M 필터. 121 &deg에서 오토클레이브; C 20분 이상</td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL 대형 캡 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>labForce(Thomas Scientific 브랜드)</td><td>1149K01</td><td></td></tr><tr><td>테트라사이클린, 하이드로코라이드</td><td>EMD Millipore Corperation</td><td>CAS64-75-5</td><td></td></tr></tbody></table>

등온 적정 열량계를 사용하여 dna 압타머와 테트라사이클린의 열역학적 및 동역학적 연관성 결정

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

압타머와 그 표적 사이의 결합 친화도와 거동을 결정하는 것은 적용을 위해 압타머를 선택하고 사용하는 가장 중요한 단계입니다. 압타머와 저분자 사이의 급격한 차이로 인해 과학자들은 결합 특성을 특성화하는 데 많은 노력을 기울일 필요가 있습니다. 등온 적정 열량측정법(ITC)은 이러한 목적을 위한 강력한 접근 방식입니다. ITC는 분리 상수(Kd)를 결정하는 것 이상으로 용액 단계에서 두 분자 간의 상호 작용에 대한 엔탈피 변화 및 결합 화학량론을 제공할 수 있습니다. 이 접근법은 표지가 없는 분자를 사용하여 연속 적정을 수행하고 각 적정에 의해 생성된 결합 이벤트에 따라 시간이 지남에 따라 방출되는 열을 기록하므로 공정은 거대분자와 작은 표적 간의 결합을 민감하게 측정할 수 있습니다. 본 명세서에서는 선택된 압타머와 소형 표적인 테트라사이클린의 ITC 측정의 단계별 절차를 소개합니다. 이 예는 기술의 다양성과 다른 응용 분야에 대한 잠재력을 입증합니다.

ITC는 정확한 분리 상수 (Kd), 결합 화학 양론 및 2 분자 상호 작용의 열역학적 매개 변수를 제공합니다6. 이 예에서, Kim et al.9,11에 의해 선택된 압타머는 Kd1 = 13 μM, Kd2 = 53 nM의 결합 친화도를 갖는 테트라사이클린에 결합한다. 흥미롭게도, 이러한 결합은 평형 여과법 및 63.3 nM의 보고된Kd를 사용하여 결정되었으며, 이는 유리한 결합 부위(부위 2)와 크게 다르지 않다. ITC의 피팅 모델과 화학량론은 압타머가 순차 결합 모델과 2:1 결합비를 통해 테트라사이클린에 결합한다는 것을 반영합니다(그림 4, 표 1).<...

본 프로토콜은 샘플 준비, 실행 표준 및 샘플을 포함하여 DNA 압타머와 테트라사이클린 간의 결합의 연관성 및 해리 역학을 분석하고 결과 데이터를 해석하기 위한 등온 적정 열량측정법(ITC)의 사용을 설명합니다.

등온 적정 열량계를 사용하여 DNA 압타머와 테트라사이클린의 열역학적 및 동역학적 연관성 결정

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

이 프로토콜을 통해 연구자들은 용액에서 자유로운 표적에 대한 압타머의 결합 친화도를 결정하는 동시에 결합 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. ITC는 결합으로 인한 열 변화를 측정하기 때문에 SPR과 같은 기술의 경우처럼 압타머나 리간드를 표지하거나 기능화할 필요가 없습니다. 새 사용자는 모든 바인딩 구성 요소에서 일치하는 버퍼에 세심한 주의를 기울여야 합니다.또한 이 기술에는 단백질과 같은 더 큰 리간드에 대해 충족하기 어려울 수 있는 높은 샘플 요구 사항이 있습니다. 시작하려면 투석 컬럼의 막을 활성화하고 PBS 버퍼로 채우고 실온에서 10 분 동안 평형을 이루고 5, 000 배 G에서 15 분 동안 원심 분리합니다. 완충액을 제거하고 500마이크로리터의 앱타머 샘플을 컬럼에 로드합니다.5, 000배 G에서 원심분리하고 4회 반복하여 원래의 완충액을 PBS로 교환한다. 피펫을 사용하여 투석된 DNA 앱타머를 수집하고 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 테트라 사이클린을 용해시키기 위해 마지막 유동 완충액을 수집하십시오.주사기의 실험용 버퍼가 기준 셀의 버퍼와 일치하는지 확인합니다. UV 가시광선 분광기를 사용하여 압타머 농도를 다시 결정합니다. 마지막 교환 완충액을 사용하여 농도를 40 마이크로 몰 테트라 사이클린 및 2 마이크로 몰 압타머로 조정합니다.DNA 압타머를 접어서 섭씨 90도에서 10분간 가열하고 섭씨 4도에서 10분간 냉각한 다음 다시 실온으로 20분간 가열한다. 폴딩된 압타머를 탈기하고 투석된 테트라사이클린을 탈기소 스테이션 또는 진공 펌프를 사용하여 25분 동안 용해된 가스를 제거하였다. 기계를 청소하고 청결도를 확인한 후 기본 프로그램을 사용하고 제조업체의 지침에 따라 EDTA 및 염화칼슘이 포함 된 표준 키트로 기계의 정확도를 테스트하십시오.실행 중인 매개 변수를 설정합니다. 실행중인 프로그램 계산기를 사용하여 필요한 볼륨을 확인하십시오. 이 실행 파라미터를 사용하여 ITC 주사기에 230 마이크로 리터의 40 마이크로 몰 테트라 사이클린과 ITC를 사용하여 ITC 샘플 셀에서 485 마이크로 리터의 2 마이크로 몰 압타머로 ITC 측정을 수행합니다.투석된 테트라사이클린 주사기 플레이트와 접힌 압타머를 피펫을 사용하여 기포를 피하면서 샘플 셀에 넣습니다. 소프트웨어에서 시작 버튼을 클릭하여 ITC 기기 실행을 시작합니다. 두 번 클릭하여 데이터 분석 소프트웨어를 열어 데이터 분석을 시작합니다.저장된 원시 데이터의 경로를 열어 바인딩 경향을 파악합니다. 모델링 탭을 열고 다양한 바인딩 모델을 사용하여 데이터 곡선에 가장 적합한 모델을 찾습니다. 그런 다음 소프트웨어는 ITC 서모그램과 엔탈피, 엔트로피, 자유 에너지, 평형 결합 상수 및 화학량론을 포함한 다양한 열역학 파라미터를 자동으로 계산합니다.데이터 및 피팅 모델 정보에서 결정된 열역학적 파라미터를 수집합니다. ITC 서모그램 사진과 다양한 열역학적 파라미터가 포함된 보고서를 작성합니다. Kim 등이 선택한 압타머는 결합 친화도가 13 마이크로 몰이고 분리 상수 2가 53 나노 몰과 같은 테트라 사이클린에 결합합니다.ITC의 피팅 모델과 화학량론은 압타머가 순차 결합 모델과 2:1 결합비를 통해 테트라사이클린에 결합한다는 것을 반영합니다. 사이트 2에 대한 ITC 측정에 의해 결정된 열역학적 매개 변수는 상대적으로 중요한 엔트로피 손실을 극복하는 엔탈피가 강한 결합을 유도한다는 것을 나타냅니다. 엔트로피 손실과의 엔탈피 구동 결합은 RNA와 소분자 사이의 결합 거동으로보고되는 핵산 구조적 변화와 관련이 있습니다.압타머와 리간드는 동일한 완충액에 있어야 합니다. 압타머는 리폴딩으로 개발된 경우 리폴딩해야 하며 샘플은 탈기되어야 합니다. 이러한 고려 사항을 해결하면 압타머-리간드 상호 작용만 측정된 신호에 기여할 수 있습니다.압타머 표적의 크기 때문에, 적절한 후속 방법은 용액에서 측정된 결합 친화도가 없음을 확인하기 위한 마이크로스케일 열영동일 수 있다.

determining-thermodynamic-kinetic-association-dna-aptamer

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

ITC는 호스트에 리간드의 바인딩을 연구를위한 강력한 도구입니다. 복잡한 시스템에서 그러나, 몇 가지 모델은 동일하게 데이터를 맞을 수 있습니다. 방법은 여기에 설명된 것은 복잡한 시스템에 적합한 바인딩 모델을 명료하게하다와 해당 열역학적 파라미터를 추출하는 수단을 제공합니다.

바인딩 메커니즘을 결정하기 위해 가변 농도 등온 적정의 열량의 데이터 세트를 수집

적당한 바인딩 동질성과 생물 학적 시스템에 대한 바인딩을 열역학을 모니터하는 등온 적정의 열량의 사용에 대한 일반적인 프로토콜이 제공됩니다.

Macromolecule - 리간드 친화력을 측정하기위한 등온 적정의 열량

이 비디오는 전사 인자와 DNA 간의 상호 작용을 모니터링하는 데 도움이 되는 고성능 형광 이방성에 대해 설명합니다. 이 분석은 형광단으로 표지된 DNA의 분자 회전 또는 이방성으로 인한 편광 정도를 측정하여 형광단으로 표지된 DNA 분자와 특정 전사 인자의 상호 작용을 모니터링합니다.

Transcription Factor-DNA Binding Affinity를 결정하기 위한 형광 이방성

이 비디오는 생체 분자와 리간드 사이의 상호 작용을 연구하는 기술인 시차 주사 열량계를 보여줍니다. DNA 압타머와 열불안정 리간드의 결합은 샘플에 반복적인 가열 및 냉각 주기를 적용하고 열역학 분석을 위한 스캔을 얻어 연구합니다.

DNA Aptamer-Thermolabile Ligand 상호 작용을 연구하기 위한 시차 주사 열량계

등온 적정 열량 측정 열 흐름이 방출 또는 화학 반응에 흡수. 이 방법은 효소 - 촉매 반응을 정량화하는데 사용될 수있다. 본 논문에서는 악기 설정을위한 프로토콜, 실험 실행 및 데이터 분석은 일반적으로 기술되고, 잭 콩 요소 분해 효소에 의해 가수 분해 효소 요소의 특성에 적용.

핫 생물 촉매 : 등온 적정 열량 효소 반응의 특성을

시차 주사 형광 측정법은 단백질과의 상호 작용을 위해 작은 분자의 라이브러리를 스크리닝하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 여기에서는 이러한 분석을 확장하여 작은 분자와 단백질 파트너 사이의 해리 상수를 추정하는 간단한 방법을 제시합니다.

시차 주사 Fluorimetry를 사용하여 단백질 - 리간드 상호 작용의 결정

MicroScale Thermophoresis(MST)는 압타머-표적 상호 작용을 특성화하는 민감한 기술입니다. 이 원고는 압타머-소분자 상호작용을 특성화하기 위한 MST 프로토콜을 설명합니다.

마이크로 열 영동을 사용하여 ATP에 앱 타머의 결합 부위를 매핑

여기 우리는 큰 규모에 높은 감도 가진 평형에서 및 솔루션에서 바인딩 선호도 결정 하기 위한 새로운 방법을 제시. 이 녹음 방송 요인 DNA 바인딩의 정량 분석을 향상 시킵니다. 메서드를 사용 하면 제어 전달 시스템에 자동화 된 형광 이방성 측정을 기반으로 합니다.

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

효소 활동의 열 안정성은 쉽게 등온선 적정 열 량 (ITC)에 의해 측정 됩니다. 대부분 단백질 안정성 분석 실험은 현재 측정 단백질 전개, 사용 하지만 효소 활동에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. ITC의 효소 활동의 안정성에 효소 수정 효과의 직접 측정을 수 있습니다.

등온선 적정 열 량 효소 안정성 측정

현재 프로토콜은 표적을 검출하기 위해 빠른 3단계 압타머 기반 지수 증폭 분석의 사용을 보여줍니다. 샘플 준비, 신호 증폭 및 색상 현상은 카페인보다 테오필린의 존재를 인식하기 위해 이 시스템을 구현하기 위해 다룹니다.

3단계 G-Quadruplex 등온 지수 증폭 반응에 의해 촉진되는 Aptamer 기반 표적 검출

이 프로토콜은 플루오로 생성 RNA 압타머 시금치2 및 브로콜리의 동역학을 결정하는 두 가지 방법을 제시합니다. 첫 번째 방법은 플레이트 리더로 시험관 내에서 형광 발생 압타머 역학을 측정하는 방법을 설명하는 반면, 두 번째 방법은 유세포 분석에 의한 세포의 형광 발생 압타머 역학 측정을 자세히 설명합니다.

플루오로겐 RNA 압타머에 대한 시험관 내 및 세포 턴온 역학 결정

배우세요 등온 적정 열량계(ITC)를 사용하여 DNA 압타머와 테트라사이클린의 열역학적 및 동역학적 결합 특성을 분석하는 방법을. 이 기법은 표지 없이 결합 친화도를 정량화하여 약물 개발 연구에 활용됩니다.

등온 적정 열량계를 사용하여 DNA 압타머와 테트라사이클린의 열역학적 및 동역학적 연관성 결정

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